Bài 1 BC hóa sinh ĐỊNH TÍNH và KHẢO sát PROTEIN I.Phản ứng màu Biure:II.Các phản ứng kết tủa của protein1.Kết tủa protein bằng muối trung tính2.Kết tủa bằng acid hữu cơ:3.Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng:4.Kết tủa protein bằng nhiệt:5.Xác định điểm đẳng điện của protein6.Đông tụ sữa bằng proteaseKết quả tính:
Bài số: Tên bài: ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN Ngày TN: thứ ngày 09 tháng 01 năm 2017 I Phản ứng màu Biure: Nguyên tắc: - Là phản ứng đặc trưng liên kết peptide - Trong môi trường kiềm, hợp chất có từ hai liên kết peptide trở lên phả ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, đỏ hay tím đỏ - Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide - Là phản ứng dùng để định tính Protein.5 Cách tiến hành: - Điều chế biure từ ure Cho ure vào ống nghiệm 1, đun sôi, sau đông cứng tạo thành biure Cho vào ống nghiệm 1mL NaOH 10%,1 giọt CuSO4 2% - Cho vào ống nghiệm 1mL dung dich protein trứng, 1mL NaOH 10% giọt CuSO4 2% Kết quả: - Ở ống nghiệm 1: kết tủa tan tạo dung dịch suốt cho NaOH vào, sau chuyển màu tím nhạt cho CuSO4 vào - Ở ống nghiệm 2: không xảy tượng cho NaOH vào, sau chuyển màu tím đậm cho CuSO4 vào ống nghiệm ống nghiệm Bàn luận: protein trứng có mạch peptide chứa nhóm –CO-NH- (liên kết peptide) nhiều Biure (có liên kết –CO-NH-) nên màu protein trứng đậm màu biure II Các phản ứng kết tủa protein: Kết tủa protein muối trung tính: a Thực hành: 3mL dd protein trứng +3mL (NH4)2SO4 bão hòa Cho vào ống nghiệm Lắc Lọc Tủa Thu dd lọc + từ từ (NH4)2SO4 tinh thể Cho đến không tan Cho vào ống nghiệm Lắc Tủa b Kết quả: - Tủa thu Globulin Tủa Albumin c Bàn luận: - - a b - Kết tủa 1: Khi cho (NH4)2SO4 bão hòa vào muối tạo ion NH4 + SO42- Các ion trung hòa tiểu phân tử protein trứng, lúc nồng độ (NH4)2SO4 trạng thái bán bão hòa Globumin tủa trước có khối lượng phân tử lớn nên dễ kết tủa Kết tủa 2: Khi lọc, ta dung dịch albumin bán bão hòa Khi thêm (NH4)2SO4 tinh thể không tan, lúc (NH4)2SO4 trạng thái bão hòa nên làm albumin kết tủa Kết tủa acid hữu cơ: Tiến hành: lấy vào ống nghiệm, mối ống 1mL protein trứng Thêm vào: Ống nghiệm 1: giọt TCA 10% lắc nhẹ Ống nghiệm 2: giọt acid sunfosalisilic 10%, lắc nhẹ Kết quả: Ống nghiệm 1: tạo dung dịch có màu trắng đục Ống nghiệm 2: tạo dung dịch có kết tủa nhiều acid sunfosalisilic acid mạnh TCA ống nghiệm ống nghiệm c Bàn luận: Vì acid sunfosalisilic tủa protein, polypeptit acid amin, TCA có khả tủa protein Nên ống nghiệm nhiều tủa Kết tủa protein muối kim loại nặng: a Tiến hành: Lấy ống nghiệm, cho vào ống nghiệm 1mL dd protein trứng, nhỏ từ từ dung dịch sau ống nghiệm Dung dịch nhỏ vào Lần Lần Pb(CH3COO)2 2% AgNO3 2% FeCl3 0,5% CuSO4 2% Nhỏ giọt theo thành ống xuất kết tủa Cho vào lượng thừa để xem tủa tan b Kết quả: -Ống 1: tủa tan - Ống 2: tủa không tan bạc bền dung dịch - Ống 3: kết tủa Fe kim loại nặng - Ống 4: tủa tan ( Từ phải sang trái trình tự ống nghiệm 1,2,3,4) c Bàn luận: - Muối kim loại nặng gây biến đổi cấu trúc không gian protein gây tủa - Tủa tan lại hấp phụ ion kim loại nặng bề mặt tiểu phân protein làm cho protein tích điện dương Muối kim loại nặng tạo tủa làm biến tính protein phá hủy cấu trúc bậc 2, protein Kết tủa protein nhiệt: Cách tiến hành kết thu sau: Ống nghiệm Protein trứng 2mL 2mL 2mL 2mL 2mL CH3COOH 1% CH3COOH 10% NaOH 10% NaCl bão hòa Đun sôi Đun sôi Đun sôi giọt 5-8 giọt 5-8 giọt 5-8 giọt Gia nhiệt Kết Đun sôi 5-6 giọt Đun sôi kết tủa Có kết tủa Dd suốt, ko tủa Dd màu vàng Có kết tủa lớn (Từ phải sang trái ống nghiệm từ đến 5) • - Bàn luận: Ống nghiệm 1: Do protein bị biến tính cấu trúc nên tạo tủa Ống nghiệm 2: Trung hòa ít, lượng H+ nên tạo tủa Ống nghiệm 3: Lượng H+ nhiều làm cho phần tử protein tích điện dương nên kết tủa xảy Ống nghiệm 4: NaOH gây tích điện âm với protein Ống nghiệm 5: NaOH bão hòa trung hòa acid giúp hút nước trung hòa điện tích protin lên dễ dàng tủa Xác định điểm đẳng điện protein: Cách tiến hành: cho vào ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 acid citric, lắc sau thêm albumin cồn vào, tiếp tục lắc nhẹ Để yên phút Tỉ lệ kết thu bảng sau: Ống nghiệm Na2HPO4 0.2M (mL) 0.50 0.68 0.96 1.32 • Acid citric 0.1M (mL) 1.50 1.32 1.04 0.68 pH tương ứng Lượng dd Albumin 1% (mL) Rượu ethylic (mL) Kết 3,2 3,7 4,7 5,7 1 1 1 1 Hơi vẩn đục Hơi vẩn đục Hơi vẩn đục Vẩn đục nhiều Bàn luận: - ống nghiệm đục nhiều (pH tương ứng 5,7) nên điểm đẳng điện ống nghiệm có pH tương ứng 4,7 Vì điểm đẳng điện protein dễ dàng bị kết tủa thêm vào lượng nhỏ chất gây tủa (Từ phải sang trái ống nghiệm từ đến 4) Đông tụ sữa protease: a Nguyên tắc: xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định b Tiến hành: - - Giã dứa, thu dung dịch nước dứa Cho vào ống nghiệm 5mL dung dich sữa gầy, đặt vào bể điều nhiệt đến đạt 50 độ C Cho vào lượng enzym (nước dứa), lắc Tiếp tục giữ 50 độ C đến xuất hạt sữa nhỏ Thời gian tính từ lúc bắt đầu cho enzym vào c Kết đo tính toán: Thể tích dung dịch sữa :5mL Thể tích enzym: 0.1mL Thời gian đông tụ: phút 30 giây Kết tính: E= Trong đó: E: hoạt lực đông tụ sữa (ĐV/mL) Vs: thể tích dd sữa (mL) T: thời gian đông tụ sữa (phút) VE: thể tích enzym sử dụng (mL) K: độ pha loãng dung dịch enzym ... Na2HPO4 0.2M (mL) 0.50 0.68 0.96 1. 32 • Acid citric 0.1M (mL) 1. 50 1. 32 1. 04 0.68 pH tương ứng Lượng dd Albumin 1% (mL) Rượu ethylic (mL) Kết 3,2 3,7 4,7 5,7 1 1 1 1 Hơi vẩn đục Hơi vẩn đục Hơi... nghiệm 1mL NaOH 10 % ,1 giọt CuSO4 2% - Cho vào ống nghiệm 1mL dung dich protein trứng, 1mL NaOH 10 % giọt CuSO4 2% Kết quả: - Ở ống nghiệm 1: kết tủa tan tạo dung dịch suốt cho NaOH vào, sau chuyển... cơ: Tiến hành: lấy vào ống nghiệm, mối ống 1mL protein trứng Thêm vào: Ống nghiệm 1: giọt TCA 10 % lắc nhẹ Ống nghiệm 2: giọt acid sunfosalisilic 10 %, lắc nhẹ Kết quả: Ống nghiệm 1: tạo dung dịch