Đang tải... (xem toàn văn)
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC 🙢✵🙠 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME BÀI KHẢO SÁT LIPID GVHD: TS Phạm Phước Điền Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021 Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh BÀI KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME I LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA α-AMYLASE MẦM LÚA Ly trích Khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm Nghiền nhuyễn cối sứ với 50ml nước cất để hòa tan enzyme Thu dịch lọc có chứa amylase Lọc dịch giấy lọc Khảo sát hoạt tính tương đối α-amylase mầm lúa 2.1 Tiến hành thí nghiệm kết Chuẩn bị ống nghiệm bảng Ổn định nhiệt độ bể điều nhiệt 50oC, sau cho ống nghiệm từ đến vào ổn định phút Sau kết thúc thí nghiệm ống nghiệm 1, lấy khỏi bể điều nhiệt đưa ống vào Làm tương tự với ống nghiệm từ đến Hút 1,6ml dịch enzyme ly trích cho vào ống nghiệm 1, đồng thời ghi nhận thời điểm Dùng pipet loại ml khuấy nhẹ dung dịch lấy giọt để thử màu với iod Khi màu dung dịch iod khơng thay đổi thủy phân tinh bột coi kết thúc Ghi lại thời điểm kết thúc Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Kết lần đo ghi bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch 1 1 1 1 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2 2 2 cho vào Hồ tinh bột 1% (ml) Nước cất (ml) Dung dịch đệm pH (ml) Để ổn định 50oC Thể tích dịch enzyme (ml) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Thời gian kết thúc thủy phân (s) 250 197 145 66 42 36 42 56 Thời gian kết thúc thủy phân (s) 300 Hoạt tính tương đối enzyme amylase 250 200 150 100 50 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 Thể tích enzyme (ml) 2.2 Nhận xét Nhìn vào đồ thị ta thấy rằng: Dịch chiết enzyme amylase thu thường có họat tính xúc tác ổn định, hoạt tính thay đổi tùy theo điều kiện thí nghiệm yếu tố mơi trường Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Hoạt tính enzyme amylase ổn định thể tích V = 1ml Khi tăng dần thể tích dịch enzyme 1ml (hay nồng độ enzyme tăng dần) thời gian kết thúc thủy phân tăng dần (hay tốc độ thủy phân giảm dần) Khi giảm dần thể tích enzyme 1ml thời gian kết thúc thủy phân tăng chậm Từ cho thấy nồng độ enzyme cao q thấp dẫn đến giảm hoạt tính xúc tác enzyme 2.3 Hiện tượng Những giọt đầu tác dụng với iod cho màu xanh đen, giọt sau tác dụng với iod cho màu tím đến tím đỏ cuối khơng màu 2.4 Giải thích Ban đầu, cho enzyme vào, tinh bột ống nghiệm chưa kịp bị thủy phân, nên tác dụng với iod cho màu xanh đen tinh bột chưa thủy phân tác dụng với iod Sau đó, enzyme xúc tác thúc đẩy nhanh q trình thuỷ phân tinh bột tạo thành amylodextrin (cho màu tím với iod), tiếp tục thuỷ phân tạo thành erythrodextrin (cho màu tím đỏ với iod), tiếp tục tạo thành acrodextrin (khơng kết hợp với iod nên không cho màu) tiếp tục tạo thành maltodextrin (không kết hợp với iod) cuối tạo thành maltose glucose (không kết hợp với iod) Trong hồ tinh bột nhiệt độ thường, phân tử tinh bột sản phẩm thủy phân dextrin tồn dạng chuỗi xoắn; phân tử glucose lập thành bước xoắn hấp phụ phân tử iod làm cho dung dịch có màu Màu thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc phân tử tinh bột (tỉ lệ amylose/amylopectin) chiều dài phân tử Amylose cho màu xanh dương đậm với iod amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod II KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN TỐC ĐỘ THỦY GIẢI CỦA AMYLASE Tiến hành thí nghiệm kết Chuẩn bị thí nghiệm theo bảng dưới, tiến hành tương tự thí nghiệm đầu Kết lần đo ghi bảng sau: Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Ống nghiệm 7 Hồ tinh bột 1% (ml) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Nước cất (ml) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 166 131 92 Dung dịch cho vào Nồng độ tinh bột tương ứng (mg/ml) Dung dịch đệm pH (ml) ml Để ổn định 50oC Thể tích enzyme (ml) ml Thời gian kết thúc thủy phân (s) 241 222 216 201 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT ĐẾN TỐC ĐỘ THỦY PHÂN CỦA AMYLASE Thời gian kết thúc thủy phân (s) 300 250 241 222 216 201 200 166 150 131 92 100 50 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 1,6 Hồ tinh bột 1% (ml) Nhận xét Khi tăng nồng độ chất, thời gian kết thúc thủy phân giảm dần nghĩa tốc độ phản ứng tăng dần Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Khi tăng nồng độ chất lên đến giới hạn xác định đó, tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax, tiếp tục tăng nồng độ chất lên tốc độ phản ứng không tăng tiếp tục tăng Giải thích Trong q trình tạo phức trung gian enzyme – chất, ảnh hưởng enzyme, chất hoạt hóa, cấu tạo chất bị biến đổi, phân tử chất bị phân cực, electron phân phối lại, điện tích chất thay đổi Các liên kết bên phân tử chất trở nên lỏng lẻo hơn, lượng họat hóa để vượt qua hàng rào lượng giảm, tốc độ phản ứng tăng lên Khi tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại ta tiếp tục thêm chất vào tốc độ không tăng tất trung tâm hoạt động enzyme bão hòa chất Kết luận Với lượng enzyme xác định, tăng dần lượng chất dung dịch đầu hoạt tính enzyme tăng đến lúc gia tăng nồng độ chất khơng làm tăng hoạt tính enzyme Đó tất trung tâm hoạt động enzyme bão hòa chất Tốc độ phản ứng phần lớn phản ứng biến đổi theo nồng độc chất nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng tăng nồng độ chất tương đối thấp Khi nồng độ chất lớn tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ chất có khuynh hướng đạt cực đại nồng độ enzyme có mặt định Với lượng chất xác định, nồng độ enzyme cao tốc độ phản ứng xảy nhanh Tế bào điều hồ tốc độ chuyển hố vật chất việc tăng giảm nồng độ enzyme tế bào Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh BÀI KHẢO SÁT LIPID I TÍNH HĨA TAN CỦA LIPID Tính hịa tan mỡ trung tính 1.1 Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị ống nghiệm bảng sau: Ống nghiệm Dầu thực vật giọt giọt giọt giọt Dung môi ml nước ml Ethanol ml Acetone ml Ether Hóa chất Lắc đều, so sánh kết ống nghiệm với ống nghiệm lại Đun cách thủy phút 1.2 Hiện tượng Ống 1: Dầu không tan nước, phân Ống 3, 4: Lipid tan hoàn toàn tách thành lớp khác nhau, dầu trên, dung mơi khơng có tách lớp nước Ống 1: Dầu không tan ethanol, phân tách thành lớp khác nhau, dầu dưới, ethanol lớp Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Ống nghiệm sau đun cách thủy phần lipid tan 1.3 Giải thích Ống 1: Khơng tan, dầu thực vật chất không phân cực, nước dung môi phân cực mạnh nên lipid nước không hỗn hòa vào Lớp dầu lên mặt nước tỷ trọng lipid nhỏ tỷ trọng nước Ống 2: Khơng tan, dầu thực vật chất không phân cực, ethanol dung môi phân cực nên dầu tan ethanol Lớp dầu chìm xuống đáy ống nghiệm tỷ trọng lipid lớn tỷ trọng ethanol Ống 3: Dầu thực vật tan dung mơi acetone dầu acetone chất không phân cực nên dễ dàng hòa tan vào Ống 4: Dầu thực vật tan dung mơi ether dầu ether chất không phân cực nên dầu thực vật dễ dàng tan ether Tính hịa tan Lecithin 2.1 Tiến hành thí nghiệm Dùng ml lòng đỏ trứng đánh nhuyễn cho vào ống nghiệm 25ml, thêm vào ống nghiệm 10ml cồn tuyệt đối, khuấy Đun cách thủy nhiệt độ 75- 80oC, tiếp tục khuấy 10 phút Lọc hỗn hợp qua ống nghiệm khô, dung dịch chiết tiến hành thí nghiệm sau: Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Ống nghiệm Dịch chiết ml ml Acetone ml - Nước cất - ml Dung dịch 2.2 Hiện tượng giải thích Giải thích Ống nghiệm khơng đổi màu lecithin khơng tan acetone Ống nghiệm đổi màu lecithin tan nước cất dẫn đến chuyển màu dung dịch Ống 1: Khơng đổi màu Ống 2: Có màu vàng đục nhẹ 2.3 Kết luận Do cấu tạo nên lecithin nước tạo thành dung dịch gọi dung dịch giả Nhờ đặc tính vừa kỵ nước vừa ưa nước mà phospholipid tham gia việc đảm bảo tính thấm chiều mang cấu trúc tế bào II CHỈ SỐ ACID CỦA LIPID Tiến hành thí nghiệm Cân 0,3 g chất béo cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 10 ml ethylic ether (5 ml cồn 96% ml ether), lắc cho tan chất béo Cho 2-3 giọt phenolphtalein vào chuẩn độ KOH 0,01N xuất màu hồng bền 30 giây Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Tính tốn kết Thể tích KOH 0,01N dùng là: V = 0,1 ml mKOH = 0,1 𝑥 0,01 𝑥 56 = 0,056 (g) Chỉ số acid số miligam KOH cần để trung hịa acid béo tự có 1g chất béo Chỉ số acid lipid là: A = 0,056 𝑥 1000 0,3 ≈ 187 III ĐỊNH LƯỢNG THEO PHƯƠNG PHÁP SOXLET Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mẫu để chiết rút mẫu: + Cân g lạc khô cho vào cối sứ, nghiền nhỏ, chuyển qua bao giấy, gấp miệng bao quanh cho lạc khỏi rơi vãi + Sấy lại bao đựng mẫu nhiệt độ 105oC 30 phút Lấy để nguội bình hút ẩm, cân lại bao có chứa mẫu, xác định khối lượng bao mẫu Chuẩn bị mẫu máy Soxlet: + Đặt bình đun nồi cách thủy, lắp bình chiết khớp với miệng bình đun, đặt bao đựng mẫu vào đáy bình chiết, lắp ống sinh hàn khớp với miệng bình chiết, đặt phễu thủy tinh lên miệng ống sinh hàn, lắp ống cao su theo ngun tắc bình thơng + Mở máy nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn Đổ dung môi hữu (ether) qua phễu thủy tinh, cho lượng dung môi đủ ngập phễu chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đun Chiết rút mỡ máy Soxlet: + Bật bếp cách thủy 45 – 50 oC, dung môi bắt đầu sôi mở kẹp ống cao su cho nước lạnh chạy vào hệ thống sinh hàn làm ngưng đọng dung mơi thành giọt xuống bình chiết chứa mẫu + Cẩn thận điểu chỉnh kẹp cao su cho nước từ từ chảy 10 Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh + Thời gian chiết khoảng 1,5 – giờ, sau tháo bình chiết ra, hứng vài giọt ether lam kính, hơ kính lam kính suốt chứng tỏ mỡ nguyên liệu chiết hết + Tắt bếp cách thủy, khóa máy nước, tháo ống sinh hàn, dùng đũa thủy tinh gắp gói mẫu khỏi bình chiết + Đặt đĩa petri, để nơi thống gió để dung mơi bay hết Sấy khơ gói mẫu nhiệt độ 105oC khoảng 30 phút, để nguội bình hút ẩm Cân, xác định khối lượng gói mẫu chiết rút lipid nhiệt độ khô tuyệt đối Tính tốn kết Hàm lượng lipid mẫu tính theo cơng thức sau: 𝑿𝒑 = Trong (𝒂 − 𝒃) 𝒙 𝟐𝟖, 𝟎𝟓 𝒄 X: Hàm lượng lipid có ngun liệu độ khơ tuyệt đối a (g): Khối lượng gói mẫu độ khơ tuyệt đối b (g): Khối lượng gói mẫu chiết rút độ khô tuyệt đối c (g): Khối lượng mẫu đem phân tích Theo thực nghiệm ta được: Khối lượng mẫu khô đem nghiền g Khối lượng mẫu (bao gồm giấy bọc) sau sấy lại 2,02 g Khối lượng sau chiết rút lipid (bao gồm giấy bọc) 1,50 g Suy ra: Xp = (2,02−1,50) 𝑥 28,05 = 14,586 Vậy hàm lượng lipid có g lạc khơ 14,586% 11 Email: quynhnhun521@gmail.com ... Thực tập hóa sinh BÀI KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME I LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA α-AMYLASE MẦM LÚA Ly trích Khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm Nghiền nhuyễn cối sứ với 50ml nước cất để hòa tan enzyme. .. luận Với lượng enzyme xác định, tăng dần lượng chất dung dịch đầu hoạt tính enzyme tăng đến lúc gia tăng nồng độ chất khơng làm tăng hoạt tính enzyme Đó tất trung tâm hoạt động enzyme bão hòa... quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Hoạt tính enzyme amylase ổn định thể tích V = 1ml Khi tăng dần thể tích dịch enzyme 1ml (hay nồng độ enzyme tăng dần) thời gian kết thúc thủy