Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy hướng dẫn em suốt trình thực đề tài này. Trong trình làm việc với thầy, em học hỏi nhiều điều bổ ích, không kiến thức chuyên môn mà kinh nghiệm làm việc. Khi em gặp khó khăn trình thực đề tài, thầy kòp thời hướng dẫn, bảo tận tình. Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thò Ngọc Anh, lời truyền đạt cô thật bổ ích cho em trình em làm luận văn trường. Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô giúp đỡ chúng em mặt hóa chất phục vụ cho việc thực đề tài. Em cảm ơn cô Thùy Dương - môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ em nguồn vi sinh vật sử dụng đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt mặt giúp chúng em thực đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi muốn bày tỏ cảm ơn đến tất bạn bè tơi, họ giúp đỡ, đặc biệt cho thấy gắn bó, chia sẻ, cảm thông giây phút thư giãn làm việc. Tôi xin cảm ơn với tất lòng chân thành. Tp. HCM, ngày tháng năm Phan Anh Tuấn i Tóm tắt luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A. xylinum) vi khuẩn Gram âm, sản xuất loại polysaccharide ngoại bào gọi cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả ứng dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm lónh vực khác. Để ứng dụng cellulose vi khuẩn cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi ổn đònh. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm phát ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện tónh, thực khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum môi trường Hestrin-Schramm - Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. (HS). Để khảo sát sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum nuôi cấy điều kiện tónh môi trường HS điều kiện khác nhằm rút điều kiện nuôi cấy tốt cho chủng A. xylinum có sẵn. Khảo sát ảnh hưởng pH trình tạo cellulose vi khuẩn A. xylinum tiến hành thấy rằng, khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose chủng A. xylinum thích hợp nhất, lượng cellulose đạt ~5,2 gl -1. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon cách thay đổi nguồn carbon thành phần môi trường nuôi cấy, chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A. xylinum sinh tổng hợp cellulose mannitol. Lượng cellulose đạt ~7,4 gl -1. Để chọn nguồn nitơ tốt cho tổng hợp cellulose, thí nghiệm thực với nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ thay đổi, kết cho thấy cao nấm men cho kết tạo cellulose tốt nhất. Lượng cellulose đạt ~8 gl-1 g. Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời mannitol cao nấm men lên trình tổng hợp cellulose A. xylinum, hàm lượng cellulose thu đạt ~8,5 gl-1 thành phần môi trường HS điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl -1 hàm lượng cao nấm men 6,5 gl -1, pH môi trường chỉnh xung quanh giá trò 5,0. Với kết thu thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum có Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm thành phần sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH điều chỉnh 5,0 thích hợp cho trình nuôi cấy. Các kết quả thí nghiệm cung cấp thông tin hữu ích cho phát triển khả sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô công nghiệp. ii Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN .ii MỤC LỤC .iv DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC VIẾT TẮT .viii BẢNG 4.2: BẢNG MÃ HOÁ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CẦN KHẢO SÁT 47 VI CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HP CELLULOSE 2.1.1 Lòch sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn .2 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose .5 2.2 SINH TỔNG HP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A. XYLINUM .8 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose A. xylinum .8 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn .9 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose .11 2.3 ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 20 2.3.1 Thực phẩm .20 2.3.2 Y học .21 2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 21 NGUYÊN LIỆU 24 VÀ PHƯƠNG PHÁP .24 2.4 NGUYÊN LIỆU 24 2.4.1 Chủng vi sinh vật 24 2.4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật .24 2.5 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 25 2.5.1 Khảo sát trình nhân giống 25 2.5.2 Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose .26 2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum .26 2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum .26 2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum .27 2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28 2.6.1 Số lượng vi khuẩn 28 2.6.2 Hàm lượng cellulose 28 2.6.3 Phân tích thống kê .29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A. XYLINUM 30 3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HP CELLULOSE 31 iii Mục lục 3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM .33 3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM .34 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 34 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ .36 3.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 38 BẢNG 4.1: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM TỐI ƯU .38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .42 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 ĐỀ NGHỊ .42 iv Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc cellulose vi khuẩn .4 Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) cellulose thực vật (b) .6 Hình 2.3: SEM A. xylinum .8 Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose A. xylinum 11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose môi trường từ A. xylinum .13 Hình 2.7: Cellulose tạo thành điều kiện nuôi cấy tónh có khuấy đảo 15 Hình 2.8: Cấu trúc điều kiện nuôi cấy tónh nuôi cấy có khuấy đảo .16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng A. xylinum 35 Hình 4.2: Đồ thò biểu diễn trọng lượng cellulose thu giá trò pH ngày lên men thứ 4, 5, 6, 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu nguồn nitơ thay đổi 44 v Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC Ag-BC 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC Ag-BC A. xylinum IFO 13693 17 Bảng 2.4: nh hưởng nguồn carbon lên tổng hợp cellulose 23 Bảng 2.5: Các ứng dụng nhiều lónh vực cellulose vi khuẩn .26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon nguồn nitơ 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34 Bảng 4.1: Bảng kết thí nghiệm tối ưu .47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47 vi Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) - A. xylinum: Acetobacter xylinum - A. xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose. - cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance. - PGI: Phosphoglucoisomerase - PGM: Phosphoglucomutase - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid vii Danh mục viết tắt - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy tónh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao nấm men viii Chương 1. Mở đầu Chương 1: MỞ ĐẦU Cellulose hợp chất hóa học thường biết đến với vai trò khung xương quan trọng thể thực vật. Không cellulose tổng hợp thực vật, mà cellulose tổng hợp nên vi sinh vật, với tên gọi cellulose vi khuẩn. Một loài vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose tốt A. xylinum. Cellulose vi khuẩn ngày quan tâm nhiều khả ứng dụng rộng rãi nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng nghiên cứu, cải tiến nhà khoa học giới (Otomo et al., 2000). Trong công nghệ đồ uống thực phẩm, cellulose vi khuẩn ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, ứng dụng cellulose vi khuẩn phát gần khả ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật hiệu (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn đònh, phù hợp với tính chất ứng dụng. Nhiều kết nghiên cứu cho thấy nuôi cấy điều kiện có khuấy đảo hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum cao nuôi cấy tónh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu phải dạng màng. Với mục đích đó, thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện nuôi cấy tónh với mong muốn thu kết hữu ích cho nghiên cứu tương lai. Trong nội dung thực hiện, tập trung khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum. - Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum. - Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Với kết thu được, phần cung cấp thông tin hữu ích cho nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ để ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô công nghiệp. Chương 2. Tổng quan tài liệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cellulose vi khuẩn vi sinh vật tổng hợp cellulose 2.1.1 Lòch sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn. Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào vi khuẩn A. xylinum lần báo cáo Brown et al. (1986). Theo đó, nghiên cứu vi khuẩn acetic, Brown phát quan sát thấy khối rắn mà theo ông lúc khối rắn không nằm kết nghiên cứu ông dự đònh trước. Khối rắn khó bò phân hủy giống với mô động vật. Hợp chất sau xác đònh cellulose vi khuẩn tổng hợp Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Đến nửa kỷ XX nhà khoa học thực nghiên cứu nhiều cellulose vi khuẩn. Đầu tiên, Hestrin et al. (1954) nghiên cứu khả tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum. Ông chứng minh vi khuẩn sử dụng đường để tổng hợp cellulose. Sau đó, Next Colvin (1957) chứng minh cellulose A. xylinum tổng hợp môi trường có đường ATP. Cùng với tiến khoa học kỹ thuật, cấu trúc cellulose vi khuẩn ngày hiểu rõ, chuỗi polymer glucopyranose nối với liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990) giải thích chế tổng hợp cellulose A. xylinum việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông tách chiết đoạn polypeptide liên quan đến trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đến có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, chế tổng hợp, ứng dụng… cellulose vi khuẩn. 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.2.1 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn chuỗi polymer glucopyranose nối với liên kết β-1,4glucan. Những chuỗi glucan vi khuẩn tổng hợp nối lại với thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây thớ sợi tự nhiên mảnh so sánh với sợi cellulose sơ cấp tượng tầng vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành vi sợi, vi sợi tạo thành bó sợi, bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày – nm, chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mòn cellulose vi khuẩn có chiều dài từ µm đến µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, ổn đònh nhờ liên kết hydro, lớp màng film (Bielecki et al., 2001) Chương 4. Kết bàn luận Kết cho thấy, trọng lượng cellulose thu sau ngày lên men cao so với ngày thứ sáu chênh lệch không đáng kể (P > 0,05). Do đó, để rút ngắn thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc lên men thống cho thí nghiệm sau ngày lên men. 3.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum Tiến hành lên men thu nhận cellulose nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum môi trường HS thí nghiệm điểm pH ban đầu khác nhau. Các giá trò pH khảo sát 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 7. Khảo sát hàm lượng cellulose thu được, đánh giá ảnh hưởng pH lên khả tạo cellulose vi khuẩn. Từ chọn pH tốt cho môi trường lên men. Kết thu cho thấy, giá trò pH khác lượng cellulose thu khác nhau, điều chứng tỏ pH yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose A. xylinum. Khoảng pH cho chủng A. xylinum thí nghiệm khoảng từ – 5,5, lượng cellulose thu ~5,1 gl-1. Lượng cellulose tạo giá trò pH khác khoảng khác biệt không rõ ràng (P > 0,05). Ngoài khoảng pH khả tổng hợp cellulose A. xylinum giảm đạt từ 3,5 gl-1 đến 4,6 gl-1. Ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, xem hình 4.3 Hình 4.3: Ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A. xylinum Song song với trình tổng hợp cellulose, A. xylinum tổng hợp cellulase. Khi cellulase 33 Chương 4. Kết bàn luận tạo nhiều khả polymer hóa tạo cellulose vi khuẩn giảm, lượng cellulose tạo hơn. Khi pH cao (pH > 5), lượng cellulase tạo nhiều làm cho cellulose giảm, pH thấp (pH < 5) cellulase tạo ít, tạo thành cellulose tăng lên. Theo nghiên cứu Tahara et al. (1997) chủng A. xylinum BPR2001, pH mức độ polymer hóa cellulose vào khoảng 14000 – 16000, với pH 5, DP giảm từ 16800 xuống 11000. Độ bền học cellulose tổng hợp pH cao độ bền cellulose sản xuất pH (Tahara et al., 1997). Theo nghiên cứu Hutchen et al. (2006), với chủng vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii, nguồn carbon mannitol pH đầu 5,5 lượng cellulose tạo cao đáng kể so với pH 6,5. Nhưng nghiên cứu này, thay đổi nguồn carbon glucose pH 6,5 lại giúp chủng vi khuẩn tổng hợp cellulose tốt pH 5,5. Mặt khác, trình tổng hợp cellulose, oxy hóa glucose xảy cung cấp cho trình trao đổi chất điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm. Các sản phẩm phụ tạo glucose bò oxy hóa số enzyme giải thích nguồn carbon khác chủng vi sinh vật khác có hiệu suất sinh tổng hợp cellulose khác giá trò pH khác (Krystynowicz et al., 2002). Như vậy, pH yếu tố gây ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn. Vi khuẩn A. xylinum tổng hợp cellulose tốt môi trường có pH thấp 5. 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A. xylinum 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn carbon Để khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum nuôi cấy môi trường HS với nguồn carbon khác nhau: glucose, mannitol, sucrose, fructose. Sau ngày lên men nhiệt độ 280C, cellulose thu nhận xử lý, phân tích hiệu suất. Sau ngày lên men, chiều dày lớp cellulose thu trường hợp môi trường có nguồn carbon mannitol xấp xỉ chiều cao lớp dòch môi trường ban đầu. Đây coi lượng cellulose lớn thu trình lên men so với nguồn carbon khác (P < 0,05). Khối lượng cellulose đạt 7,6 ± 0,4 gl-1 (hình 4.4). Mặt khác, cellulose ướt tạo thành có cấu trúc đều, bề mặt nhẵn, khối cellulose chắc, hiệu suất thu cellulose sau sấy khô cao. Glucose nguồn carbon cho kết tạo cellulose mức trung bình, hiệu suất tổng hợp cellulose ổn đònh, lượng cellulose đạt ~5,7 ± 0,5 gl -1. Hai nguồn carbon khác fructose sucrose không thích hợp với chủng vi khuẩn A. xylinum nên khả sử dụng hai nguồn carbon kém. Lượng cellulose đạt khoảng 3,5 gl-1. 34 Chương 4. Kết bàn luận Bằng việc thay đổi nguồn carbon sử dụng, kết cho thấy chủng vi khuẩn sử dụng nhiều loại chất khác nguồn carbon khác có thích hợp cho khả tạo cellulose chủng vi khuẩn khác nhau. Mỗi chủng vi sinh vật A. xylinum khác thích hợp với nguồn carbon khác nhau, tùy chủng vi sinh vật mà nguồn carbon thay đổi để sử dụng cho phù hợp, từ tạo hiệu suất tổng hợp cellulose cao nhất. Kết cho thấy sai khác khả sử dụng nguồn chất carbon chủng vi khuẩn A. xylinum so với chủng A. xylinum nghiên cứu. Chẳng hạn, với kết này, chủng vi khuẩn A. xylinum sử dụng thí nghiệm sử dụng nguồn chất carbon thích hợp mannitol, không giống kết mà Masaoka et al. (1993) đạt được, kết ông cho thấy rằng, glucose nguồn carbon thích hợp cho tạo thành cellulose vi khuẩn A. xylinum IFO 13693, lượng cellulose đạt lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau - ngày lên men. Matsuoka et al. (1996) thấy fructose nguồn carbon thích hợp cho A. xylinum BPR2001. Fructose xem nguồn carbon tốt cho A. xylinum E22 tổng hợp cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Tuy nhiên, kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Oikawa et al. (1995) với vi khuẩn A. xylinum Ku-1, hàm lượng cellulose tổng hợp A. xylinum Ku-1 sử dụng nguồn chất mannitol cao lần so với sử dụng chất glucose. Hutchens et al. (2006) với chủng A. xylinum hansenii, kết ông thấy mannitol nguồn carbon thích hợp cho chủng A. xylinum tổng hợp cellulose. Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi Trong trình tổng hợp cellulose, oxy hóa glucose xảy cung cấp cho trình trao đổi chất 35 Chương 4. Kết bàn luận điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm, cần giảm thiểu trình thất thoát glucose trình oxy hóa này. Có thể giảm oxy hóa glucose cách thêm ethanol hay glycerol vào môi trường nuôi cấy nguồn điện tử dồi nhằm tăng khả sử dụng chất carbon cho mục đích tạo cellulose, từ tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose (Park et al., 2003). Mannitol, polyol, cung cấp điện tử cho trao đổi chất vi khuẩn kích thích tạo thành cellulose tốt so với glucose, điều báo cáo nghiên cứu Brown et al. (1986). Khi môi trường cung cấp nguồn carbon mannitol, acid hóa không xảy trình nuôi cấy, điều phù hợp với đường trao đổi chất vi khuẩn sử dụng mannitol, mannitol A. xylinum chuyển hóa thành fructose (Matsushita et al., 2003), sau oxy hóa tiếp thành 5-keto-d-fructose trước hấp thu (Mowshoitz et al., 1973). Với việc hạn chế tạo thành acid, glucose bò tổn thất, lượng cellulose tạo thành cao hơn. Khi yếu tố môi trường khác giữ cố đònh, thay đổi nguồn carbon, chủng A. xylinum sử dụng nghiên cứu này, mannitol nguồn carbon thích hợp cho khả tạo cellulose vi khuẩn. 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Sau chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A. xylinum có để tổng hợp cellulose, khảo sát nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose. Cũng chuẩn bò môi trường HS, nguồn carbon giữ cố đònh manitol nguồn nitơ thay đổi: cao nấm men, cao thòt, peptone, (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4, nuôi 280C, thời gian ngày. Kết cho thấy, lấy tryptone làm nguồn nitơ tổng hợp cellulose yếu, không đáng kể (0,5 ± 0,1 gl-1). Chứng tỏ chủng vi khuẩn A. xylinum thí nghiệm này, nguồn nitơ không phù hợp cho chúng sinh tổng hợp cellulose. Hai hợp chất khác dùng làm nguồn nitơ thí nghiệm (NH 4)2SO4 (NH4)2HPO4, lượng cellulose thu cao tryptone hiệu suất tạo cellulose thấp, đạt 2,5 ± 0,6 gl -1 2,3 ± 0,6 gl-1. Đối với peptone, trọng lượng cellulose tạo mức trung bình (4,7 ± 0,3 gl -1), đđiều cho thấy peptone nguồn nitơ phù hợp cho chủng A. xylinum (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4 (P < 0,05). Khi nguồn nitơ thay cao nấm men peptone với tỉ lệ 5:3 cao thòt khả tạo cellulose vi khuẩn tăng lên đáng kể, đạt tương ứng 6,8 ± 0,5 gl-1 6,1 ± 0,5 gl-1. Lượng cellulose đạt cao sử dụng nguồn nitơ cao nấm men (8,1 ± 0,8 gl -1). Điều cho phép kết luận rằng, chủng vi khuẩn A. xylinum khảo sát nguồn nitơ tốt môi trường lên men để tạo cellulose cao nấm men. 36 Chương 4. Kết bàn luận Các kí hiệu: YE + Pep – Cao nấm men peptone YE - Cao nấm men Pep – Peptone Tryp – Tryptone ME – Cao thòt Hình 4.5: Trọng lïng cellulose thu thay đổi nguồn nitơ Nitơ nguồn dinh dưỡng quan trọng A. xylinum. Cũng nguồn carbon, nguồn nitơ đóng vai trò đònh đến khả sinh trưởng phát triển vi sinh vật, đặc biệt trình chuyển hóa tổng hợp cellulose. Nguồn nitơ hữu tốt cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển. Do đó, nguồn nitơ hữu tốt cho A. xylinum tổng hợp cellulose so sánh với nguồn nitơ vô cơ. Với việc thay đổi nguồn nitơ khác nhau, kết cho thấy chủng vi khuẩn A. xylinum nghiên cứu có khả sử dụng nhiều nguồn chất nitơ khác nhau. Với nguồn nitơ tìm thử nghiệm nghiên cứu này, nấm men nguồn nitơ thích hợp cho chủng vi khuẩn A. xylinum phát triển tạo cellulose. Một số nghiên cứu khác cho thấy corn steep liquor (CSL) nguồn nitơ thích hợp để A. xylinum tạo cellulose. Ví dụ, CSL nguồn nitơ thích hợp cho chủng A. xylinus BRC5 (Yang et al., 1998), A. xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996). Cao nấm men nguồn nitơ hữu cơ, thành phần nitơ ra, chứa thành phần dinh dưỡng khác tốt cho vi khuẩn phát triển hỗ trợ tạo thành ATP trình phát triển vi khuẩn (Sakairi et al., 1998) Tóm lại, qua thí nghiệm trên, nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi 37 Chương 4. Kết bàn luận cấy vi khuẩn A. xylinum để thu nhận cellulose mannitol cao nấm men, thí nghiệm sau sử dụng nguồn carbon mannitol nguồn nitơ cao nấm men cho môi trường lên men tổng hợp cellulose. Vấn đề đặt cần phải chọn hàm lượng nguồn carbon nitơ với hàm lượng tốt cho môi trường lên men. Để giải yêu cầu này, cần tiến hành thí nghiệm tiếp theo, tìm điểm tối ưu thí nghiệm. 3.5 Tối ưu hoá nồng độ nguồn carbon nitơ. Nguồn carbon thích hợp mannitol nguồn nitơ thích hợp theo kết thí nghiệm cao nấm men khảo sát với nồng độ khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose hàm lượng đó, từ số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút hàm lượng nguồn carbon nitơ thích hợp cho A. xylinum tổng hợp cellulose. Chuẩn bò môi trường HS, nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ cao nấm men với nồng độ theo mô hình thí nghiệm tối ưu bảng 4.1 4.2. Sau thu kết thí nghiệm, số liệu xử lý theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men. Phương trình hồi quy bậc hai biểu diễn biến động yếu tố ảnh hưởng đến kết thí nghiệm có dạng sau đây: y = bo + ∑b x 1≤ j ≤k j j + ∑b 1≤ j [...]... tài liệu hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dòch và phát triển theo chiều sâu của môi trường Cellulose được tạo ra có dạng vi n hình cầu, elip… Đây là kó thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương... hợp cellulose Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose Bảng 2.1 Các vi. .. sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose 2.1.3.4 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên • Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001) 7 Chương 2 Tổng quan tài liệu • Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum. .. và vi sinh vật gây bệnh…) trong môi trường sống tăng lên • Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV 23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bò chiếu tia UV (Bielecki et al., 2001) 2.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A xylinum 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum Theo Ross et al (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn. .. bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi - Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt - Tính bền cơ tốt, khả năng chòu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao - Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy vi c sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn có thể... ngắn Cellulose dò hình Chưa xác đònh rõ cấu trúc Tham gia vào hầu hết thực vật Không rõ Sự kết bông trong nước thải Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong vi c sản xuất cellulose Đặc biệt là A xylinum vì những đặc điểm ưu vi t của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng… 2.1.3.1 Phân loại A xylinum A xylinum là một vi khuẩn. .. chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bò thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981) 8 Chương 2 Tổng quan tài liệu Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon & Anderson, 1991) 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành... của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000) 2.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000 Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi. .. nitơ Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dòch chiết nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3 Từ khi thành phần môi trường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi khuẩn Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay... Dược trường Đại học Y dược nghiên cứu sản xuất màng trò phỏng bằng màng cellulose vi khuẩn có tẩm dầu mù u và mang lại hiệu quả cao khi sử dụng cho bệnh nhân Một nhóm các nhà khoa học, sinh học và giải phẫu học phát triển sản phẩm là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose) BASYC® là ống sản xuất theo phương pháp tónh được sử dụng thay thế mạch máu Nghiên cứu này bắt nguồn từ cấu trúc mạng sợi siêu . quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum. trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn. 2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 2.1.2.1 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi. ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum dưới điều kiện tónh,