Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV DNA bằng kỹ thuật real time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Hoàng Xuân Sử TS Mai Thị Đàm Linh Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn tơi xin trân trọng gửi tới TS Hồng Xuân Sử, người thầy truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học tận tình giúp đỡ, giảng giải hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn TS Đinh Thị Thu Hằng cán nhân viên phịng thí nghiệm “Vi sinh Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy, cô môn Vi sinh vật thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tơi q trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, 18 tháng năm 2020 Học viên Lê Thị Bảo Quyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa Axit amin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Bp Base pair BKV BK virus BKVN BK virus nephropathy CMV Cytomegalo virus Ct Cycle Threshold DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme - Linked - immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme) Etbr Ethidium Bromide EBV Epstein-Barr Virus HBV Hepatitis B virus HSV Herpes Simplex Herpes INF Intravenous Nutritional Fluid F/R Forward/ Reverase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IVD In vitro diagnostic JCV JC virus Kb Kilobase pairs LB Luria-Bertani NPV Negative predictive value PCR Polymerase Chain Reaction TNF Tumor Necrosis Factors PPV Positive predictive value RCF Relative centrifugal force RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic Rpm Revolutions per minute SOC Super Optimal broth Catabolite repression (Môi trường dinh dưỡng tối ưu) TBE Tris-boric-EDTA UV Ultra violet (Tử ngoại) DANH MỤC BẢNG Bảng Các kit tách chiết, hóa chất sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu .31 Bảng Thành phần điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1 35 Bảng Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm 42 Bảng Thành phần phản ứng real-time PCR 51 Bảng Đánh giá độ đặc hiệu .52 Bảng 3 Khảo sát độ nhạy kỹ thuật real-time PCR mẫu bệnh phẩm .56 Bảng Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl 58 Bảng Tỷ lệ nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận .61 Bảng So sánh ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng .65 Bảng Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng bệnh nhân ghép thận 66 Bảng Sự phân bố phân nhóm BKV 69 Bảng Vị trí SNP khác kiểu gen BKV-I BKV-IV 70 Bảng 10 Xác định vị trí SNP BKV-I vùng gen VP1 (1630-1956) .71 Bảng 11 Đa dạng SNP kiểu gen BKV-IV 72 Bảng 12 Trình tự axit amin vị trí SNP phân nhóm IV 73 Bảng 13 So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu .74 Bảng 14 Sự phân bố kiểu gen BKV theo số lâm sàng .77 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Cấu trúc virion BKV Hình Quá trình xâm nhiễm nhân lên BKV .9 Hình Các tế bào decoy nước tiểu 17 Hình Vector pGEM T easy .29 Hình Khuếch đại đoạn chèn cho tách dịng .45 Hình Kết sàng lọc plasmid tái tổ hợp mơi trường .46 Hình 3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme AvaII 47 Hình Kết so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự Ngân hàng gen Quốc tế phần mềm Blast 48 Hình Kiểm tra lại trình tự mồi probe cho real-time PCR .49 Hình Tối ưu nồng độ probe .50 Hình Tối ưu nồng độ mồi 50 Hình So sánh tương quan mẫu chuẩn WHO LDA .53 Hình Xác định khoảng định lượng mẫu chuẩn 56 Hình 10 Ngưỡng phát BKV-DNA mẫu bệnh phẩm .57 Hình 11 So sánh tương quan hai kit 58 Hình 12 Phân tích khác biệt hai kit 59 Hình 13 Đường cong ROC BKV-DNA máu nhằm phát BKVN 63 Hình 14 Đường cong ROC BKV-DNA nước tiểu nhằm phát BKVN63 Hình 15 Cây phát sinh lồi vùng gen VP1-BKV (1630-1956) .68 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học 1.2 Tổng quan BKV 1.2.1 Lịch sử phát BKV 1.2.2 Đặc điểm sinh học 1.3 Mối quan hệ BKV bệnh lý ghép thận 11 1.3.1 Mối tương quan nồng độ BKV-DNA bệnh lý ghép thận 11 1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV bệnh lý ghép thận 13 1.4 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV 16 1.4.1 Tế bào học 16 1.4.2 Sinh thiết thận 17 1.4.3 Chẩn đoán sinh học phân tử 17 1.5 Tình hình nghiên cứu BKV 19 1.5.1 Tình hình nghiên cứu phát triển kit 19 1.5.2 Tình hình nghiên cứu trạng nhiễm BKV 21 1.6 Phương pháp xây dựng chủng loại phát sinh 22 1.6.1 Định nghĩa 22 1.6.2 Đặc điểm phương pháp xây dựng chủng loại 23 1.6.3 Ứng dụng chủng loại phát sinh xác định genotype BKV 25 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên liệu 27 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 27 2.1.2 Các vật liệu 27 2.1.3 Hóa chất 29 2.2 Thiết bị 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR 34 2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV bệnh nhân ghép thận 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA real-time PCR 45 3.1.1 Tách dòng vùng gen VP1 45 3.1.2 Thiết lập mẫu chuẩn 48 3.1.3 Thiết kế mồi probe cho real-time PCR 49 3.1.4 Tối ưu kỹ thuật real-time PCR 49 3.1.5 Đánh giá kỹ thuật real-time PCR 52 3.1.6 Quy trình xác định tải lượng virus BK máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận 60 3.2 Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận BKV 61 3.2.1 Xác định tỷ lệ lưu hành BKV bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real-time PCR61 3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN 62 3.2.3 Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng 66 3.3 Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV 67 3.3.1 Xác định kiểu gen BKV lưu hành Việt Nam 67 3.3.2 Phân tích vị trí SNP-BKV vùng gen VP1 bệnh nhân ghép thận70 3.3.3 Đánh giá vai trò kiểu gen BKV với bệnh thận BKV 77 KẾT LUẬN 79 KIẾN NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 MỞ ĐẦU Ghép thận phương pháp điều trị thay hiệu cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong không điều trị khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận năm Cho đến nhiều sở y tế nước triển khai thành công kỹ thuật này, góp phần nâng cao chất lượng sống hiệu kinh tế cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Với đời loại thuốc ức chế miễn dịch hệ kèm theo tái hoạt động mạnh BK virus (BKV) khẳng định nguyên nhân quan trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức thận ghép, chí mơ ghép bệnh nhân sau ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi người nhận thận ghép cho thấy xuất sớm BKV máu nước tiểu, chí đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao xảy khoảng từ 1-3 tháng sau ghép Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận BKV) ước tính khoảng 110% năm đầu sau ghép thận, 50% trường hợp BKVN bị thải ghép hồn tồn [8] Hiện nay, vấn đề theo dõi giám sát nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận nước ta chưa nhận quan tâm mức sở y tế có khả thực ghép thận Chẩn đốn BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn biểu lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, dễ bỏ sót chẩn đốn nhầm với giai đoạn thải ghép cấp Sinh thiết thận coi tiêu chuẩn vàng xác định BKVN, lại phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng đào tạo chuyên sâu Trong đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR máu bệnh nhân ghép thận công nhận cơng cụ có giá trị tiên đốn BKVN [8] Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử BKV công bố Việt Nam Một số sở y tế sử dụng kit thương mại Realstar BKV PCR Kit (Altona ... SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUY? ?N XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV- DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL- TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN Chuyên ngành Vi... 33 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV- DNA kỹ thuật real- time PCR 34 2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV bệnh nhân ghép thận 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... BK virus máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real- time PCR Xác định tỷ lệ lưu hành kiểu gen BKV, kết hợp phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV bệnh nhân ghép thận Việt Nam Chương TỔNG