Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” NGHIÊN CỨU LÀM GIÀU NHĨM VI KHUẨN ANAMMOX (OXY HỐ AMMONIUM KỴ KHÍ) TỪ BÙN CỦA HỆ UASB XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NI HEO Lê Cơng Nhất Phương(1), Ngơ Kế Sương(1), Nguyễn Tiến Thắng(1) Kenji Furukawa(2), Phạm Khắc Liệu(2) Takao FuJii(3) (1) Viện Sinh học Nhiệt ñới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Dept of Civil Eng and Architecture, Faculty of Engineering, Kumamoto Universty (3) Dept of Civil Applied Life Science, Faculty of Engineering, Sojo Universty, Japan (2) ABSTRACT The preliminary enrichment of anaerobic ammonium oxidation bacteria (anammox) from sludge of UASB system for the swine wastewater treatment in HoChiMinh city was successfully carried out After months of continuous enrichment showed a simultaneous consumption of ammonium and nitrite (0-30% and 13-45% of influent concentration respectively) and a production of small amount of nitrate (1,0-1,5 mg/l) in effluent that meant anammox reaction had occurred The PCR analysis and 16s rDNA sequencing of the enriched biomass confirmed the existence of anammox bacteria with the high similarity with KOLL2a and KU2 strains and Candidatus Brocadia anammoxidans bacteria, all of which are well known as microorganisms having anammox activity Từ khóa: anammox, ammonium, bùn kị khí từ tháp UASB xử lý nước thải ni heo GIỚI THIỆU Ngồi chu trình biến đổi nitơ thơng thường [1] có chuyển đổi kỵ khí q trình oxy hố ammonium (anammox) với có mặt số chủng vi sinh vật tự dưỡng, nitrit đóng vai trò chất nhận ñiện tử theo chế phương trình sau ñây [2]: NH4+ + NO2- = N2 + H2O (1) NO NO2 - NO3- N2 O Pha khí nước Pha NH2OH N2 N2 H4 Org-N NH4+ Nitrification Denitrification Fixation+AssimilatioNi trification Anammox Nitritation Anammox Hình Chu trình biến đổi Nitơ Khoa Mơi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -165- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” Các hệ thống xử lý nitơ truyền thống thường dựa vào kết hợp giai đoạn nitrat hóa denitrat hóa [2, 3, 4] Năm 1995, phản ứng chuyển hóa nitơ chưa biết đến trước mặt lý thuyết lẫn thực nghiệm phát ðó phản ứng oxy hóa kỵ khí ammonium (Anaerobic Ammonium Oxidation - anammox), ammonium oxi hóa nitrit điều kiện kỵ khí, khơng cần cung cấp chất hữu cơ, ñể tạo thành nitơ phân tử Phản ứng anammox xác nhận oxy hóa ammonium nitrit ñiều kiện phản ứng mà tỉ lệ mol NH4+ NO2- = 1:1,32 phương trình (2) đây: NH4+ + 1.32 NO2- + 0.066 HCO3- + 0.13 H+ = 1.02 N2 + 0.26 NO3+ 0.0606 CH2O0.5N0.15 + 2.03 H2O (2) Trong lượng nhỏ nitrat từ nitrit ñược tạo thành ñể sinh ñương lượng khử ñồng hóa CO2 Phương trình chấp nhận rộng rãi đại diện cho phản ứng anammox [5] Hình Cơ chế sinh hóa q trình anammox Cho đến phát nhóm vi khuẩn anammox, cụ thể Brocadia, Kuenenia Scalindua [6] Về mặt phân loại, vi khuẩn anammox phân thành viên ngành Planctomycetes, Planctoycetales [7] Mặc dù nguyên tắc, vi khuẩn anammox tồn môi trường tự nhiên hệ xử lý nước thải có nồng độ ammonium cao, việc làm giàu, ni cấy khó khăn sinh trưởng chậm [10], việc làm giàu sinh khối cần thiết ñối với hệ xử lý chuyên biệt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mơ hình thực nghiệm Q trình thích nghi, làm giầu tích lũy vi khuẩn anammox bùn hoạt tính thực thiết bị tự tạo (hình 3) sau: • Giai đoạn I: Giai đoạn thích nghi bùn ñược thực thời gian 120 ngày (hình 3: lưu lượng nước 10 lít/ngày qua cột hình trụ D 200mm, H 800mm, dung chứa 20 lít) Khoa Mơi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -166- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” • Giai đoạn II: Giai đoạn tích luỹ làm giàu vi khuẩn anammox thực 270 ngày (hình 3: lưu lượng 10 lít/ngày qua cột hình trụ D 100mm, H 1000mm, dung chứa 10 lít) Khí sinh học Nước Cộ t UASB Bùn hoạt tính Bộ thu khí Bơm đònh lượng Hình Mơ hình tháp thí nghiệm 2.2 Vật liệu Nguồn giống bùn hoạt tính kỵ khí rút từ đáy tháp UASB trạm xử lý nước thải nuôi heo Xí nghiệp chăn ni heo Gò Sao, Quận 12, Tp HCM Thành phần tính chất nước thải chăn ni heo XN chăn ni heo Gò Sao ñược ghi nhận bảng ñây [8, 9] Bảng Thành phần nước thải nuôi heo công nghiệp STT 10 Thành phần COD BOD5 DO SS NH4-N Tổng P NO2-N NO3-N Fe pH ðơn vị mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Nồng ñộ 1.800-3.200 1000-1800 0-0.2 1.500-4.200 200-800 30-80 0-5 3-15 1.5-3.5 6.8-8.5 Ghi 2.3 Môi trường nhân giống Thực nghiệm nhân sinh khối vi khuẩn Anammox bùn hoạt tính kị khí thực với môi trường ghi nhận bảng ñây [10] Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -167- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” 2.4 Phân tích thơng số mơi trường Thành phần hóa học mơ hình nhân giống thực nghiệm : N-NH4, N-NO3, NNO2, COD, DO, pH, TDS… phân tích theo phương pháp "Standard methods for the examination of water and wastewater" [11] với máy so màu Thermo Spectronic Moder 4001/4,USA, máy TOA, Model 22, Japan máy ño pH (Model 2000 VWR Scientific, USA) Bảng Môi trường thực nghiêm nuôI vi khuẩn Anammox Thành phần môi trường Nồng ñộ (NH4)2SO4 NH4Cl 10-60 mg/l NaNO2 10-60 mg/l KHCO3 500 mg/l KH2PO4 27m g/l CaCl2.2H2O 0.180 g/l MgSO4.7H2O 0.120 g/l Trace element solution I* (g/l): EDTA:5, FeSO4 :5 ml/l Trace element solution II* (g/l): EDTA :5, ZnSO4.7H2O: 0.43, ml/l CoCl2.6H2O: 0.24, MnCl2.4H2O: 0.99, CuSO4.5H2O: 0.25, NiCl2.6H2O: 0.19, H3BO4 :0.014 2.5 Phân tích vi khuẩn Sinh khối vi khuẩn từ mẫu bùn nhân ni thực nghiệm sau tháng ñược thu thập bảo quản lạnh, gửi sang Nhật để phân tích vi khuẩn anammox phản ứng PCR ñối với gen 16s rDNA [12], giải mã trình tự so sánh với ngân hàng gen giới BLAST NCBI Sequence Viewer 2.0 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Sự thích ứng bùn kị khí (Bảng 3) Mơ hình thực nghiệm nêu ñược vận hành liên tục thời gian tháng, mơi trường để vi khuẩn anammox thích nghi có N-NH4 N-NO2 ñầu vào tăng dần từ 10 ñến 30 mg/l Kết biến ñộng thành phần mơi trường ghi nhận bảng 3, đồ thị 2, cho thấy ñã xuất tiêu thụ ñồng thời N-NH4 lẫn N-NO2 tạo thành lượng nhỏ N-NO3 Hiệu suất loại N-NH4 N-NO2 tăng tương ứng từ ñến 8% từ 13,0 ñến 22,3% lượng N-NO3 tạo dao ñộng khoảng 1,0 - 1,5 mg/l ðiều chứng tỏ có khả xuất phản ứng Anammox phương trình (2) Trong tháng lượng bùn (SS) giảm từ 5.500mg/lít xuống 3.200mg/lít ðó kết tự phân huỷ kỵ khí sinh khối vi sinh vật dị dưỡng điều kiện khơng cung cấp nguồn dinh dưỡng cacbon hữu Kết phù hợp với biến động nồng ñộ COD ñầu ñược biễu diễn ñồ thị bùn chuyển từ màu ñen sang màu nâu 3.2 Sự làm giàu vi khuẩn Anammox bùn hoạt tính Khoa Mơi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -168- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” Bùn từ mơ hình I chuyển qua Mơ hình II với nồng ñộ N-NH4 N-NO2 ñầu vào tăng dần từ 30 ñến 60 mg/l Kết theo dõi tích lũy bùn ñược ghi nhận bảng 4, ñồ thị 3: hiệu suất loại N cao hơn, tăng dần từ 9,3 ñến 29,3% ñối với N-NH4 23,3 44,7% ñối với N-NO2 tạo lượng nhỏ N-NO3; lượng bùn (SS) giảm từ 3.200mg/lít xuống 1.120mg/lít, lúc lượng COD đầu giảm gần 50% ñặc biệt bùn ñã chuyển từ màu nâu sang màu nâu hồng - dấu hiệu ñặc trưng vi khuẩn anammox (xem ảnh ) hình Bảng Kết nhân ni bùn kị khí giai ñoạn I (giai ñoạn thích ứng) Tháng thứ N-NH4 (mg/l) Vào Ra 10 10 10 10 10 9.8 Tháng thứ hai N-NH4 (mg/l) Vào Ra 20 19.5 20 19.2 20 18.8 Tháng thứ ba N-NH4 (mg/l) Vào Ra 30 28 30 27.6 30 27.6 N-NO2 (mg/l) Vào Ra 10 8.2 10 8.7 10 8.7 COD (mg/l) Vào Ra 426 288 225 N-NO3 (mg/l) Vào Ra 1.5 1.5 1.2 N-NO2 (mg/l) Vào Ra 20 16.3 20 16.0 20 16.0 COD (mg/l) Vào Ra 210 195 180 N-NO3 (mg/l) Vào Ra 1.2 1.2 1.2 N-NO2 (mg/l) Vào Ra 30 23.6 30 23.6 30 23.3 COD (mg/l) Vào Ra 180 172 168 N-NO3 (mg/l) Vào Ra 1.0 1.0 1.0 Hình Sự thay đổi màu sắc bùn qua giai ñoạn thực nghiệm A: Sau tháng tích luỹ, B: Sau tháng tích luỹ, C: Sau tháng tích luỹ A B C Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -169- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” Bảng Kết nhân ni sinh khối giai đoạn II Tháng thứ tư N-NH4 (mg/l) Vào Ra 30 27.2 30 27.0 30 26.8 Tháng thứ năm 40 35.5 40 35.3 40 35.3 Tháng thứ sáu 40 34.8 40 34.2 40 33.6 Tháng thứ bảy 50 41.2 50 39.5 50 39.5 Tháng thứ tám 50 39.2 50 37.6 50 36.6 Tháng thứ chín 60 43.2 60 42.4 60 42.4 N-NO2 (mg/l) Vào Ra 30 23.0 30 22.8 30 22.5 COD (mg/l) Vào Ra 150 150 143 N-NO3 (mg/l) Vào Ra 1.0 1.0 1.0 40 40 40 29.5 29.2 28.1 0 146 142 135 0 1.0 1.0 1.0 40 40 40 27.6 27.2 26.7 0 133 139 135 0 1.0 1.0 1.0 50 50 50 32.5 30.2 30.0 0 128 132 131 0 1.0 1.0 1.0 50 50 50 28.9 28.6 28.6 0 122 122 109 0 1.0 1.0 1.0 60 60 60 33.5 33.5 33.2 0 98 99 86 0 1.0 1.0 1.0 Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -170- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” 450 400 C O D ( m g /lit) 350 300 250 200 150 100 50 0 50 100 150 200 250 300 thoi gian (ngay) ðồ thị Sự giãm COD giai ñoạn I II 70 60 N-NH4 (mgN/Lit) N-NH4 vào 50 40 N-NH4 30 20 10 0 50 100 150 200 250 300 Thoi gian (ngay) ðồ thị Sự biến đổi N-NH4 mơ hình tháp thí nghiệm I II Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -171- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” 70 60 N-NO2 (mgN/lit) Inf N-NO2 50 40 eff N-NO2 30 20 10 0 50 100 150 200 250 300 thoi gian (ngay) ðồ thị Sự biến đổi N-NO2 mơ hình tháp thí nghiệm I II 3.3 Phân tích vi khuẩn anammox Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA, phần 300bp đầu 5' phần 850bp ñầu 3' cho kết ghi nhận bảng Bảng Sự tương đồng trình tự gen 16S rDNA sinh khối vi khuẩn anammox nhân nuôi thực nghiệm so với GenBank TT Vi khuẩn tương ñồng gần (Số ngoặc accession number GenBank) Phần 300bp ñầu 5' Anaerobic ammoium-oxidizing Planctomycete KOLL2a (AJ250882) Cultured anoxic sludge bacterium KU (AB054007) Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis Candidatus Brocadia anammoxidans Phần 850bp ñầu 3' Anaerobic ammoium-oxidizing planctomycete KOLL2a (AJ250882) Cultured anoxic sludge bacterium KU (AB054007) Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis Candidatus Brocadia anammoxidans % tương ñồng 100 100 100 95 100 100 99 94 Như vậy, khẳng ñịnh bùn hoạt tính sau 270 ngày tích luỹ ñã có diện vi khuẩn anammox, mặt câú trúc di truyền chúng tương đồng với nhóm Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis ñã ñược thừa nhận Châu Âu (dòng KOLL2a Khoa Mơi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -172- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” phát phòng thí nghiệm Thụy Sĩ dòng KU2 phát phòng thí nghiệm Eng and Architecture, Faculty of Eng., Kumamoto Universty, Dept of Civil Applied Life Science, Faculty of Eng Sojo Universty, Japan Nhật Tuy nhiên, mức độ tương đồng so sánh với vi khuẩn anammox Candidatus Brocadia anammoxidans dòng KU1 [10] KẾT LUẬN ١) Kết sau 270 ngày thử nghiệm làm giàu vi khuẩn anammox bùn kỵ khí từ hệ thống UASB xử lý nước thải ni heo cho thấy có diện phản ứng anammox, mức giảm N-NH4 N-NO2 tương ứng khoảng 30% 40%, lượng N-NO3 nước thải ñầu lại khơng đáng kể ٢) Bằng kỹ thuật phân tích sinh học phân tử xác định ñược tương ñồng ñáng kể vi khuẩn nhóm anammox diện bùn kị khí (làn phát Việt nam) với nhóm vi khuẩn anammox khác biết giới Nhóm vi khuẩn có khả oxy hố N-NH4 điều kiện kỵ khí tự dưỡng có khả triển khai ứng dụng thực tế nước ta TÀI LIỆU THAM KHẢO Gujer W, Jenkins D., 1974: The contact stabilization process-oxygen and nitrogen mass balances University of California, Berkeley, Sanitary Engineering Research Laboratory Report, 74-2 Van de Graaf A A., de Bruijin P., Robertson L A., Jetten M S M., Kuenen J G., 1996: Autotrophic growth of anaerobic ammonium oxidizing microorganisms in a fluidized bed reactor Microbiology 142, 2187-96 Van de Graaf A A., de Bruijin P., Robertson L A., Jetten M S M., Kuenen J G., 1997: Metabolic pathway of anaerobic ammonium oxidation on the basic of N-15 studies in a fluidized bed reactor Microbiology 143, 2415-21 Van Niftrik L A., Fuerst J A., Damstes J S S, Kuenen J G., Jetten M S M and Strous M., 2004: The anammoxosome: an intracytoplasmic compartment in anammox bacteria FEMS Microbiology Letters 233, 7-13 Fujji T., H, Rouse D.J and Furukawa K., 2002: Characterization of the microbial community in an anaerobic ammonium-oxidizing biofilm cultured on a nonwoven biomass carrier J Biosci.Bioeng., 94, 412-418 Schmid M., Twachtmann U., Klein M., Strous M., Juretschko S., Jetten M S M., Metzger J W., Schleifer K H., Wagner M., 2000: Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium axidation Syst Appl Microbiol 23[1], 93-106 Schmid M.C., Maas B., Dapena A et al., 2005: Biomarkers for in situ detection of amaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria Appl Environ Microbiol 71(4) 16771684 Nguyễn ðức Cảnh, Lê Công Nhất Phưong cộng tác viên, 2002, Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học lọc hiếu khí thiếu khí xử lý ammonium nước thải chăn ni heo công nghiệp, Sở Khoa học công nghệ Môi trường TpHCM Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -173- Hội thảo “Các giải pháp bảo vệ Môi trường Công nghiệp ðô thị Việt Nam” Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Phúc, Lê Công Nhất Phương, Võ Thi Kiều Thanh, Dương ðức Hiếu, 2000 Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học kỵ khí kết hợp với hồ thực vật thuỷ sinh xử lý nước thải chăn nuôi heo công nghiệp, Sở Khoa học công nghệ Môi trường TpHCM 10 Furukawa K., Rouse J D., Bhatti Z I and Imajo U 2002, Anaerobic oxidation ammonium confiemed in continuous flow treatment a non-woven biomass carrier, Japanese Society of Water Treatment Biology, Vol.38, No.2 pp.87-94 11 Standard methods for the examination of water and wastewater, 1995 12 Furukawa K., Rouse J D., Bhatti Z I and Imajo U 2002: Anaerobic ammonium oxidation (Anammox) in continuos flow treatment with non-woven biomass carrier In Proceedings of the ISEB Fifth International Symposium on Environmental Biotechnology, Kyoto, Japan The International Society for Environmental Biotechnology Waterloo, ON, Canada, CD-ROM Khoa Môi trường – Trường ðHBK – ðHQG TP.HCM -174- ... cho phản ứng anammox [5] Hình Cơ chế sinh hóa q trình anammox Cho đến phát nhóm vi khuẩn anammox, cụ thể Brocadia, Kuenenia Scalindua [6] Về mặt phân loại, vi khuẩn anammox phân thành vi n ngành... phân tử xác ñịnh ñược tương ñồng ñáng kể vi khuẩn nhóm anammox diện bùn kị khí (làn ñầu tiên phát Vi t nam) với nhóm vi khuẩn anammox khác biết giới Nhóm vi khuẩn có khả oxy hố N-NH4 điều kiện... 0.19, H3BO4 :0.014 2.5 Phân tích vi khuẩn Sinh khối vi khuẩn từ mẫu bùn ñã nhân ni thực nghiệm sau tháng thu thập bảo quản lạnh, gửi sang Nhật để phân tích vi khuẩn anammox phản ứng PCR ñối với gen