BC HÓA SINH ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC 🙢✵🙠 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN GVHD: TS Phạm Phước Điền Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021 Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh BÀI ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN I PHẢN ỨNG BIURET Nguyên tắc  Phản ứng màu Biuret phản ứng dùng để nhận biết có mặt liên kết peptide cấu trúc hóa học hợp chất hữu Trong mơi trường kiềm, hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên phản ứng với ion Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide  Do protein chứa mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide) nên có phản ứng Biuret Phản ứng thường ứng dụng để xác nhận liên kết peptide định lượng protein Cách tiến hành  Ống nghiệm 1: Cho vào ống nghiệm khô tinh thể urea, đun nhẹ Lúc đầu urea nóng chảy, đến bắt đầu cứng lại ngừng đun  Ống nghiệm 2: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng 0,5ml dung dịch NaOH 10% Nhỏ tiếp giọt dung dịch CuSO4 1% Lắc Hiện tượng giải thích 3.1 Hiện tượng Ống nghiệm 1: Sau cho dung dịch Ống nghiệm 2: Sau cho dung dịch NaOH 10% CuSO4 1%, dung dịch NaOH 10% CuSO4 1%, dung dịch chuyển từ trắng sang màu đỏ tím chuyển sang màu tím xanh Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh 3.2 Giải thích  Ống 1: Khi đun chảy tinh thể urea tạo biuret, cianuric acid amoniac Trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 10%), nitrogen liên kết peptide biuret phản ứng với ion Cu2+ CuSO4, tạo phức màu đỏ tím Do số lượng liên kết peptide biuret nên ống nghiệm chuyển sang màu đỏ tím  Ống 2: Trong mơi trường kiềm, ion Cu2+ muối CuSO4 phản ứng với nitrogen liên kết peptide (-CO-NH-) protein trứng số liên kết peptide có protein trứng vơ nhiều nên tạo phức chất có màu tím xanh Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh II KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH PROTEIN BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH Nguyên tắc  Các muối kim loại kiềm ((NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl) kiềm thổ (MgSO4) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein Sau đó, loại bỏ nhanh yếu tố gây kết tủa protein trở trạng thái dung dịch keo bền  Các protein khác bị kết tủa với nồng độ muối khác Vì ứng dụng điều để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng Cách tiến hành 3ml dung dịch protein trứng + 3ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa Cho vào ống nghiệm Lắc Tủa Lọc Thu dịch lọc + từ từ (NH4)2SO4 tinh thể không tan Cho vào ống nghiệm Lắc Tủa Hiện tượng giải thích 3.1 Hiện tượng Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Ống nghiệm 1: Kết tủa thu Ống nghiệm 2: Kết tủa thu cho protein trứng tác dụng với dung dịch cho tinh thể muối (NH4)2SO4 vào dịch lọc muối trung tính (NH4)2SO4 lắc trong, lắc lên thấy rõ kết tủa li ti Nhận xét: Kết tủa globulin kết tủa albumin Đây loại protein có lịng trắng trứng Hai protein bị kết tủa cho lòng trắng trứng tác dụng với muối (NH4)2SO4 3.2 Giải thích Tại cho protein tác dụng với muối trung tính lại xuất kết tủa?  Trong protein trứng có globulin albumin, protein mang tính acid yếu Ở điều kiện bình thường, trạng thái dung dịch, phân tử protein tích điện âm, bên ngồi bao lớp áo nước với đầu (+) quay vào đầu (-) quay ra, làm protein ‘lơ lửng’ nước Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh  Khi cho muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào muối tạo ion NH4+ SO42- Các ion trung hòa tiểu phân tử protein trứng đồng thời lấy lớp áo ion âm bên → làm bất hoạt gốc ưa nước protein → làm chúng kết tụ lại với nhau, tạo thành kết tủa Tại kết tủa xuất globumin mà albumin?  Vì globumin có trọng lượng phân tử lớn lớp áo nước bên lớn so với albumin Các ion NH4+ SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin hơn, từ tạo kết tủa globumin trước albumin → lọc ta dung dịch bán bão hòa albumin  Khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào dịch lọc làm cho dung dịch lọc trạng thái bão hịa, lúc albumin có tượng kết tủa  Kết luận  Phản ứng tủa protein phương pháp muối kết thực môi trường acid yếu kiềm yếu  Vì muối kết protein khơng tính chất vật lí, hóa học sinh học đặc hiệu nên dùng phản ứng tủa thuận nghịch để chiết protein dạng tinh khiết, điều chế sản phẩm men, nội tiết tố III KẾT TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH PROTEIN KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ACID HỮU CƠ 1.1 Nguyên tắc Sử dụng acid hữu để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch protein 1.2 Cách tiến hành 1ml protein trứng + giọt + giọt TCA 10% sunfolsalisilic acid 20% Ống Ống Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh 1.3 Hiện tượng giải thích 1.3.1 Hiện tượng Ống nghiệm 2: Xuất kết tủa đục Ống nghiệm 1: Xuất tủa đục với thời gian nhanh độ đục nhiều so với ống 1.3.2 Giải thích  Khi cho acid hữu vào dung dịch protein trứng tạo nên mơi trường acid yếu, có khả gây tủa Vì sunfosalisilic acid tủa protein, polypeptide acid amin, cịn trichloracetic acid có khả tủa protein → Sunfosalisilic acid acid mạnh TCA nên ống nghiệm có thời gian kết tủa nhanh độ đục nhiều so với ống nghiệm  Lưu ý: Sau tác dụng với acid hữu cơ, protein kết tủa, biến tính khơng thể trở lại trạng thái ban đầu acid hữu tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch KẾT TỦA PROTEIN BẰNG MUỐI KIM LOẠI NẶNG 2.1 Nguyên tắc  Sử dụng ion kim loại nặng (hầu hết nằm nhóm chuyển tiếp) để tác dụng với protein gây kết tủa  Thường phản ứng xảy nhanh chóng, ứng dụng vào việc giải độc cho thể nhiễm kim loại nặng chì (Pb), thủy ngân (Hg),… Protein sữa, trứng thường dùng để giải độc Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh 2.2 Cách tiến hành Ống nghiệm Muối kim loại nặng Lần Lần Thứ tự xuất kết tủa Nhỏ giọt theo thành Cho Pb(CH3COO)2 2% lượng 1ml lòng AgNO3 2% ống, chờ đến xuất thừa để xem trắng trứng FeCl3 0,5% kết tủa tủa tan CuSO4 2% 2.3 Hiện tượng giải thích 2.3.1 Hiện tượng ống nghiệm chứa lòng trắng trứng 4 ống nghiệm sau cho muối kim loại nặng  Ống 1: Xuất kết tủa màu trắng đục, cho dư muối Pb(CH3COO)2 2% tủa tan từ từ  Ống 2: Xuất tủa màu trắng đục, cho dư muối AgNO3 2% tủa khơng tan tách lớp  Ống 3: Xuất kết tủa màu vàng nâu, cho lượng dư muối FeCl3 0,5% tủa tan nhanh  Ống 4: Xuất kết tủa màu xanh nhạt, sau cho thêm muối CuSO4 2% kết tủa tan Nhận xét: Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo phức chất không tan nước tan trở lại có lượng muối dư tương ứng (trừ AgNO3) 2.3.2 Giải thích  Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo thành kết tủa ion kim loại nặng làm lộ đầu kỵ nước protein ngồi biến tính protein sâu sắc, phá vỡ cấu trúc bậc 2, bậc protein Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh  Khi cho thêm lượng dư muối tương ứng dẫn đến dư thừa ion kim loại nặng → phân tử keo hấp thụ ion kim loại nặng bề mặt tiểu phân tử protein làm chúng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) → kết tủa bị tan Ion có hóa trị cao tủa dễ tan trở lại KẾT TỦA PROTEIN BẰNG NHIỆT 3.1 Nguyên tắc Sử dụng nhiệt độ chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua nhận thấy nhiệt độ nguyên nhân gây kết tủa 3.2 Cách tiến hành Ống nghiệm Protein CH3COOH CH3COOH 1% 10% trứng NaOH 10% NaCl bão hòa Thứ tự xuất kết tủa 3 giọt 2ml 5-8 giọt Đun sôi Không Không 5-8 giọt 5-8 giọt 5-8 giọt 3.3 Hiện tượng giải thích 3.3.1 Hiện tượng 5 ống nghiệm sau cho dung dịch đun sôi ống nghiệm chứa lòng trắng trứng  Ống 1: Xuất kết tủa màu trắng, ngừng đun khơng trở lại trạng thái ban đầu, thời gian xuất kết tủa lâu ống nghiệm Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh  Ống 2: Xuất tủa trắng đục, thời gian xuất tủa nhanh ống  Ống 4: Sau đun sôi không xuất kết tủa  Ống 5: Xuất kết tủa trắng đục, thời gian xuất sớm nhất, ngừng đun khơng thấy trở lại trạng thái ban đầu Nhận xét: Nhiệt độ tác nhân gây biến tính gây kết tủa protein Vì nhiệt độ tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên sử dụng tác nhân nên cân nhắc kỹ Để tránh làm biến tính protein thực phẩm, sử dụng biện pháp xác định nhiệt độ gây biến tính protein 3.3.2 Giải thích  Ống 1: Dưới tác động nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, liên kết thứ cấp bị phá vỡ, protein bị vón cục khơng theo quy luật tạo thành kết tủa  Ống 2: Khi cho giọt acetic acid 1% vào ống nghiệm tạo nên môi trường acid yếu Nhóm (–COO)- bị ức chế phân ly nên tiểu phân tử protein điện tích, lớp áo nước bao quanh → kết tủa pH môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện  Ống 3: Khi cho 5-8 giọt acetic acid 10% tạo nên mơi trường acid mạnh Do tính háo nước acid mơi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm (–COO)- trung hịa, cịn nhóm NH3+ khơng trung hịa Phân tử protein cịn tích điện dương, khơng tạo kết tủa 10 Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh  Ống 4: Khi thêm giọt NaOH 10% tạo mơi trường kiềm Nhóm NH3+ protein trung hịa ion OH- Vì đun sôi điện tử âm tiểu phân tử protein cịn Protein tích điện âm, khơng tạo tủa  Ống 5: Khi cho giọt acetic acid 1% giọt NaCl bão hòa tạo nên mơi trường trung hịa điện, từ tạo kết tủa 3.3.3 Kết luận  Phần lớn protein bị đông tụ đun mơi trường trung tính hay acid yếu  Trong môi trường kiềm mạnh, acid mạnh, protein cịn tích điện nên khơng tạo tủa  Protein dễ dàng tạo tủa pH môi trường đạt điểm đẳng điện  Nồng độ muối pH mơi trường đóng vai trò quan trọng tạo tủa protein IV XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN Nguyên tắc Điểm đẳng điện protein protein bị kết tủa lại Từ đó, xác định độ pH cần để gây kết tủa protein ngược lại Dựa thước đo pH xác định từ trước, việc xác định điểm đẳng điện giúp protein tránh kết tủa ngược lại Cách tiến hành Lấy ống nghiệm sạch, khô Cho vào ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 0,2M citric acid 0,1M theo bảng sau Lắc cho dung dịch albumin % vào, thêm cồn, lắc nhẹ Để yên phút ghi nhận tượng xuất Ống nghiệm EtOH (ml) Độ đục⁕ 1 3,7 1 1,04 4,7 1 0,68 5,7 1 Na2HPO4 Citric acid pH 0,2M (ml) 0,1M (ml) 0,50 1,50 3,2 0,68 1,32 0,96 1,32 1% (ml) ⁕Thang độ đục: 1-trong nhất, 4-đục Hiện tượng giải thích 3.1 Hiện tượng 11 Email: quynhnhun521@gmail.com Albumin Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh 3.2 Giải thích  Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức tổng số điện tích âm tổng số điện tích dương phân tử protein 0, lúc đó, protein dễ dàng di chuyển kết tụ lại với tạo kết tủa  Điểm đẳng điện protein gần với 4,7 pH = 4,7 mức độ kết tủa protein đạt lớn V ĐÔNG TỤ SỮA BẰNG PROTEASE Nguyên tắc Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đơng tụ thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định Cách tiến hành  Pha dung dịch sữa gầy 10% CaCl2 0,01M  Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc ly tâm thu nước dịch enzyme  Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến đạt 50oC  Cho lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 – 0,5ml), lắc Tiếp tục giữ 50oC, ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào lúc vừa xuất hạt sữa mịn nhỏ, rõ đỏ nhiệt kế (dung dịch enzyme cần chuẩn bị cho thời gian đông tụ sữa khoảng – phút) 12 Email: quynhnhun521@gmail.com Nguyễn Quỳnh Như Thực tập hóa sinh Hiện tượng giải thích Hạt sữa nhỏ li ti đỏ nhiệt kế Kết tủa trắng xuất cho dịch enzyme vào dung dịch sữa giữ 50oC Giải thích: Protease động tụ sữa dạng protease có khả cơng vào vị trí Phe(105)-Met(106) kappa-casein làm lộ đầu kỵ nước dẫn tới tượng động tụ Tính tốn Cơng thức tính: E = 𝑽𝒔ữ𝒂 (𝒎𝒍) 𝒙 𝑲 𝑻 (𝒔) 𝒙 𝑽𝒆𝒏𝒛𝒚𝒎𝒆 (𝒎𝒍) Protease lấy từ thơm chứa enzym bromelin VS = 5ml T= 11 12 phút = 55 giây VE = 0,5ml E= 𝑉𝑠ữ𝑎 𝑥 𝐾 𝑇 𝑥 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 K = 0,2 E = ? (ĐV/ml) 13 Email: quynhnhun521@gmail.com = 𝑥 0,2 55 𝑥 0,5 = 2,1818 (ĐV/ml) ... Quỳnh Như Thực tập hóa sinh BÀI ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN I PHẢN ỨNG BIURET Nguyên tắc  Phản ứng màu Biuret phản ứng dùng để nhận biết có mặt liên kết peptide cấu trúc hóa học hợp chất hữu... tủa protein IV XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN Nguyên tắc Điểm đẳng điện protein protein bị kết tủa lại Từ đó, xác định độ pH cần để gây kết tủa protein ngược lại Dựa thước đo pH xác định. .. ứng tủa protein phương pháp muối kết thực môi trường acid yếu kiềm yếu  Vì muối kết protein khơng tính chất vật lí, hóa học sinh học đặc hiệu nên dùng phản ứng tủa thuận nghịch để chiết protein