SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN từ NGUỒN TINH bột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ NGUỒN TINH BỘT GVHD : TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Th S TRẦN THỊ TƯỞNG AN SVTH : VÕ THỊ HUYỀN TRANG MSSV : 15070030 LỚP : 18SH01 BÌNH DƯƠNG – 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÕ THỊ HUYỀN TRANG SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ NGUỒN TINH BỘT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD : TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Th S TRẦN THỊ TƯỞNG AN BÌNH DƯƠNG – 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo thực tập này, em xin chân thành cám ơn thầy cô giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Bình Dương Em xin gởi đến TS Nguyễn Đình Quân Ths Trần Thị Tưởng An – người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành báo cáo tốt nghiệp lần lời cám ơn sâu sắc Sau em xin gởi lời cám ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người ln bên cạnh động viên tinh thần giúp em hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cám ơn Thủ Dầu Một, ngày 31 tháng 07 năm 2019 Võ Thị Huyền Trang i MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình ảnh .vii Tóm tắt luận văn ix Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cellulose vi khuẩn vi sinh vât tổng hợp cellulose 2.1.1 Sơ lược nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose vi khuẩn 2.1.4 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A xylinum 2.2 Ứng dụng BC 2.2.1 Thực phẩm 2.2.2 Y học 10 2.2.3 Sinh học 10 2.2.4 Các ngành công nghiệp khác 17 2.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất BC 12 2.3.1 Tinh bột sắn 12 2.3.2 Amylase 14 2.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 17 ii 2.4.1 Tình hình nghiên cứu BC giới 17 2.4.2 Tình hình nghiên cứu A xylinum Việt Nam 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian thực 20 3.2 Vật liệu 20 3.2.1 Đối tượng 20 3.2.2 Vật liệu .20 3.2.3 Hóa chất thiết bị 20 3.2.4 Thành phần môi trường 21 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 3.5 Phương pháp phân tích 25 3.5.1 Phương pháp vi sinh Error! Bookmark not defined 3.5.2 Phương pháp hóa lí Error! Bookmark not defined 3.6 Phương pháp thống kê xử lí số liệu 24 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu 28 4.2 Khảo sát đặc điểm giống .28 4.2.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc A xylinum 28 4.2.2 Quan sát tế bào A xylinum kính hiển vi 29 4.2.3 Nhân giống 29 4.2.4 Khảo sát đường cong sinh trưởng A xylinum môi trường nhân giống 30 iii 4.3 Khảo sát trình thủy phân tinh bột 31 4.4 Khảo sát trình lên men thu BC .34 4.4.1 Khảo sát trình lên men bổ sung chất dinh dưỡng không bổ sung SA, DAP 34 4.4.2 Khảo sát trình lên men bổ sung chất dinh dưỡng có bổ sung SA, DAP 36 4.4.3 Khảo sát lượng giống bổ sung 38 4.5 Kiểm tra cellulose mẫu BC 42 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận .43 5.2 Kiến nghị .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A xylinum Actobacter xylinum BC Bacteria cellulose DAP (NH4)2HPO4 hay Diammonium phosphate HS Môi trường HestrinTHER Schramm SA (NH4)2SO4 hay Ammonium sulfate UDP-Glucose Uridine diphosphoglucose v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc cellulose vi khuẩn Hình 2.2 Con đường tổng hợp cellulose A xylinum Hình 2.3 Thạch dừa dùng thực phẩm (a) Ứng dụng BC vật liệu làm xốp (b) Hình 2.4 Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC 10 Hình 2.5 Ứng dụng BC làm giá thể nuôi cấy cụm chồi thuốc 11 Hình 2.6 Tinh bột sắn 13 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22 Hình 4.1 Khuẩn lạc A xylinum sau 72 ni cấy 28 Hình 4.2 Tế bào A xylinum kính hiển vi 29 Hình 4.3 Ống nghiệm cấp 29 Hình 4.4 Chai giống cấp 30 Hình 4.5 Đường cong sinh trưởng A xylinum 30 Hình 4.6 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng đường khử theo tỉ lệ bổ sung enzyme 32 Hình 4.7 Ảnh hưởng tỉ lệ bổ sung enzyme đến hàm lượng đường khử theo thời gian 33 Hình 4.8 Ảnh hưởng loại môi trường không bổ sung SA, DAP đến khối lượng BC theo thời gian nuôi cấy 34 Hình 4.9 BC mơi trường bổ sung chất dinh dưỡng không bổ sung SA, DAP vào ngày 17 35 Hình 4.10 Ảnh hưởng loại mơi trường có bổ sung SA, DAP đến khối lượng BC theo thời gian nuôi cấy 36 vii Hình 4.11 BC mơi trường bổ sung chất dinh dưỡng có bổ sung SA, DAP vào ngày 17 37 Hình 4.12 Ảnh hưởng tỉ lệ giống lên tỉ lệ bổ sung 1/2 dừa theo thời gian 38 Hình 4.13 Ảnh hưởng tỉ lệ giống lên tỉ lệ bổ sung 3/4 dừa theo thời gian 38 Hình 4.14 Ảnh hưởng tỉ lệ giống lên tỉ lệ bổ sung 1/2 dứa theo thời gian 39 Hình 4.15 Ảnh hưởng tỉ lệ giống lên tỉ lệ bổ sung 3/4 dứa theo thời gian 40 Hình 4.16 Ảnh hưởng tỉ lệ giống lên môi trường tinh bột theo thời gian 40 Hình 4.17 BC môi trường tinh bột tỉ lệ giống vào ngày 17 41 Hình 4.18 XRD BC mơi trường tinh bột có bổ sung SA, DAP 42 viii Trong nước dừa có chứa nhiều carbohydrate, vitamin, acid amin, chất kích thích sinh trưởng, nước dừa mơi trường thuận lợi cho phát triển A xylinum Thành phần nước dứa tương tự nước dừa nhiều thành phần cà nước dừa Hiện nay, dứa sử dụng rộng rãi sản xuất đồ uống đóng hộp, lượng nước thu hồi từ phế phẩm dứa lớn đáp ứng nhu cầu sản xuất BC góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường Đường chuẩn glucose Để xem xét khả thủy phân tinh bột eyme amylase, dựa kết đo hàm lượng đường khử trước sau thủy phân tinh bột Hàm lượng đường khử xác định dựa vào đường chuẩn glucose Đường chuẩn xây dựng dựa phương pháp Miller Hình 1: Đường chuẩn glucose 2.1 Định lượng đường khử có mơi trường Hàm lượng đường khử có mơi trường Mơi Hệ trường số Sai số pha loãng x1 x2 x3 KL1 KL2 KL3 KLT tương B đối Bột 200 0,24 0,22 0,23 47,51 43,26 45,49 45,42 2,16 Dừa 200 0,24 0,24 0,27 48,47 47,51 54,63 50,20 4,43 Dứa 200 0,40 0,40 0,41 80,86 79,80 82,88 81,18 1,70 1/2 150 0,24 0,24 0,24 36,19 36,11 36,27 36,19 0,08 0,23 0,22 0,24 34,92 33,40 35,71 34,68 1,27 0,49 0,51 0,47 73,07 75,78 70,68 73,18 2,60 0,46 0,43 0,44 91,48 85,75 87,87 88,37 3,12 Dừa 3/4 150 Dừa 1/2 150 Dứa 3/4 Dứa 200 2.2 Định lượng đường khử thủy phân tinh bột sắn Hàm lượng đường khử lúc (2g tinh bột pha với nước cất tỉ lệ 1:10) Hệ số Tỉ lệ Hàm lượng đường khử Sai pha enzy tinh bột (mg/ml) số loãng me 100 1:400 1:200 3:400 1:100 1:80 3:200 7:400 1:50 9:400 1:40 x1 x2 x3 0,28 0,28 0,32 KL1 KL2 KL3 KLTB 0,29 27,95 27,68 28,69 28,11 0,58 0,32 0,31 31,77 31,51 30,61 31,30 0,69 0,34 0,33 0,30 34,11 32,52 30,45 32,36 1,91 0,32 0,33 0,36 32,30 33,10 36,45 33,95 2,50 0,37 0,35 0,35 36,55 34,85 35,23 35,54 1,01 0,33 0,32 0,31 32,94 32,41 31,19 32,18 0,99 0,34 0,32 0,32 33,74 32,46 32,46 32,89 0,85 0,32 0,30 0,30 32,46 29,97 29,86 30,76 1,70 0,32 0,33 0,32 32,25 32,68 32,15 32,36 0,32 0,31 0,30 0,34 31,14 30,07 34,32 31,84 2,48 Hàm lượng đường khử lúc (2g tinh bột pha với nước cất tỉ lệ 1:10) Hệ Tỉ lệ Hàm lượng đường khử số enzym tinh bột (mg/ml) pha e x1 loãn x2 x3 KL1 KL2 KL3 KLT B g 100 Sai số 1:400 1:200 3:400 1:100 1:80 3:200 7:400 1:50 9:400 1:40 0,39 0,38 0,41 38,68 38,41 40,54 39,21 1,33 0,42 0,42 0,42 41,81 42,24 41,76 41,93 0,30 0,43 0,48 0,40 43,30 48,08 40,22 43,86 4,21 0,45 0,43 0,47 45,32 43,14 47,02 45,16 2,02 0,53 0,42 0,45 53,44 42,34 44,68 46,82 6,62 0,40 0,48 0,47 39,69 47,65 46,86 44,73 5,05 0,43 0,44 0,44 42,82 43,88 44,41 43,71 0,89 0,41 0,44 0,44 41,49 43,78 44,47 43,24 1,75 0,43 0,42 0,45 43,03 41,60 45,05 43,23 1,82 0,41 0,41 0,46 41,17 41,23 45,74 42,71 3,03 Hàm lượng đường khử lúc (2g tinh bột pha với nước cất tỉ lệ 1:10) Hệ số Tỉ lệ Hàm lượng đường khử Sai pha enzym tinh bột (mg/ml) số loãng e x1 150 1:400 1:200 3:400 1:100 1:80 3:200 7:400 1:50 9:400 1:40 x2 x3 KL1 KL2 KL3 KLTB 0,30 0,40 0,36 45,59 60,72 53,40 53,24 7,65 0,38 0,37 0,35 57,38 55,95 51,96 55,10 3,13 0,37 0,41 0,35 55,31 62,24 52,92 56,82 5,42 0,35 0,41 0,43 52,04 61,12 65,11 59,42 7,38 0,42 0,43 0,39 63,67 64,47 58,02 62,05 4,04 0,41 0,41 0,40 60,96 61,60 59,85 60,80 0,96 0,41 0,40 0,37 60,88 59,85 54,75 58,49 3,74 0,36 0,39 0,39 53,64 58,49 57,86 56,66 3,03 0,39 0,36 0,37 59,21 53,95 54,99 56,05 3,16 0,40 0,37 0,35 59,29 56,02 51,88 55,73 3,85 Hàm lượng đường khử lúc (2g tinh bột pha với nước cất tỉ lệ 1:10) Hệ Tỉ lệ Hàm lượng đường khử Sai số enzym tinh bột (mg/ml) số pha e x1 loãng x2 x3 KL1 KL2 KL3 KLT B 150 1:400 1:200 3:400 1:100 1:80 3:200 7:400 1:50 9:400 1:40 0,28 0,28 0,27 42,56 41,61 40,57 41,58 1,01 0,29 0,30 0,28 43,20 45,59 42,40 43,73 1,86 0,30 0,30 0,30 45,43 44,95 44,95 45,11 0,32 0,34 0,31 0,31 51,17 45,83 46,39 47,79 3,37 0,33 0,31 0,36 49,89 46,07 53,79 49,92 3,88 0,31 0,34 0,32 46,78 51,33 47,66 48,59 2,73 0,32 0,28 0,32 47,90 42,48 47,26 45,88 3,40 0,30 0,30 0,32 44,31 44,87 47,90 45,70 2,20 0,32 0,30 0,28 47,34 45,75 42,56 45,22 2,66 0,30 0,27 0,32 44,63 41,21 47,90 44,58 3,37 Hàm lượng đường khử lúc 10 (2g tinh bột pha với nước cất tỉ lệ 1:10) Hệ số Tỉ lệ Hàm lượng đường khử Sai pha enzy tinh bột (mg/ml) số loãng me x1 x2 x3 KL1 KL2 KL3 KLT B 150 1:400 1:200 3:400 1:100 1:80 3:200 7:400 1:50 9:400 1:40 0,34 0,27 0,27 50,93 41,21 40,89 44,34 6,59 0,29 0,29 0,31 44,08 44,24 47,18 45,16 2,02 0,33 0,31 0,27 49,65 46,39 41,05 45,70 4,65 0,30 0,32 0,30 45,43 47,74 45,67 46,28 1,46 0,32 0,31 0,32 48,62 45,99 47,42 47,34 1,35 0,30 0,29 0,32 44,71 43,92 47,26 45,30 1,96 0,29 0,30 0,29 44,16 45,35 43,28 44,26 1,09 0,31 0,29 0,30 45,91 43,68 44,55 44,71 1,19 0,31 0,29 0,30 46,07 44,08 44,79 44,98 1,09 0,30 0,31 0,29 44,63 46,31 42,80 44,58 1,78 Khảo sát lên men Mơi trường có bổ sung Thời gian Khối lượng uớt (g) (ngày) Khối lượng khô (g) chất dinh dưỡng, có bổ sung SA, DAP (giống 10%) Bột có bổ sung 11 8,79 ± 0,83 0,78 ± 0,08 ½ dừa 13 10,35 ± 0,33 1,11 ± 0,19 15 15,79 ± 0,90 1,34 ± 0,54 17 17,54 ± 0,64 1,43 ± 0,31 19 15,90 ± 0,87 1,36 ± 0,33 21 15,75 ± 0,50 1,34 ± 0,48 Bột có bổ sung 11 11,74 ± 1,00 0,98 ± 0,11 ¾ dừa 13 15,68 ± 0,94 1,12 ± 0,23 15 17,02 ± 0,21 1,31 ± 0,33 17 18,54 ± 1,50 1,52 ± 0,43 19 16,22 ± 0,97 1,50 ± 0,26 21 15,87 ± 1,13 1,48 ± 0,24 Bột có bổ sung 11 10,22 ± 0,79 1,34 ± 0,07 ½ dứa 13 13,16 ± 0,89 1,67 ± 0,61 15 17,01 ± 1,76 2,01 ± 0,48 17 19,91 ± 0,12 2,19 ± 0,45 19 18,71 ± 0,96 2,15 ± 0,33 21 18,52 ± 0,60 2,12 ± 0,26 Bột có bổ sung 11 10,17 ± 0,98 1,12 ± 0,28 ¾ dứa 13 16,72 ± 1,92 1,74 ± 0,87 15 18,62 ± 0,97 2,35 ± 0,71 17 20,17 ± 2,17 2,48 ± 0,53 19 19,12 ± 0,73 2,34 ± 0,63 21 19,06 ± 1,40 2,33 ± 0,53 11 4,27 ± 0,56 0,30 ± 0,02 13 5,83 ± 0,78 0,36 ± 0,06 15 6,86 ± 1,03 0,43 ± 0,15 17 11,33 ± 1,44 0,65 ± 0,06 19 8,91 ± 0,89 0,59 ± 0,10 21 8,76 ± 1,21 0,58 ± 0,05 Bột Mơi trường có bổ Thời Khối lượng uớt Khối lượng khô sung chất gian (g) (g) dinh dưỡng, (ngày) không bổ sung SA, DAP (giống 10%) Bột có bổ sung ½ 11 4,88 ± 0,75 0,48 ± 0,06 dừa 13 9,30± 0,47 0,74 ± 0,12 15 16,24 ± 0,59 1,03 ± 0,27 17 16,67 ± 1,66 1,20 ± 0,27 19 14,18 ± 0,95 1,03 ± 0,19 21 14,17 ± 0,31 1,00 ± 0,17 Bột có bổ sung ¾ 11 6,40 ± 0,65 0,50 ±0,08 dừa 13 14,80 ± 0,84 1,03 ± 0,29 15 15,54 ± 1,27 1,29 ± 0,12 17 16,75 ± 1,72 1,46 ± 0,22 19 16,35 ± 1,34 1,43 ± 0,48 21 16,17 ± 0,43 1,42 ± 0,31 Bột có bổ sung ½ 11 9,4 ± 1,02 1,13 ± 0,20 dứa 13 11,95 ± 1,32 1,32 ± 0,12 15 16,46 ± 1,44 1,41 ± 0,17 17 17,79 ± 1,21 1,52 ± 0,29 19 16,57 ± 0,91 1,43 ± 0,25 21 16,28 ± 0,54 1,41 ± 0,38 Bột có bổ sung ¾ 11 7,80 ± 0,61 1,14 ± 0,25 dứa 13 15,90 ± 0,33 1,70 ± 0,17 15 16,62 ± 1,15 1,97 ± 0,52 17 18,05 ± 1,30 2,13 ± 0,05 19 17,36 ± 0,97 1,97 ± 0,11 21 17,02 ± 0,20 1,93 ± 0,19 11 x x 13 x x 15 x x 17 x x 19 x x 21 x x Bột Tỉ lệ giống bổ Thời gian (ngày) sung 8% có SA, Khối lượng ướt Khối lượng khơ (g) (g) DAP Bột có bổ sung 11 8,76 ± 0,98 0,49 ± 0,08 ½ dừa 13 9,93 ± 0,42 0,67 ± 0,06 15 11,02 ± 0,70 0,83 ± 0,09 17 11,01 ± 0,46 0,87 ± 0,02 19 10,03 ± 0,60 0,77 ± 0,08 21 9,94 ± 0,42 0,75 ± 0,07 Bột có bổ sung 11 10,36 ± 0,48 0,94 ± 0,26 ¾ dừa 13 12,18 ± 1,08 1,07 ± 0,10 15 16,03 ± 1,22 1,30 ± 0,35 17 17,88 ± 0,54 1,43 ± 0,40 19 15,49 ± 0,56 1,32 ± 0,15 21 15,46 ± 0,48 1,32 ± 0,08 Bột có bổ sung 11 10,62 ± 0,50 1,05 ± 0,22 ½ dứa 13 12,14 ± 1,01 1,18 ± 0,25 15 16,96 ± 0,53 1,71 ± 0,37 17 17,89 ± 0,37 1,73 ± 0,21 19 14,95 ± 0,27 1,59 ± 0,05 21 14,20 ± 0,86 1,53 ± 0,29 11 10,09 ± 0,51 1,04 ± 0,08 Bột có bổ sung ¾ dứa Bột 13 16,29 ± 1,03 1,60 ± 0,11 15 17,40 ± 1,30 2,17 ± 0,42 17 18,93 ± 0,83 2,34 ± 0,30 19 18,67 ± 1,86 2,22 ± 0,46 21 18,47 ± 1,11 2,21 ± 0,51 11 4,13 ± 0,35 0,22 ± 0,05 13 5,02 ± 0,26 0,32 ± 0,04 15 6,69 ± 0,41 0,43 ± 0,02 17 10,29 ± 0,44 0,61 ± 0,12 19 10,23 ± 0,50 0,59 ± 0,02 21 10,00 ± 0,35 0,55 ± 0,06 Tỉ lệ giống bổ Thời gian (ngày) sung 12% có Khối lượng ướt Khối lượng khơ (g) (g) SA, DAP Bột có bổ 11 9,37 ± 0,53 0,87 ± 0,08 sung ½ dừa 13 11,55 ± 0,53 1,29 ± 0,26 15 16,70 ± 0,55 1,55 ± 0,14 17 18,38 ± 0,27 1,84 ± 0,29 19 18,23 ± 0,31 1,78 ± 0,05 21 18,21 ± 0,41 1,76 ± 0,03 Bột có bổ 11 9,79 ± 0,42 0,99 ± 0,16 sung ¾ dừa 13 14,70 ± 0,77 1,24 ± 0,29 15 18,77± 1,24 1,53 ± 0,20 17 21,73 ± 1,05 1,86 ± 0,21 19 20,16 ± 0,93 1,82 ± 0,10 21 20,13 ± 1,24 1,78 ± 0,06 Bột có bổ 11 12,95 ± 0,81 1,36 ± 0,23 sung ½ dứa 13 15,33 ± 1,85 1,84 ± 0,31 15 15,53 ± 0,55 2,15 ± 0,21 17 22,42 ± 1,67 2,66 ± 0,31 19 20,07 ± 0,71 2,62 ± 0,19 21 20,04 ± 0,70 2,61 ± 0,22 11 15,13 ± 0,48 1,95 ± 0,1 Bột có bổ sung ¾ dứa Bột 13 18,97 ± 1,30 2,55 ± 0,09 15 22,39 ± 2,03 2,71 ± 0,25 17 23,29 ± 0,97 2,87 ± 0,4 19 20,73 ± 0,53 2,68 ± 0,56 21 20,02 ± 0,21 2,52 ± 0,16 11 5,54 ± 0,58 0,32 ± 0,01 13 6,21 ± 0,52 0,50 ± 0,04 15 7,50 ± 0,26 0,58 ± 0,07 17 12,10 ± 1,42 0,74 ± 0,08 19 10,25 ± 0,27 0,72 ± 0,11 21 10,00 ± 0,06 0,70 ± 0,18 ... khảo sát sử dụng nguồn nước thải từ nhà máy sản xuất tinh bột, đề tài:“ Sản xuất cellulose vi khuẩn từ nguồn tinh bột ”, khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình thủy phân tinh bột nhằm tạo glucose... không sử dụng tinh bột, em thực đề tài:“ Sản xuất cellulose vi khuẩn từ nguồn tinh bột ” Mục tiêu đề tài: Sử dụng tinh bột tạo màng BC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT... Xuất phát từ vấn đề nhóm nghiên cứu tiến hành thử nghiệm sử dụng tinh bột sắn bước đầu cho khảo sát sử dụng nguồn nước thải từ nhà máy sản xuất tinh bột, vi khuẩn sản xuất cellulose vi khuẩn không