LUẬN án TS nghien cuu san xuat cellulose vi khuan tu acetobacter

Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Trong trình làm việc với thầy, em học hỏi nhiều điều bổ ích, không kiến thức chuyên môn mà kinh nghiệm làm việc Khi em gặp khó khăn trình thực đề tài, thầy kịp thời hướng dẫn, bảo tận tình Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, lời truyền đạt cô thật bổ ích cho em trình em làm luận văn trường Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô giúp đỡ chúng em mặt hóa chất phục vụ cho việc thực đề tài Em cảm ơn cô Thùy Dương - môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ em nguồn vi sinh vật sử dụng đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt mặt giúp chúng em thực đề tài luận văn tốt nghiệp Tôi muốn bày tỏ cảm ơn đến tất bạn bè tôi, họ giúp đỡ, đặc biệt cho thấy gắn bó, chia sẻ, cảm thông giây phút thư giãn làm việc Tôi xin cảm ơn với tất lòng chân thành Tp HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008 Phan Anh Tuấn i Tóm tắt luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A xylinum) vi khuẩn Gram âm, sản xuất loại polysaccharide ngoại bào gọi cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả ứng dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm lĩnh vực khác Để ứng dụng cellulose vi khuẩn cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi ổn định Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm phát ứng dụng thực tế Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện tĩnh, thực khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum môi trường Hestrin- Schramm (HS) - Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum Để khảo sát sinh tổng hợp cellulose, A xylinum nuôi cấy điều kiện tĩnh môi trường HS điều kiện khác nhằm rút điều kiện nuôi cấy tốt cho chủng A xylinum có sẵn Khảo sát ảnh hưởng pH trình tạo cellulose vi khuẩn A xylinum tiến hành thấy rằng, khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose chủng A xylinum thích hợp nhất, lượng cellulose đạt ~5,2 gl-1 Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon cách thay đổi nguồn carbon thành phần môi trường nuôi cấy, chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum sinh tổng hợp cellulose mannitol Lượng cellulose đạt ~7,4 gl -1 Để chọn nguồn nitơ tốt cho tổng hợp cellulose, thí nghiệm thực với nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ thay đổi, kết cho thấy cao nấm men cho kết tạo cellulose tốt Lượng cellulose đạt ~8 gl -1 g Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời mannitol cao nấm men lên trình tổng hợp cellulose A xylinum, hàm lượng cellulose thu đạt ~8,5 gl -1 thành phần môi trường HS điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 hàm lượng cao nấm men 6,5 gl -1, pH môi trường chỉnh xung quanh giá trị 5,0 Với kết thu thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum có Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm thành phần sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH điều chỉnh 5,0 thích hợp cho ii Tóm tắt luận văn trình nuôi cấy Các kết quả thí nghiệm cung cấp thông tin hữu ích cho phát triển khả sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô công nghiệp iii Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC VIẾT TẮT .viii BẢNG 4.2: BẢNG MÃ HOÁ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CẦN KHẢO SÁT 47 VII CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 1.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 1.2 SINH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A XYLINUM 10 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose A xylinum 10 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 10 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose 13 1.3 ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 23 1.3.1 Thực phẩm 23 1.3.2 Y học 24 1.3.3 Các ngành công nghiệp khác .24 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU .27 VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 1.4 NGUYÊN LIỆU 27 1.4.1 Chủng vi sinh vật 27 1.4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 27 1.5 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 28 1.5.1 Khảo sát trình nhân giống .28 1.5.2 Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose 29 1.5.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum .29 1.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum .30 1.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời nguồn carbon nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum .30 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 32 1.6.1 Số lượng vi khuẩn 32 1.6.2 Hàm lượng cellulose .32 1.6.3 Phân tích thống kê .32 iv Mục lục CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 1.7 KHẢO 1.8 KHẢO 1.9 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A XYLINUM 33 SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 34 SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 36 1.10 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 38 1.10.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 38 1.10.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 40 1.11 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 42 BẢNG 4.1: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM TỐI ƯU 42 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 1.12 KẾT LUẬN 1.13 ĐỀ NGHỊ 46 46 v Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc cellulose vi khuẩn Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) cellulose thực vật (b) Hình 2.3: SEM A xylinum Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose A xylinum .11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose môi trường từ A xylinum 13 Hình 2.7: Cellulose tạo thành điều kiện nuôi cấy tĩnh có khuấy đảo 15 Hình 2.8: Cấu trúc điều kiện nuôi cấy tĩnh nuôi cấy có khuấy đảo 16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng A xylinum 35 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu giá trị pH ngày lên men thứ 4, 5, 6, 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu nguồn nitơ thay đổi 44 vi Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC Ag-BC 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC Ag-BC A xylinum IFO 13693 17 Bảng 2.4: Aûnh hưởng nguồn carbon lên tổng hợp cellulose .23 Bảng 2.5: Các ứng dụng nhiều lĩnh vực cellulose vi khuẩn 26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon nguồn nitơ 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34 Bảng 4.1: Bảng kết thí nghiệm tối ưu .47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47 vii Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) - A xylinum: Acetobacter xylinum - A xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose - cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance - PGI: Phosphoglucoisomerase viii Danh mục viết tắt - PGM: Phosphoglucomutase - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy tĩnh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao nấm men ix Chương Mở đầu Chương 1: MỞ ĐẦU Cellulose hợp chất hóa học thường biết đến với vai trò khung xương quan trọng thể thực vật Không cellulose tổng hợp thực vật, mà cellulose tổng hợp nên vi sinh vật, với tên gọi cellulose vi khuẩn Một loài vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose tốt A xylinum Cellulose vi khuẩn ngày quan tâm nhiều khả ứng dụng rộng rãi nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng nghiên cứu, cải tiến nhà khoa học giới (Otomo et al., 2000) Trong công nghệ đồ uống thực phẩm, cellulose vi khuẩn ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, ứng dụng cellulose vi khuẩn phát gần khả ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật hiệu (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993) Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, phù hợp với tính chất ứng dụng Nhiều kết nghiên cứu cho thấy nuôi cấy điều kiện có khuấy đảo hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum cao nuôi cấy tĩnh Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu phải dạng màng Với mục đích đó, thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu kết hữu ích cho nghiên cứu tương lai Trong nội dung thực hiện, tập trung khảo sát yếu tố sau: - Khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum môi trường HS - Khảo sát ảnh hưởng pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum môi trường HS - Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose A xylinum Chương Kết bàn luận Tuy nhiên, kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Oikawa et al (1995) với vi khuẩn A xylinum Ku-1, hàm lượng cellulose tổng hợp A xylinum Ku-1 sử dụng nguồn chất mannitol cao lần so với sử dụng chất glucose Hutchens et al (2006) với chủng A xylinum hansenii, kết ông thấy mannitol nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum tổng hợp cellulose Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu nguồn carbon thay đổi Trong trình tổng hợp cellulose, oxy hóa glucose xảy cung cấp cho trình trao đổi chất điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm, cần giảm thiểu trình thất thoát glucose trình oxy hóa Có thể giảm oxy hóa glucose cách thêm ethanol hay glycerol vào môi trường nuôi cấy nguồn điện tử dồi nhằm tăng khả sử dụng chất carbon cho mục đích tạo cellulose, từ tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose (Park et al., 2003) Mannitol, polyol, cung cấp điện tử cho trao đổi chất vi khuẩn kích thích tạo thành cellulose tốt so với glucose, điều báo cáo nghiên cứu Brown et al (1986) Khi môi trường cung cấp nguồn carbon mannitol, acid hóa không xảy trình nuôi cấy, điều phù hợp với đường trao đổi chất vi khuẩn sử dụng mannitol, mannitol A xylinum chuyển hóa thành fructose (Matsushita et al., 2003), sau oxy hóa tiếp thành 5-keto-d-fructose trước hấp thu (Mowshoitz et al., 1973) Với việc hạn chế tạo thành acid, glucose bị tổn thất, lượng cellulose tạo thành cao 39 Chương Kết bàn luận Khi yếu tố môi trường khác giữ cố định, thay đổi nguồn carbon, chủng A xylinum sử dụng nghiên cứu này, mannitol nguồn carbon thích hợp cho khả tạo cellulose vi khuẩn 1.10.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Sau chọn nguồn carbon thích hợp cho chủng A xylinum có để tổng hợp cellulose, khảo sát nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose Cũng chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon giữ cố định manitol nguồn nitơ thay đổi: cao nấm men, cao thịt, peptone, (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4, nuôi 280C, thời gian ngày Kết cho thấy, lấy tryptone làm nguồn nitơ tổng hợp cellulose yếu, không đáng kể (0,5 ± 0,1 gl-1) Chứng tỏ chủng vi khuẩn A xylinum thí nghiệm này, nguồn nitơ không phù hợp cho chúng sinh tổng hợp cellulose Hai hợp chất khác dùng làm nguồn nitơ thí nghiệm (NH 4)2SO4 (NH4)2HPO4, lượng cellulose thu cao tryptone hiệu suất tạo cellulose thấp, đạt 2,5 ± 0,6 gl-1 2,3 ± 0,6 gl-1 Đối với peptone, trọng lượng cellulose tạo mức trung bình (4,7 ± 0,3 gl -1), đđiều cho thấy peptone nguồn nitơ phù hợp cho chủng A xylinum (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4 (P < 0,05) Khi nguồn nitơ thay cao nấm men peptone với tỉ lệ 5:3 cao thịt khả tạo cellulose vi khuẩn tăng lên đáng kể, đạt tương ứng 6,8 ± 0,5 gl -1 6,1 ± 0,5 gl-1 Lượng cellulose đạt cao sử dụng nguồn nitơ cao nấm men (8,1 ± 0,8 gl-1) Điều cho phép kết luận rằng, chủng vi khuẩn A xylinum khảo sát nguồn nitơ tốt môi trường lên men để tạo cellulose cao nấm men 40 Chương Kết bàn luận Các kí hiệu: YE + Pep – Cao nấm men peptone YE - Cao nấm men Tryp – Tryptone Pep – Peptone ME – Cao thịt Hình 4.5: Trọng luợng cellulose thu thay đổi nguồn nitơ Nitơ nguồn dinh dưỡng quan trọng A xylinum Cũng nguồn carbon, nguồn nitơ đóng vai trò định đến khả sinh trưởng phát triển vi sinh vật, đặc biệt trình chuyển hóa tổng hợp cellulose Nguồn nitơ hữu tốt cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Do đó, nguồn nitơ hữu tốt cho A xylinum tổng hợp cellulose so sánh với nguồn nitơ vô Với việc thay đổi nguồn nitơ khác nhau, kết cho thấy chủng vi khuẩn A xylinum nghiên cứu có khả sử dụng nhiều nguồn chất nitơ khác Với nguồn nitơ tìm thử nghiệm nghiên cứu này, nấm men nguồn nitơ thích hợp cho chủng vi khuẩn A xylinum phát triển tạo cellulose Một số nghiên cứu khác cho thấy corn steep liquor (CSL) nguồn nitơ thích hợp để A xylinum tạo cellulose Ví dụ, CSL nguồn nitơ thích hợp cho chủng A xylinus BRC5 (Yang et al., 1998), A xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996) Cao nấm men nguồn nitơ hữu cơ, thành phần nitơ ra, chứa thành phần dinh dưỡng khác tốt cho vi khuẩn phát triển hỗ trợ tạo thành ATP trình phát triển vi khuẩn (Sakairi et al., 1998) 41 Chương Kết bàn luận Tóm lại, qua thí nghiệm trên, nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum để thu nhận cellulose mannitol cao nấm men, thí nghiệm sau sử dụng nguồn carbon mannitol nguồn nitơ cao nấm men cho môi trường lên men tổng hợp cellulose Vấn đề đặt cần phải chọn hàm lượng nguồn carbon nitơ với hàm lượng tốt cho môi trường lên men Để giải yêu cầu này, cần tiến hành thí nghiệm tiếp theo, tìm điểm tối ưu thí nghiệm 1.11 Tối ưu hoá nồng độ nguồn carbon nitơ Nguồn carbon thích hợp mannitol nguồn nitơ thích hợp theo kết thí nghiệm cao nấm men khảo sát với nồng độ khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose hàm lượng đó, từ số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút hàm lượng nguồn carbon nitơ thích hợp cho A xylinum tổng hợp cellulose Chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon mannitol, nguồn nitơ cao nấm men với nồng độ theo mô hình thí nghiệm tối ưu bảng 4.1 4.2 Sau thu kết thí nghiệm, số liệu xử lý theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men Phương trình hồi quy bậc hai biểu diễn biến động yếu tố ảnh hưởng đến kết thí nghiệm có dạng sau đây: y = bo + ∑b x 1≤ j ≤k j j + ∑b 1≤ j