XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH KHẢO sát các yếu tố ẢNH HƯỞNG đến HOẠT TÍNH AMYLASE

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH KHẢO sát các yếu tố ẢNH HƯỞNG đến HOẠT TÍNH AMYLASE. Hình ảnh mô tả các thí nghiệm, Kết quả bàn luận các thí nghiệm và tính toán kết quả. Lý thuyết thí nghiệm

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài số: 9 TỂN BÀI: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH & KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH

HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE

I XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE

1 Nguyên tắc

- Enzym Amylase là enzym thủy phân tinh bột Nó phân cắt amilose và amilopectin của tinh bột thành các dextrin và các loại đường maltose, glucose…

- Phương pháp Wohgemuth dựa vào việc tìm nồng độ enzym thấp nhất để thủy phân tinh bột đến các sản phẩm không màu với Iod

- Đơn vị Wohgemuth là lượng enzym cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 370C có Cl- làm chất hóa

2 Tiến hành

-Chuẩn bị chiết Amylase

-Chuẩn bị 10 ống nghiệm

Thứ tự

ống

Độ pha

Nồng độ

enzym n/2 n/4 n/8 16n/ 32n/ 64n/ 128n/ 256n/ 512n/ 1024n/

3 Kết quả

Thứ tự

ống

Độ pha

Nồng

độ

n/

32 64n/ 128n/ 256n/ 512n/ 1024n/ Màu Vàng Vàng Vàng Vàng Đỏ xanh xanh xanh xanh xanh

(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt từ 1 đến 10)

Tính toán kết quả

-Lượng enzym cho vào ống [1]

n= m∗V1

V2 =

9,8563∗1

100 =0,0985 g Trong đó:

V1: thể tích dd amylase cho vào ống nghiệm [1] (1 mL)

V2: thể tích dd amylase tổng (100 mL)

m: lượng mẫu cân vật phẩm (malt) chứa enzym [mg] ( 9,8563 g)

-Một đơn vị Wohgemuth (W)

W = n

F∗5=

0,0985 16∗5 =0,00123 Với F là độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzym nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm đã chọn từ bảng kết quả là ống số 4 nên độ pha loãng là 16)

-Số đơn vị Wohgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzym (Nw)

N w= n

V2∗5=

0,0985 100∗5=1,97 10

−4

4 Bàn luận

- Ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất xảy ra thủy phân hoàn toàn tinh bột là ống nghiệm số 4 Vì dd chuyển từ màu vàng sang đỏ và sắp chuyển dần sang màu xanh khi gặp

I2/KI

- Vai trò của NaCl là có gốc Cl- làm chất hoạt hóa enzyme.

- Thí nghiệm dễ bị sai xót do hóa chất có thể bị hỏng hoặc trong quá trình lọc lấy enzym không lọc được dd trong mà còn cặn

II KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE

1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

a Nguyên tắc

- Nhiệt độ là tá nhân vật lý ảnh hưởng đến vận tốc hóa học cũng như phản ứng của enzym Đa số enzym có nhiệt độ tối thích (Topt) khoảng 40-500C, ở nhiệt độ này vận tốc phản ứng rất lớn, một số enzym có Topt khoảng 50-600C Khi nhiệt độ trên 800C hấu hết các enzym đều bị biến tính không thuận nghịch

b Tiến hành

STT ống

nghiệm bột 1%Tinh

STT ống nghiệ m

Dd Amyla se

Nhiệt độ cần đạt được

Thời gian ủ IDd2/KI

Giải thích hiện tượng và tìm Topt trong các nhiệt độ khảo sát

c Kết quả

- Ống 1: ở 90oC, vì nhiệt độ quá cao amylase bị biến tính không thuận nghịch nên không thể thủy phân tinh bột, màu tím là màu của Iot

- Ống 2: ở 65oC, dd có màu vàng nâu đã xảy ra phản ứng thủy phân tinh bột, tuy nhiên vẫn chưa phải là nhiệt độ tương thích

để phản ứng xảy ra hoàn toàn

- Ống 3: ở nhiệt độ phòng, dd có màu xanh tím nhạt hơn của ống 1

- Ống 4: ở 0oC dd ban đầu có màu tím đậm nhưng nhạt dần khi ở môi trường nhiệt độ phòng

(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 1234)

d Bàn luận

- Ống 2 nhiệt độ 65oC tương đối là thích hợp để phản ứng được xảy ra ổn định Đa số enzym có nhiệt độ tối thích (Topt) khoảng 50-600C

2 Ảnh hưởng của pH

a Nguyên tắc

- Hoạt tính của enzym phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường, khi giảm hay tăng pH đều dẫn đến giảm hoạt tính của

enzym, pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzym là pH tối thích (pHopt) Mỗi enzym có 1 pH tối thích, ngoài vùng pH tối thích hoạt động của enzym giảm

b Tiến hành

STT Na4 0,2M2HPO

(mL)

Acid nitric 0,1M (mL)

Lắc đều

pH đạt được

Amyla se (mL)

Tinh bột 1%

(mL)

Thời gian ủ

Dd

I2/KI

Giải thích hiện tượng và tìm pHopt trong các pH khảo sát

c Kết quả

- Ống 124 dường như không xảy ra hiện tượng vì pH không thích hợp cho hoạt động của enzyme

- Ống 3 dd nhạt hơn những ống nghiệm còn lại chính là pH tối thích (7,2) cho hoạt động của enzyme

(Từ trái qua phải số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 1234)

d Bàn luận

- Tuy nhiên, do ảnh hưởng nồng độ hoặc do enzyme hoạt động không tốt làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Chính xác hơn thì pH đạt được nằm trong khoảng từ 5,6-6,6

3 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm

a Nguyên tắc

- Chất hoạt hóa là các chất có vai trò làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym, mạnh nhất là các ion, các anion Cl-, Br-,I- làm tăng hoạt độ α amylase, các ion kim loại như Mn2+, Zn2+… lại thúc đẩy hoạt độ của protease Chất kìm hãm là chất làm giảm tốc độ phản ứng của enzym Chúng có thể là những ion, các phân tử hữu cơ, protein…

b Tiến hành

STT Nướccất

(mL)

NaCl 1%

(mL)

CuSO4

1%

(mL)

Tinh bột 1%

(mL)

Amyla se (mL)

Thời gian IDd2/KI

Giải thích hiện tượng và đánh giá ảnh hưởng của các dd muối

c Kết quả

- Ống 1: dd có màu xanh dùng làm mẫu để so sánh màu về chất hoạt hóa và chất kìm hãm

- Ống 2: dd màu xanh nhưng dạt dần do gốc Cl- làm tăng hoạt hóa của enzyme

- Ống 3: dd màu xanh đậm và đặc hơn so với ống 2 vì có ion kim loại Cu2+ kìm hãm làm giảm tốc độ phản ứng của

enzyme

(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 123)

d Bàn luận

- Anion Cl- làm tăng hoạt độ của α amylase

- Ion Cu2+ thúc đẩy hoạt độ của protease kìm hãm làm giảm tốc độ phản ứng enzyme