Luận văn: Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Trong trình làm việc với thầy, em học hỏi nhiều điều bổ ích, không kiến thức chuyên môn mà kinh nghiệm làm việc Khi em gặp khó khăn trình thực đề tài, thầy kịp thời hướng dẫn, bảo tận tình Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, lời truyền đạt cô thật bổ ích cho em trình em làm luận văn trường Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô giúp đỡ chúng em mặt hóa chất phục vụ cho việc thực đề tài Em cảm ơn cô Thùy Dương - môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ em nguồn vi sinh vật sử dụng đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt mặt giúp chúng em thực đề tài luận văn tốt nghiệp Tôi muốn bày tỏ cảm ơn đến tất bạn bè tôi, họ giúp đỡ, đặc biệt cho thấy gắn bó, chia sẻ, cảm thông giây phút thư giãn làm việc Tôi xin cảm ơn với tất lòng chân thành Tp HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008 Phan Anh Tuấn i Tóm tắt luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A xylinum) vi khuẩn Gram âm, sản xuất loại polysaccharide ngoại bào gọi cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả ứng dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm lĩnh vực khác Để ứng dụng cellulose vi khuẩn cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi ổn định Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm phát ứng dụng thực tế Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện tĩnh, thực khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum môi trường Hestrin- Schramm (HS) - Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum Để khảo sát sinh tổng hợp cellulose, A xylinum nuôi cấy điều kiện tĩnh môi trường HS điều kiện khác nhằm rút điều kiện nuôi cấy tốt cho chủng A xylinum có sẵn Khảo sát ảnh hưởng pH trình tạo cellulose vi khuẩn A xylinum tiến hành thấy rằng, khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose chủng A xylinum thích hợp nhất, lượng cellulose đạt ~5,2 gl-1 Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon cách thay đổi nguồn carbon thành phần môi trường nuôi cấy, chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum sinh tổng hợp cellulose mannitol Lượng cellulose đạt ~7,4 gl-1 Để chọn nguồn nitơ tốt cho tổng hợp cellulose, thí nghiệm thực với nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ thay đổi, kết cho thấy cao nấm men cho kết tạo cellulose tốt Lượng cellulose đạt ~8 gl-1 g Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời mannitol cao nấm men lên trình tổng hợp cellulose A xylinum, hàm lượng cellulose thu đạt ~8,5 gl-1 thành phần môi trường HS điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 hàm lượng cao nấm men 6,5 gl-1, pH môi trường chỉnh xung quanh giá trị 5,0 Với kết thu thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum có Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm thành phần sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH điều chỉnh 5,0 thích hợp cho ii Tóm tắt luận văn trình nuôi cấy Các kết quả thí nghiệm cung cấp thông tin hữu ích cho phát triển khả sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô công nghiệp iii Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose .6 2.2 SINH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A XYLINUM 10 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose A xylinum 10 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 11 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose .13 2.3 ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 24 2.3.1 Thực phẩm 24 2.3.2 Y học 25 2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 25 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 3.1 NGUYÊN LIỆU 28 3.1.1 Chủng vi sinh vật 28 3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28 3.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM .29 3.2.1 Khảo sát trình nhân giống 29 3.2.2 Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose 30 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum 30 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum .31 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum 31 3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 33 3.3.1 Số lượng vi khuẩn 33 iv Mục lục 3.3.2 3.3.3 Hiệu suất cellulose 33 Phân tích thống kê .34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 4.1 4.2 4.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A XYLINUM 35 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 36 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 38 4.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 40 4.4.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 40 4.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 43 4.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 5.2 KẾT LUẬN 49 ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC .55 v Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc cellulose vi khuẩn Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) cellulose thực vật (b) Hình 2.3: SEM A xylinum Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose A xylinum .11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose môi trường từ A xylinum 13 Hình 2.7: Cellulose tạo thành điều kiện nuôi cấy tĩnh có khuấy đảo 15 Hình 2.8: Cấu trúc điều kiện nuôi cấy tĩnh nuôi cấy có khuấy đảo 16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng A xylinum 35 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu giá trị pH ngày lên men thứ 4, 5, 6, 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu nguồn nitơ thay đổi 44 vi Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC Ag-BC 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC Ag-BC A xylinum IFO 13693 17 Bảng 2.4: Aûnh hưởng nguồn carbon lên tổng hợp cellulose 23 Bảng 2.5: Các ứng dụng nhiều lĩnh vực cellulose vi khuẩn 26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon nguồn nitơ 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34 Bảng 4.1: Bảng kết thí nghiệm tối ưu 47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47 vii Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) - A xylinum: Acetobacter xylinum - A xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose - cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance - PGI: Phosphoglucoisomerase - PGM: Phosphoglucomutase viii Danh mục viết tắt - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy tĩnh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao nấm men ix Chương Mở đầu Chương 1: MỞ ĐẦU Cellulose hợp chất hóa học thường biết đến với vai trò khung xương quan trọng thể thực vật Không cellulose tổng hợp thực vật, mà cellulose tổng hợp nên vi sinh vật, với tên gọi cellulose vi khuẩn Một loài vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose tốt A xylinum Cellulose vi khuẩn ngày quan tâm nhiều khả ứng dụng rộng rãi nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng nghiên cứu, cải tiến nhà khoa học giới (Otomo et al., 2000) Trong công nghệ đồ uống thực phẩm, cellulose vi khuẩn ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, ứng dụng cellulose vi khuẩn phát gần khả ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật hiệu (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993) Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, phù hợp với tính chất ứng dụng Nhiều kết nghiên cứu cho thấy nuôi cấy điều kiện có khuấy đảo hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum cao nuôi cấy tĩnh Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu phải dạng màng Với mục đích đó, thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu kết hữu ích cho nghiên cứu tương lai Trong nội dung thực hiện, tập trung khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS - Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum môi trường HS - Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum Chương Kết bàn luận 1.10 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum 1.10.1 Ảnh hưởng nguồn carbon Để khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, A xylinum nuôi cấy môi trường HS với nguồn carbon khác nhau: glucose, mannitol, sucrose, fructose Sau ngày lên men nhiệt độ 280C, cellulose thu nhận xử lý, phân tích hiệu suất Sau ngày lên men, chiều dày lớp cellulose thu trường hợp môi trường có nguồn carbon mannitol xấp xỉ chiều cao lớp dịch môi trường ban đầu Đây coi lượng cellulose lớn thu trình lên men so với nguồn carbon khác (P < 0,05) Khối lượng cellulose đạt 7,6 ± 0,4 gl-1 (hình 4.4) Mặt khác, cellulose ướt tạo thành có cấu trúc đều, bề mặt nhẵn, khối cellulose chắc, hiệu suất thu cellulose sau sấy khô cao Glucose nguồn carbon cho kết tạo cellulose mức trung bình, hiệu suất tổng hợp cellulose ổn định, lượng cellulose đạt ~5,7 ± 0,5 gl-1 Hai nguồn carbon khác fructose sucrose không thích hợp với chủng vi khuẩn A xylinum nên khả sử dụng hai nguồn carbon Lượng cellulose đạt khoảng 3,5 gl-1 Bằng việc thay đổi nguồn carbon sử dụng, kết cho thấy chủng vi khuẩn sử dụng nhiều loại chất khác nguồn carbon khác có thích hợp cho khả tạo cellulose chủng vi khuẩn khác Mỗi chủng vi sinh vật A xylinum khác thích hợp với nguồn carbon khác nhau, tùy chủng vi sinh vật mà nguồn carbon thay đổi để sử dụng cho phù hợp, từ tạo hiệu suất tổng hợp cellulose cao Kết cho thấy sai khác khả sử dụng nguồn chất carbon chủng vi khuẩn A xylinum so với chủng A xylinum nghiên cứu Chẳng hạn, với kết này, chủng vi khuẩn A xylinum sử dụng thí nghiệm sử dụng nguồn chất carbon thích hợp mannitol, không giống kết mà Masaoka et al (1993) đạt được, kết ông cho thấy rằng, glucose nguồn carbon thích hợp cho tạo thành cellulose vi khuẩn A xylinum IFO 13693, lượng cellulose đạt lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau - ngày lên men Matsuoka et al (1996) thấy fructose nguồn carbon thích hợp cho A xylinum BPR2001 Fructose xem nguồn carbon tốt cho A xylinum E22 tổng hợp cellulose (Krystynowicz et al., 2002) 38 Chương Kết bàn luận Tuy nhiên, kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Oikawa et al (1995) với vi khuẩn A xylinum Ku-1, hàm lượng cellulose tổng hợp A xylinum Ku-1 sử dụng nguồn chất mannitol cao lần so với sử dụng chất glucose Hutchens et al (2006) với chủng A xylinum hansenii, kết ông thấy mannitol nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum tổng hợp cellulose Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi Trong trình tổng hợp cellulose, oxy hóa glucose xảy cung cấp cho trình trao đổi chất điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm, cần giảm thiểu trình thất thoát glucose trình oxy hóa Có thể giảm oxy hóa glucose cách thêm ethanol hay glycerol vào môi trường nuôi cấy nguồn điện tử dồi nhằm tăng khả sử dụng chất carbon cho mục đích tạo cellulose, từ tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose (Park et al., 2003) Mannitol, polyol, cung cấp điện tử cho trao đổi chất vi khuẩn kích thích tạo thành cellulose tốt so với glucose, điều báo cáo nghiên cứu Brown et al (1986) Khi môi trường cung cấp nguồn carbon mannitol, acid hóa không xảy trình nuôi cấy, điều phù hợp với đường trao đổi chất vi khuẩn sử dụng mannitol, mannitol A xylinum chuyển hóa thành fructose (Matsushita et al., 2003), sau oxy hóa tiếp thành 5-keto-d-fructose trước hấp thu (Mowshoitz et al., 1973) Với việc hạn chế tạo thành acid, glucose bị tổn thất, lượng cellulose tạo thành cao 39 Chương Kết bàn luận Khi yếu tố môi trường khác giữ cố định, thay đổi nguồn carbon, chủng A xylinum sử dụng nghiên cứu này, mannitol nguồn carbon thích hợp cho khả tạo cellulose vi khuẩn 1.10.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Sau chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum có để tổng hợp cellulose, khảo sát nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose Cũng chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon giữ cố định manitol nguồn nitơ thay đổi: cao nấm men, cao thịt, peptone, (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4, nuôi 280C, thời gian ngày Kết cho thấy, lấy tryptone làm nguồn nitơ tổng hợp cellulose yếu, không đáng kể (0,5 ± 0,1 gl-1) Chứng tỏ chủng vi khuẩn A xylinum thí nghiệm này, nguồn nitơ không phù hợp cho chúng sinh tổng hợp cellulose Hai hợp chất khác dùng làm nguồn nitơ thí nghiệm (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4, lượng cellulose thu cao tryptone hiệu suất tạo cellulose thấp, đạt 2,5 ± 0,6 gl-1 2,3 ± 0,6 gl-1 Đối với peptone, trọng lượng cellulose tạo mức trung bình (4,7 ± 0,3 gl-1), đđiều cho thấy peptone nguồn nitơ phù hợp cho chủng A xylinum (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4 (P < 0,05) Khi nguồn nitơ thay cao nấm men peptone với tỉ lệ 5:3 cao thịt khả tạo cellulose vi khuẩn tăng lên đáng kể, đạt tương ứng 6,8 ± 0,5 gl-1 6,1 ± 0,5 gl-1 Lượng cellulose đạt cao sử dụng nguồn nitơ cao nấm men (8,1 ± 0,8 gl-1) Điều cho phép kết luận rằng, chủng vi khuẩn A xylinum khảo sát nguồn nitơ tốt môi trường lên men để tạo cellulose cao nấm men 40 Chương Kết bàn luận Các kí hiệu: YE + Pep – Cao nấm men peptone YE - Cao nấm men Pep – Peptone Tryp – Tryptone ME – Cao thịt Hình 4.5: Trọng luợng cellulose thu thay đổi nguồn nitơ Nitơ nguồn dinh dưỡng quan trọng A xylinum Cũng nguồn carbon, nguồn nitơ đóng vai trò định đến khả sinh trưởng phát triển vi sinh vật, đặc biệt trình chuyển hóa tổng hợp cellulose Nguồn nitơ hữu tốt cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Do đó, nguồn nitơ hữu tốt cho A xylinum tổng hợp cellulose so sánh với nguồn nitơ vô Với việc thay đổi nguồn nitơ khác nhau, kết cho thấy chủng vi khuẩn A xylinum nghiên cứu có khả sử dụng nhiều nguồn chất nitơ khác Với nguồn nitơ tìm thử nghiệm nghiên cứu này, nấm men nguồn nitơ thích hợp cho chủng vi khuẩn A xylinum phát triển tạo cellulose Một số nghiên cứu khác cho thấy corn steep liquor (CSL) nguồn nitơ thích hợp để A xylinum tạo cellulose Ví dụ, CSL nguồn nitơ thích hợp cho chủng A xylinus BRC5 (Yang et al., 1998), A xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996) Cao nấm men nguồn nitơ hữu cơ, thành phần nitơ ra, chứa thành phần dinh dưỡng khác tốt cho vi khuẩn phát triển hỗ trợ tạo thành ATP trình phát triển vi khuẩn (Sakairi et al., 1998) 41 Chương Kết bàn luận Tóm lại, qua thí nghiệm trên, nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum để thu nhận cellulose mannitol cao nấm men, thí nghiệm sau sử dụng nguồn carbon mannitol nguồn nitơ cao nấm men cho môi trường lên men tổng hợp cellulose Vấn đề đặt cần phải chọn hàm lượng nguồn carbon nitơ với hàm lượng tốt cho môi trường lên men Để giải yêu cầu này, cần tiến hành thí nghiệm tiếp theo, tìm điểm tối ưu thí nghiệm 1.11 Tối ưu hoá nồng độ nguồn carbon nitơ Nguồn carbon thích hợp mannitol nguồn nitơ thích hợp theo kết thí nghiệm cao nấm men khảo sát với nồng độ khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose hàm lượng đó, từ số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút hàm lượng nguồn carbon nitơ thích hợp cho A xylinum tổng hợp cellulose Chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ cao nấm men với nồng độ theo mô hình thí nghiệm tối ưu bảng 4.1 4.2 Sau thu kết thí nghiệm, số liệu xử lý theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men Phương trình hồi quy bậc hai biểu diễn biến động yếu tố ảnh hưởng đến kết thí nghiệm có dạng sau đây: y  bo  b 1 j  k j xj  b 1 j  l  k jl x j xl  b 1 j  k jj x 2j Trong đó: y – khối lượng cellulose khô (g) x1 , x2 - yếu tố ảnh hưởng b - hệ số phương trình hồi quy Bảng 4.1: Bảng kết thí nghiệm tối ưu TN Biến x1 y x2 42 Chương Kết bàn luận 0,737 -1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 0 10 0 0,820 11 0 0,791 0,793 0,801 0,733 0,807 0,817 0,807 0,713 0,811 Bảng 4.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát Kí hiệu Nguồn carbon Nguồn nitơ x1 (gl-1) x2 (gl-1) 25 -1 20 +1 30 10 Trong thí nghiệm này, số lượng yếu tố cần tối ưu yếu tố, hàm lượng nguồn carbon (mannitol – x1) hàm lượng nguồn nitơ (cao nấm men - x2) Các yếu tố khác giữ không thay đổi Sau hoàn thành thí nghiệm, số liệu xử lý thống kê xác định hệ số phương trình hồi quy 43 Chương Kết bàn luận Các hệ số phương trình hồi quy kiểm tra tính ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student với t0.05(2) = 2,12 loại hệ số ý nghĩa thống kê Sau bỏ hệ số không ý nghĩa, loại hệ số b1 biến x1 b11 biến x12, phương trình hồi quy thu sau: y  0,83  0,0572x2  0,0522x1 x2  0,0572x22 Phương trình hồi quy kiểm tra tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher (F) Kiểm tra hệ số F với giá trị F0,05(f1, f2) f1, f2 tương ứng bậc tự do, f1 = 7; f2 = Sau kiểm tra tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm cho thấy Ftính = 3,7 , F0,05 (7;2)= 4,7 Như phương trình tương thích với thực nghiệm Chuyển phương trình hồi quy thu (dạng mã hóa) dạng phương trình hệ trục tự nhiên Ta phương trình sau: y*  0,746  0,021x1  0,115 x2  0,0026 x1 x2  0,0131x22 Tối ưu hóa thực nghiệm thực phương pháp đường dốc nhất, điểm không, mức sở: x1 = 15 x2 = Chọn bước chuyển động yếu tố x2   0,5 , suy bước chuyển động yếu tố x1   0,5 Sau khảo sát giá trị thực nghiệm tối ưu hóa theo phương trình hồi quy cho thấy vị trí x1 = 15,5 gl-1; x2 = 6,5 gl-1 cho hiệu suất sinh tổng hợp cellulose cao nhất, y* = 8,76 gl-1 Đó điểm tối ưu thỏa mãn yêu cầu thí nghiệm Để kiểm tra sai lệch lý thuyết thực nghiệm, thí nghiệm nuôi cấy thu nhận cellulose với thành phần môi trường lên men điều kiện tối ưu lý thuyết Kết cho thấy hiệu suất thu nhận cellulose không đạt lý thuyết, nhiên điều kiện đó, lượng cellulose thu cao điều kiện khác Lượng cellulose đạt ~8,3 gl-1 Như vậy, kết lý thuyết thu có chênh lệch so với thực tế (5,5%), nhiên chênh lệch chấp nhận Mannitol polyol, vừa đóng vai trò chất cho tổng hợp cellulose, vừa nguồn lượng cho sản sinh ATP, giúp tế bào tăng trưởng tăng khả tạo thành cellulose (Naritomi et al., 1998) Với nồng độ mannitol 15,5 gl-1, nồng độ cao nấm men 6,5 44 Chương Kết bàn luận gl-1, lượng cellulose thu đạt ~8,7 gl-1 Tuy nhiên, nồng độ mannitol cao 16 gl-1 nồng độ cao nấm men cao 6,5 gl-1 lại không làm tăng lượng cellulose tạo thành mà ngược lại, lượng cellulose tạo lại có xu hướng giảm nồng độ mannitol cao Điều phù hợp với kết nghiên cứu số tác giả khác, chẳng hạn Masaoka et al (1993), Oikawa et al (1995), hay S.A Hutchens et al (2006) Điều giải thích ức chế A xylinum nồng độ chất cao Như vậy, qua thí nghiệm thực hiện, lượng cellulose tổng hợp tốt với môi trường hoá học, lượng cellulose đạt ~8,3 gl-1 A xylinum nuôi cấy điều kiện môi trường gồm có 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; gl-1 Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; pH nhiệt độ 280C 45 Tài liệu tham khảo Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.12 Kết luận Như vậy, khảo sát trình sinh trưởng chủng vi khuẩn A xylinum cung cấp phòng thí nghiệm Sinh học, giữ giống 4oC môi trường có thành phần dinh dưỡng tự nhiên mà thành phần có bổ sung nước dừa, cho thấy chủng A xylinum có khả sinh trưởng tốt môi trường hoá học Kết khảo sát cho thấy rằng, chủng A xylinum có khả sinh tổng hợp cellulose tốt môi trường hoá học hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum bị tác động nhiều yếu tố điều kiện nuôi cấy môi trường nuôi cấy, có pH, nguồn carbon nguồn nitơ Có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum cách tác động đến yếu tố ảnh hưởng Cụ thể, chọn pH cho môi trường nuôi cấy thích hợp, loại nguồn carbon, loại nguồn nitơ thích hợp đồng thời chọn nồng độ nguồn carbon nitơ tối ưu cho trình sinh tổng hợp cellulose A xylinum Ví dụ, điều kiện nuôi cấy điều chỉnh sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; gl-1 Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; pH nhiệt độ 280C 1.13 Đề nghị Một số yếu tố khác tác động đến khả tạo cellulose A xylinum chưa khảo sát luận văn này: nguồn chất khác, chủng vi sinh vật khác, điều kiện nuôi cấy có bổ sung oxy, khả tạo cellulose chủng A xylinum đột biến … Vì thế, số đề nghị nghiên cứu sau: - Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất khác nhằm tìm nguồn chất hiệu mà rẻ tiền, giảm chi phí sản xuất - Khảo sát khả tạo cellulose chủng A xylinum khác để tìm nguồn giống vi sinh vật tốt - Khảo sát tính chất vật lý hóa học sản phẩm cellulose tạo thành điều kiện nuôi cấy tĩnh nhằm nâng cao tính chất cần thiết cho việc ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật thực phẩm - Nghiên cứu thêm khả ứng dụng cellulose vi khuẩn thực phẩm sinh học: màng bao thực phẩm chống vi sinh vật, cố định vi sinh vật, thực phẩm chức … 46 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Bae, S., Sugano, Y & Shoda, M (2004) Improvement of becterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor Journal of Bioscience and Bioengineering 97: 33-38 Bielecki, S., Krystynowicz, A Turkiewicz, M Kalinowska, H (2001) Bacterial cellulose Institute of Technical Biochemistry, Technical Chemistry of Lódz, Stefanowskiego: 37-46 Brown, R.M., Willison, J.H & Richarson, C.L (1986) Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum - Visualization of site of synthesis and direct measurement of in vivo process Proceeding of the National Academic of Sciences of the United States of America 73: 4565 - 4569 Chao, Y., Ishida, Sugano, Y & Shoda, M (2000) Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50L internal-loop airlift reactor Biotechnol Bioeng 68: 345– 352 Chao, Y.P., Sugano Y., Kouda, T., Yoshinaga, F., Shoda, M (1997) Production of Bacterial cellulose by Acetobacter xylinum with an air lift reactor Biotechnology Techniques 11: 829-832 El-Saied, H., Basta, A.H., & Gobran, R.H (2004) Research progress in friendly invironmental technology for the production of cellulose products (bacterial and its application) Polymer-plastic Technology and Engineering 43: 797-820 DeWulf, P., Joris., & Vandamme, K (1996) Improved cellulose formation by an Acetobacter xylinum mutant limited In (Keto)Gluconate synthesis Journal of Chemical Technology and Biotechnology 67: 376-380 Galas, E., Kristynowicz, A Tarabasz - Szymanska (1999) Optimization of the production of Bacterial cellulose using multivariable linear regression analysis Biotechnology 19: 251260 George, J., Ramana, K.V., Sabapathy, S.N., Bawa, A.S (2005) Physico-mechanical properties of chemically treated bacterial (Acetobacter xylinum) cellulose membrane Microbiology and Biotechnology 21: 1323-1327 Gindl, W., Keckes, J (2004) Tensile properties of cellulose acetate butyrate composites reinforce with bacterial cellulose Composites science and Technology 64: 2407-2413 Hai Peng, C (2002) Cultivation af Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor Biotechnol Appl Biochem: 25-132 47 Tài liệu tham khảo Hestrin, S., & Schramm, M (1954) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose Biochem J 58: 345–352 Hwang, J.W., Hwang, J.K., Pyun, Y R., Kim, Y.S (1999) Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture J Ferment Bioeng 88: 183–188 Iguchi, M., Yamanaka, S., Budhiono, A (2000) “Bacterial cellulose - a masterpiece of nature's arts,” Journal Of Materials Science 35 (2): 261-270 Jonas, R.F., Luiz (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability 59: 101-106 Klemm D., Udhardt, U., Marsch, S.P (2001) Bacterial cellulose - artificial blood vessels for microsurgery Progress in Polymer Science 26: 1561-1603 Klemm, C (2006) Influence of protective agents for preservation of Gluconacetobacter xylinus on its cellulose production Cellulose 13: 485 –492 Krystynowicz, A., Czaja, W., Wiktorowska-Jezierska, M., Goncalves-Miskiewicz, M., Turkiewicz and Bielecki, S (2002) Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 189 – 195 Lê Văn Việt Mẫn & Lại Mai Hương (2006) Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm Nhà xuất Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Masaoka, S (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum Journal of fermentation and bioengineering 75: 18-22 Nguyễn Cảnh (2004) Quy hoạch thực nghiệm Nhà xuất Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Diễm Chi, Hoàng Tuyền Yến Linh Nguyễn Vũ Thanh (2002) Nghiên cứu nuôi cấy Acetobacter xylinum làm màng sinh học trị tổn thương da Y học Tp.HCM 6: 139-141 Nguyễn Thúy Hương (2006) Tuyển chọn cải thiện chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất ứng dụng quy mô pilot Luận án tiến sĩ 48 Tài liệu tham khảo Naritomi, T., Kouda, T., Yano, H., Yoshinaga, F (1998) Effect of ethanol on Bacterial cellulose production from fructose in continous culture Fermentation and Bioengineer 85: 598-603 Sakairi, N., Asano, M., Ogawa., Nishi, N., & Tokura, S (1998) A method for direct harvest of bacterial cellulose filaments during continuous cultivation of Acetobacter xylinum Carbohydrate Polymers 35: 233–237 Schramm, M., & Hestrin, S (1954) Factors affecting production of cellulose at the air liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum Journal of Genneral Microbiology 11: 123 – 129 Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G., Lee, S.J (2001) Optimization of fermentation conditions for the production of Bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking cultures Biotechnology and Applied Biochemistry 33: 1-5 Toda, K., Asukua, T (1997) Cellulose production by acid acetic-resistant Acetobacter xylinum Fermentation and Bioengineering 84: 228-231 Vandamme, E.J., De Baets, S., Vanbaelen, A., Joris, K & De Wulf, P (1998) Improved production of bacterial cellulose and its application potential Polymer Degradation and Stability 59: 93-99 Watanabe K., T.M., Morinaga Y., Yoshinaga F (1998) Structure features and properties of Bacterial cellulose produced in agitated culture Cellulose 5: 187-200 Yang, L.Z (2007) Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum J Ind Microbiol Biotechnol 34: 483–489 Yang, Y.K (1998) Cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 under agitated condition Fermentation and Bioengineering 85: 312-317 Yoshinaga, T.T (1997) Production of Bacterial cellulose by agitation culture systems Pure and application chemistry 69: 2453-2458 Zou, K., Wu, S.C., Wu, W.T (2006) A hybrid model combining hydrodynamic and biological effects of bacterial cellulose with a pilot scale airlift reactor Biochemical Engineer 29: 81-90 49 Tài liệu tham khảo 50 Phụ lục PHỤ LỤC Các công thức sử dụng để tính toán thí nghiệm: Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: y  bo  b x j 1 j  k j  b 1 j l  k jl x j xl   b jj x 2j 1 j  k Trong đó: b hệ số Số hệ số phương trình hồi quy tính theo công thức: m  k   Ck2  k  1k  2 Trong đó, m số hệ số phương trình, k số yếu tố ảnh hưởng Tính toán hệ số phương trình: N bj  N  x ji yi i 1 N x i 1 b jl  ji N  ( x j xl )i yi i 1 N b jj   (x x ) j l i i 1 x i 1 N ' ji  (x i 1 yi ' ji ) Phương sai hệ số: sb2j  sth2 N x i 1 sb2jl  ji sth2 N sb jj   (x x ) i 1 j l i sth2 N  (x i 1 ' ji ) Kiểm tra tính ý nghía hệ số phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student, so sánh ttính với ttra sb j  sth tj  bj sb k  2 Kiểm tra tương thích với thực nghiệm phương trình hồi quy tiêu chuẩn Fisher, so sánh Ftính với Ftra j F tính theo công thức: sdu F sth Trong đó: N sdu  (y i 1 i  yˆ i ) N l N sth2  s i 1 i N 51 Phụ lục N số thí nghiệm, l số hệ số phương trình hồi quy, si phương sai thí nghiệm, y khối lượng cellulose thí nghiệm 52 [...]... khí oxy hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong tồn dung dịch và phát triển theo chiều sâu của mơi trường Cellulose được tạo ra có dạng vi n hình cầu, elip… Đây là kĩ thuật ni cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương... trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa Từ đó đến nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn 1.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 1.1.2.1 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp... định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986) Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn Đầu tiên, Hestrin et al (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ơng đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose. .. được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào q trình sinh tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm sốt các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001) 1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose Cellulose vi khuẩn được nhiều lồi vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A xylinum được biết đến... thải Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong vi c sản xuất cellulose Đặc biệt là A xylinum vì những đặc điểm ưu vi t của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng… 1.1.3.1 Phân loại A xylinum A xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,... 1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al (1986) Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ơng lúc đó khối rắn này khơng nằm trong các kết quả nghiên cứu ơng dự định... hợp cellulose của A xylinum - Tối ưu hố thành phần mơi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thơng tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mơ cơng nghiệp 2 Chương 2 Tổng quan tài liệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose. .. của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000) 1.1.2.2 Mức độ polymer hố (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hố khác nhau DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000 Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn. .. tinh thể tốt - Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao - Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy vi c sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn khơng cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ 5... vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột biến khơng có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981) Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon & Anderson, 1991) 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Q trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành hai giai đoạn ... 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh...Tóm tắt luận văn TĨM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A xylinum) vi khuẩn Gram âm, sản xuất loại polysaccharide ngoại bào gọi cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả ứng dụng... ứng dụng thực tế Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum điều kiện tĩnh, chúng tơi