Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi th

LỜI CẢM ƠN

Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện đề tài này Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điều bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi làm việc Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảo tận tình

Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của cô thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường

Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúp chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tơi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãn trong khi làm việc

Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành

Tp HCM, ngày tháng năm

Phan Anh Tuấn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Acetobacter xylinum (A xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại

polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả năng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác Để ứng dụng cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện và ứng dụng thực tế Với mục đích sản xuất cellulose vi

khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên môi trường Hestrin-Schramm

(HS)

- Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum

Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho chủng A xylinum có sẵn Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose của chủng A xylinum này là thích hợp

nhất, lượng cellulose đạt được có thể ~5,2 gl-1 Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi nguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp

nhất cho chủng A xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl-1 Để chọn

ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện với nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kết quả tạo cellulose tốt nhất Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình

tổng hợp cellulose của A xylinum, hàm lượng cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl-1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trị 5,0

Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum có tại Phòng

Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric;

pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho quá trình nuôi cấy Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

B ẢNG 4.2: B ẢNG MÃ HOÁ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CẦN KHẢO SÁT 47 VI CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 C ELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 2

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 2

2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 2

2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 5

2.2 S INH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A XYLINUM 8

2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum 8

2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 9

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose 11

2.3 Ứ NG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHU N Ẩ 20

2.3.1 Thực phẩm 20

2.3.2 Y học 21

2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 21

NGUYÊN LIỆU24 VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.4 N GUYÊN LIỆU 24

2.4.1 Chủng vi sinh vật 24

2.4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 24

2.5 T HIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 25

2.5.1 Khảo sát quá trình nhân giống 25

2.5.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose 26

2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 26

2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 26

2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 27

2.6 C ÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28

2.6.1 Số lượng vi khuẩn 28

2.6.2 Hàm lượng cellulose 28

2.6.3 Phân tích thống kê 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A XYLINUM 30

3.2 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 31

3.3 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA P H LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A

XYLINUM .33

3.4 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM .34

3.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 34

3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 36

3.5 T ỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 38

B ẢNG 4.1: B ẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM TỐI ƯU 38

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

4.1 K ẾT LUẬN 42

4.2 Đ Ề NGHỊ 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 4

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) 6

Hình 2.3: SEM của A xylinum 8

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum 11

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum 13

Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 15

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 16

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A xylinum 35

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 36

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum .39

Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi 42

Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose 7

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 16

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A xylinum IFO 13693 17

Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của 23

Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn 26

Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ 33

Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34

Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu 47

Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47

DANH MỤC VIẾT TẮT

- Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện

nuôi cấy có khuấy đảo)

- A xylinum: Acetobacter xylinum

- A xylinus: Acetobacter xylinus

- ATP: adenosine triphosohate

- BASYC®: bacterial synthesised cellulose

- Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose

- cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc

- CS: cellulose synthase

- CSL: corn steep liquor

- DAP: diamon phosphate

- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích

- SEM: Scanning electronic microscopy

- St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy

tĩnh)

- SA: Sulfate amon

- UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase

- UDPG: Uridine diphosephoglucose

- YPM: Yeast extract Peptone Mannitol

- YE: Yeast extract – cao nấm men

Chương 1: MỞ ĐẦU

Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp

cellulose rất tốt đó là A xylinum Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng

dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng

được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000).

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát

hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993) Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và

làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp với tính chất của các ứng dụng Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới

điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh

Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên

cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu

được các kết quả hữu ích cho các nghiên cứu trong tương lai

Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trên môi trường HS.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum trên môi trường

HS

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum.

- Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất

sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum.

Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al (1986) Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một

khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi

khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986).

Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn Đầu

tiên, Hestrin et al (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ông đã

chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose Sau đó, Next và Colvin (1957)

chứng minh rằng cellulose được A xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP Cùng với sự tiến bộ

của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer

do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan

Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A xylinum bằng việc giải trình tự đoạn

gen tổng hợp cellulose Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn

2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn

thành dải Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000) Các dải siêu mịn

của cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ

các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001)

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)

2.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000 Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi

khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998) Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2).

2.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của cellulose

vi khuẩn Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân

giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001).

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993) Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này Cấu trúc của cellulose được tổng hợp

từ vi khuẩn A xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60% Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994) Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm khoảng 20%

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh

thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện.

2.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al.,

2001)

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα

cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào

quá trình sinh tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và

trọng lượng phân tử cellulose

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)

2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A xylinum được biết đến

nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

(Jonas et al., 1998)

Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trường hiếu khí

Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải

Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải

Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose Đặc biệt là A xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù

hợp cho các mục đích sử dụng…

2.1.3.1 Phân loại A xylinum

A xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus.

A xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A xylinum.

• A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh

bào tử Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi

• Nếu A xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có

hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể

• Khuẩn lạc của A xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên,

dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

Hình 2.3: SEM của A xylinum (Forge & Preston, 1977)

2.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A xylinum (Jonas et al., 1998)

• Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O

• Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men

• Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

• Chuyển hóa glucose thành acid gluconic

• Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton

• Không sinh sắc tố nâu

• Tổng hợp cellulose

Đặc điểm sinh trưởng của A xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chẳng hạn chủng A xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của

môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3 Theo Hestrin

(1947) thì pH tối ưu để A xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi

trường dinh dưỡng tối ưu Theo Maccormide et al (1996) cho rằng A xylinum có thể phát triển trong phạm vi

pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid

citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose

2.1.3.4 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum.

Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn tại của vi

sinh vật trong tự nhiên

• Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001).

• Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt giàu khí

oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới lỏng khí của môi trường

mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998)

• Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A xylinum trên cơ chất và bảo vệ vi khuẩn

trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất

• Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây bệnh…) trong môi trường sống tăng lên

• Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV 23% vi khuẩn acetic được bao bọc

bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV (Bielecki et al., 2001).

2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum

Theo Ross et al (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành các sợi kết

tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose

UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A xylinum Như sơ đồ

duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme Những bước này là sự phosphoryl hoá của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá của glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase UDP-Glucose

pyrophosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla &

Kjosbakken, 1981)

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon & Anderson,

1991)

2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành hai giai đoạn chính: giai đoạn

polymer hóa và giai đoạn kết tinh

2.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng isomer hóa Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-Glucose Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000)

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose–1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000)

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000)

2.2.2.2 Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ sắp xếp thành hàng dọc

chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991) Các lỗ này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế

bào Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp cellulose Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum

(Iguchi et al., 2000)

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose.

2.2.3.1 Kiểu nuôi cấy

Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo

a) Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và tiến hành nuôi

cấy chủng A xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môi trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp và mang tính thủ công Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995)

b) Nuôi cấy có khuấy đảo

Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy, thổi khí oxy

hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâu của môi trường Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…

Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng

thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương pháp nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại,

trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổn định khi nuôi cấy Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có

khả năng sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A xylinum được gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et al (1998) đã giới thiệu

“điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga

et al., 1997).

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002) Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm

(El-Saied et al., 2004)

Hình 2.8 thể hiện sự khác biệt về cấu trúc của cellulose khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo.Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong nuôi cấy chìm (Agitated bacterial cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng cellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC) Tuy nhiên có vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và Ag-BC Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn

so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi Hình thái này có được có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trường khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần I , bảng 2.2 cho thấy rõ điều này.α

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo

a Xác định bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X

b Ước lượng bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X kích thước của mặt phẳng tinh thể học

c Xác định bằng CP/MAS 13C NMR

Do những khác biệt về cấu trúc mà St-BC và Ag-BC có những tính chất có liên quan tới những ứng dụng thương mại cũng khác nhau như trình bày ở bảng 2.3

c tr ng

Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên một đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những phần tử tạo nên sợi cellulose

Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO3 bị giữ trên tờ giấy cellulose Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy có bề mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy Trong trường hợp của chất ổn định nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương chứa trong Ag-BC ổn định hơn

Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công nghiệp hơn St-BC

(Watanabe et al., 1998).

2.2.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn

Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng phương pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài Do đó một số phương pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh

Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuôi cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy mẻ Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát các yếu tố môi trường Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong môi trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát quá trình khuấy trộn và sục khí Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng

choáng hết thể tích môi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga et al., 1997).

Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn:

a) Ajinomoto

Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt nhằm cải thiện sự tổng hợp của cellulose Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị có sục khí trước khi được cho vào

các khay tĩnh Sau 3 ngày trong thiết bị suc khí, mật độ tế bào vào khoảng 2x107 (tế bào/ml) Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí So sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị nay fcho năng suất cao hơn 140% Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng

sucrose ban đầu (Okiyama et al., 1992)

b) Weyerhauser

Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát triển để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ Sử dụng các chất gây đột biến đổi hóa học để

thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A xylinum được phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh

ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acid với việc điều chỉnh pH thấp hơn Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật được phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự trao đổi chất, tổng hợ cellulose không ngừng Tuy nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương

pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black et al., 1990).

c) ICI

ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với hệ thống Weyerhauser Bước đầu tiên là bước tích lũy Khi đó vi khuẩn được phép phát triển trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết Sau đó bổ sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose Bước cuối cùng là loại đi các huyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế

bào vi sinh vật ra khỏi sản phẩm (Serafica et al.,1998).

d) Gengiflex®, Biofill® và BASYC®

Chủng A xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối ưu cho chúng phát

triển Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng cho dịch lên men Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của Schramm và Hestrin (1954)

Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để giúp hồi phục lại

mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997)

Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể được ứng dụng băng các vết thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho con người Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng để làm các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao Ngược lại, ưu điểm của nó là giúp hồi phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt Cellulose trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hồi phục Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá rất

cao (Fontana et al, 1990).

BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose) BASYC® là một sản phẩm dạng ống dùng thay cho các mạch máu Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được sử dụng thay thế cho mạch máu Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp

khác khi sử dụng cùng mục đích (Klemm et al, 2001).

e) Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm Sử dụng một dụng cụ có độ sâu không lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quay liên tục với tốc độ 35 mmh-1 Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi xử lý Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là

cellulose có thể được thu nhân liên tục và môi trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).

f) Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo

Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khi trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991) Bằng cách tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng tăng lên Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và có sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng

II Độ nhớt cao của môi trường và sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp Với phương pháp này thì sợi

cellulose tạo ra có cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997)

2.2.3.3 Aûnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp màng cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose Do đó oxy là nhân tố quan trọng cho quá trình

tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al., 1995).

Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hình thành cellulose cũng như sức sản xuất màng Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng Hơn nữa, với áp suất oxy là 10% tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào Sự tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với điều kiện áp suất khí quyển Tuy nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật

(Yamanaka & Watanabe et al., 1995).

2.2.3.4 Aûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn

1 Ảnh hưởng của pH

Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconic trong quá trình tổng hợp cellulose là nguyên nhân chính của sự giảm pH của môi trường lên men pH ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của tế bào và sự hình thành

cellulose (Hwang, J.W et al., 1999) Các báo cáo trước đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối ưu cho sự

tổng hợp cellulose từ A xylinum là trong khoảng 4 – 7 Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al (1989) đưa ra khảng pH tối ưu là 5 - 7 Masaoka et al (1993) thì thấy rằng khoảng này là 4 - 6 Qua các kết

quả nghiên cứu đó cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose và sự

phát triển của tế bào vi sinh vật A xylinum

A xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase Cellulase ít được tổng hợp ở pH thấp (pH <

5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao Độ bền cơ học của tấm cellulose nuôi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền

của tấm cellulose nuôi ở pH 6 (Toda et al., 1997).

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ Nhiệt độ từ 25 - 300C là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991) Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng khoảng nhiệt độ từ 25 -

300C

Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà còn thay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hóa cellulose được sản xuất ở 300C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả năng giữ nước cao hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp

hơn (Geyer et al., 1994)

Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc cellulose nhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al., 2006).

2.2.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A xylinum là môi

trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3 Từ khi thành phần môi trường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi khuẩn Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phần môi trường liên quan đến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steep liquor), peptone, trypton, cao thịt, proteopeptone…Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứng dụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế bào và tốc độ tạo

cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn nitơ có giá thành tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).

Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate Masaoka et al (1993) đã chứng

minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng hiệu suất tạo cellulose so với

sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin cho kết quả ngược lại (Yang et al.,

1998)

2 Ảnh hưởng của nguồn carbon.

Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose bởi vi khuẩn A xylinum Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác nhau đối với các cơ chất

khác nhau

Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A xylinum IFO 13693 tổng hợp cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men (Masaoka et al., 1993) Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất là glucose (Oikawa et al., 1995) Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996)

Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khuẩn A xylinum IFO 13693 khi sử

dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn làm nguồn carbon để đối chứng (bảng 2.4)

Bảng 2.4: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của

A xylinum IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998)

Nguồn Carbon Năng suất tổng hợp cellulose (%) Monosaccharides

167337-11

184

620.5

2.2.3.6 Tỷ lệ diện tích bề mặt – thể tích (S/V)

Bởi vì sự hình thành cellulose diễn ra trên mặt tiếp xúc giữa không khí và môi trường (Masaoka et al.,1993) nên tỉ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc và thể tích môi trường là nhân tố có vai trò khá quan trọng trong

sự hình thành và tổng hợp cellulose Tỉ lệ tốt nhất đối với các chủng vi khuẩn khác nhau và điều kiện môi

trường đang sử dụng khác nhau là khác nhau Vandamme et al (1998) đưa ra kết luận tỉ lệ S/V khoảng 2,2

cm-1 cho kết quả tốt nhất khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 1 đến 3 cm-1 Trong khi đó, lượng cellulose thu được cao nhất khi S/V bằng 0,7 cm-1 khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 0,27 đến 2,13 cm-1 (Krystynowicz et al., 2002).

Mặc dù bản chất hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dưới hóa chất và nhiệt độ cao, cellulose vi khuẩn là vật liệu được chọn cho nhiều ứng dụng

(Watanabe et al., 1998).

2.3.1 Thực phẩm

Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân làm cho thực phẩm bị hư hỏng và làm giảm thời gian sử dụng của sản phẩm thực phẩm Vấn đề bảo quản sản phẩm thực phẩm tránh khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng được đặc biệt quan tâm Có nhiều cách để bảo quản sản phẩm, ví dụ như dùng các hoá chất bảo quản chống vi sinh vật là một cách khá phổ biến Tuy nhiên, với cellulose vi khuẩn, người ta có thể ứng dụng để làm màng bao chống vi sinh vật Theo đó, chất chống vi sinh vật sẽ được kết hợp với màng, làm các chất bảo quản này tập trung trên màng bao làm thành bức tường bảo vệ thực phẩm, đồng thời giảm lượng hoá chất bảo quản trong thực phẩm, khi sử dụng sản phẩm, màng này có thể được loại bỏ dễ dàng Ứng dụng