SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN từ bùn bột GIẤY PHẾ THẢI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ BÙN BỘT GIẤY PHẾ THẢI GVHD : TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Th.S TRẦN THỊ TƯỞNG AN SVTH : PHAN THỊ BẢO CHÂU MSSV : 15070063 LỚP : 18SH01 BÌNH DƯƠNG-2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHAN THỊ BẢO CHÂU SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ BÙN BỘT GIẤY PHẾ THẢI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD : TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Th.S TRẦN THỊ TƯỞNG AN BÌNH DƯƠNG-2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn người hướng dẫn tôi, ThS Trần Thị Tưởng An hướng dẫn hỗ trợ nhiều tháng thực đề tài Tôi muốn cảm ơn tận tình hướng dẫn, động viên khuyến khích tơi q trình thực nghiên cứu Đặc biệt, lời khuyên cô đề tài kiến thức chuyên môn kinh nghiệm làm việc Xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn TS Nguyễn Đình Quân đưa định hướng đề tài đồng ý thầy để tơi thực đề tài phịng Thí nghiệm Nhiên liệu sinh học & Biomass Cảm ơn thầy trường Đại học Bình Dương tận tình giảng dạy hướng dẫn tơi suốt trình học tập Một lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình tơi Tơi thực biết ơn với hi sinh mà họ dành cho Ba mẹ làm việc vất vả để có điều kiện học tập tốt Cảm ơn tin tưởng ủng hộ gia đình định Thủ Dầu Một, ngày 28 tháng năm 2019 Phan Thị Bảo Châu i MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh sách chữ viết tắt iii Danh sách bảng iv Danh sách hình ảnh v Tóm tắt luận văn vi Chương MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cellulose vi khuẩn vi sinh vật tổng hợp cellulsoe 2.1.1 Tổng quan vi sinh vật Acetobacter 2.1.2 Sơ lược Acetobacter xylinum 2.1.3 Cơ chế hình thành BC 2.1.4 Đặc điểm cấu trúc BC 2.1.5 Tiềm ứng dụng 10 2.2 Bùn giấy 13 2.2.1 Lượng bùn giấy thải từ nhà máy 13 2.2.2 Khả gây ô nhiễm môi trường 14 2.2.3 Các phương pháp xử lí hướng tận dụng bùn giấy 15 2.2.4 Thành phần phổ biến bùn giấy 16 2.3 Tình hình nghiên cứu 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ii 3.1 Địa điểm thời gian thực 21 3.2 Vật liệu 21 3.2.1 Nguyên liệu 21 3.2.2 Chủng vi sinh vật 22 3.2.3 Phương pháp lên men thu BC 22 3.3 Hóa chất thiết bị 22 3.3.1 Hóa chất 22 3.3.2 Thiết bị dụng cụ 23 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25 3.4.2 Phương pháp phân tích 28 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Khảo sát số yếu tố nguyên liệu 31 4.2 Khảo sát đặc điểm A.xylinum 31 4.2.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc A.xylinum 31 4.2.2 Quan sát Acetobacter xylinum kính hiển vi 32 4.2.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng Acetobacter xylinum môi trường nhân giống 32 4.2.4 Nhân giống 34 4.3 Khảo sát trình thủy phân 35 4.3.1 Thời gian thủy phân nồng độ acid H2SO4 35 4.3.2 Độ pH trình thủy phân 36 iii 4.4 Khảo sát trình lên men 38 4.5 Kiểm tra celulose mẫu nguyên liệu mẫu bc 40 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮC BC Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose) BOD Nhu cầu oxy sinh hoá (Biological Oxygen Demand) COD Nhu cầu oxy hoá học (Chemical Oxygen Demand) XRD Nhiễu xạ tia X ( X-ray Diffraction) A.xylinum Acetobacter xylinum DP Mức độ polymer hóa (Degree of Polymerization) SA Amonium Sulphate DAP Diamonium phosphate Cs Cộng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.3 Tình hình nghiên cứu BC ngồi nước 18 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Con đường tổng hợp cellulose A.xylinum Hình 2.2 Cấu trúc cellulose vi khuẩn Hình 2.3 Cellulose vi khuẩn cellulose thực vật Hình 2.4 Nguồn phát sinh bùn thải giấy 16 Hình 3.1 Mẫu nguyên liệu 21 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24 Hình 4.1 Khuẩn lạc A.xylinum sau 72 ni cấy 31 Hình 4.2 Tế bào A.xylinum quan sát kình hiển vi (40X) 32 Hình 4.3 Đường cong sinh trưởng A xylinum 33 Hinh 4.4 Giống cấp giống cấp 34 Hình 4.5 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến lượng glucose theo nồng độ acid H2SO4 35 Hình 4.6 Ảnh hưởng nồng độ acid đến pH theo thời gian 36 Hình 4.7 Bình lên men ngày thứ 10 điều kiện mơi trường 37 Hình 4.8 BC trước sấy BC sau sấy 38 Hình 4.9 Ảnh hưởng tỉ lệ giống theo thời gian đến lượng BC thơ 39 Hình 4.10 XRD mẫu nguyên liệu BC 40 vii TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A xylinum) vi khuẩn Gram âm, sản xuất loại polysaccharide ngoại bào gọi cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả ứng dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm lĩnh vực khác Để ứng dụng cellulose vi khuẩn cách rộng rãi, địi hỏi có nguồn ngun liệu cellulose vi khuẩn dồi ổn định Bùn giấy nguồn nguyên liệu phế thải chứa nhiều cellulose lại chưa tận dụng Với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ bùn bột giấy phế thải” điều kiện tĩnh, thực khảo sát yếu tố sau: -Khảo sát trình thủy phân cellulose acid H2SO4 nồng độ 1%, 3%, 5%, 7%, 9% -Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung (v/v) 8%, 10%, 12% vào môi trường nuôi cấy Để tạo nguồn glucose làm nguồn carbon cho A.xylinum sử dụng nồng độ acid H2SO4 5% lượng glucose ngày thứ trình thủy phân 1,012(mg/ml) Tỉ lệ giống 12% (v/v) cho lượng cellulose thô 1,35g Các kết cung cấp thơng tin cho thấy tận dụng nguồn bùn giấy phế phẩm để sản xuất cellulose vi khuẩn viii Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình 4.3: Đường cong sinh trưởng A xylinum Thời gian 24 đầu trình nhân giống, đáy bình bắt đầu xuất sợi nhỏ, mỏng, lơ lửng, dải sợi cellulose A xylinum tạo mơi trường, sau dải cellulose chồng chập, xoắn lại với nhau, bắt đầu tạo thành lớp màng cellulose mỏng, màu trắng đục bề mặt môi trường sau ngày thứ ba, thứ tư trình nhân giống Thời gian tổng hợp cellulose khả tổng hợp cellulose có liên quan đến số lượng tế bào vi khuẩn A xylinum Mật độ tế bào tăng nhanh 24 đầu q trình ni cấy, tương ứng với thời gian tế bào pha thích nghi Đến giai đoạn pha sinh trưởng mật độ tế bào bắt đầu tăng nhanh, tăng nhanh diễn vào khoảng thời gian từ 24 đến 96 nhân giống Mật độ tế bào đạt số lượng lớn 96 giờ, sau giữ ổn định pha cân giảm dần vào pha suy vong Từ đường cong sinh trưởng, ta sử dụng dịch giống sau 96h nhân giống để tiến hành lên men thu cellulose tốt Vậy, kết thí nghiệm cho thấy, môi trường dịch ép phế phẩm dứa, chủng 33 A xylinum có khả phát triển tốt môi trường tự nhiên với thành phần nước dừa [8] 4.2.4 Nhân giống (a) (b) Hinh 4.4: Giống cấp (a) giống cấp (b) Nhận xét: -Sau ngày, màng BC xuất kín bề mặt lên men mơi trường lên men cấp Màng BC có màu trắng, sau thời gian màng phát triển chậm -Khi cấy chuyền từ môi trường cấp sang môi trường cấp 2, màng BC xuất liên tục tăng dần đến ngày thứ 10 khơng tăng thêm Màng BC dày, bóng mơi trường nhân giống cấp 34 4.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 4.3.1 Thời gian thủy phân nồng độ acid H2SO4 Mẫu bùn giấy đem thủy phân lấy ngày (trong ngày) nồng độ khảo sát để đo OD bước sóng 540nm 2.5 Ngày Ngày Ngày Glucose (mg/ml) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 10 Nồng độ H2SO4 (1) Hình 4.5: Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến lượng glucose theo nồng độ acid Lượng glucose tăng theo ngày theo nồng độ acid H2SO4 Hàm lượng glucose (mg/ml) nồng độ 9% cao nhất, từ ngày đến ngày tăng từ 1,88±0,4-2,54±0,15 (mg/ml) ; 7% tăng từ 1,01±0,01-1,59±0,07 (mg/ml); 5% tăng từ 0,68±0,021,02±0,06(mg/ml) 35 4.3.2 Độ pH trình thủy phân Đồ thị biểu diễn độ pH theo ngày nồng độ thu thí nghiệm pH H2SO4 5% H2SO4 7% H2SO4 9% 1 Thời gian thủy phân (ngày) Ngày Hình 4.6: Ảnh hưởng nồng độ acid đến pH theo thời gian A xylinum hoạt động điều kiện pH khoảng từ 4,5-5,5 nên khảo sát thêm pH trình thủy phân Chọn nồng độ H2SO4 thủy phân cho lượng glucose nhiều để khảo sát Để chọn nồng độ acid thủy phân tốt với mục đích dùng dịch thủy phân để lên A.xylinum Thí nghiệm cho thấy pH trình thủy phân H2SO4 5% khoảng 3,444,96 phù hợp cho mục đích giai đoạn lên men A.xylinum thu BC Sau ngày trình thủy phân cho lượng glucose nhiều 1,017mg/ml 36 Khảo sát khả lên men tổng hợp cellulose từ glucose thủy phân acid H2SO4 5%, 7%, 9% Hình 4.7: Bình lên men ngày thứ 10 điều kiện môi trường Trong điều kiện môi trường lượng giống ngày thứ bình 5% hình thành lớp màng BC mỏng sau dày lên trình lên men Bình 7% 9% đến ngày thứ 10 không tổng hợp cellulose, dù hàm lượng glucose nhiều bình 5% Do thủy phân bùn giấy acid H2SO4 5% phù hợp với trình lên men Nên chọn acid H2SO4 5% ngày thủy phân cellulose bùn giấy làm nguồn Carbon để tiến hành giai đoạn lên men sinh tổng hợp cellulose 37 4.4 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN Sau xác định thời gian nhân giống thích hợp, cần xác định thời gian kết thúc q trình lên men cho thí nghiệm cho phù hợp Do đó, thực khảo sát trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn A xylinum nhằm chọn thời điểm kết thúc trình lên men cách thích hợp Sử dụng dịch giống cấp với tỉ lệ bổ sung giống với môi trường 8%, 10%, 12% để nuôi cấy thu nhận cellulose mơi trường bùn giấy có bổ sung số chất dinh dưỡng cần thiết cho trình lên men Sử dụng chai thủy tinh 150ml chứa 50ml dịch lên men, nhiệt độ nuôi cấy 280C Trong q trình ni cấy, khảo sát hàm lượng cellulose được tổng hợp khoảng thời gian khác Kết thu cho thấy, suốt trình lên men A xylinum liên tục tổng hợp cellulose BC sau thu rửa ngâm qua NaOH 0,5M để loại tế bào cịn xót lại đem sấy để xác định hàm lượng cellulose (a) (b) Hình 4.8: BC trước sấy (a) BC sau sấy (b) 38 Khối lượng BC(g) Độ thị biểu diễn hàm lượng cellulose theo nồng độ giống Thời gian ni cấy (ngày) Hình 4.9: Ảnh hưởng tỉ lệ giống theo thời gian đến lượng BC thô Ở ngày thứ trình lên men, chuyển từ môi trường nhân giống sang môi trường lên men nên có thay đổi mơi trường, số lượng tế bào môi trường chưa đủ lớn nên tạo thành cellulose Sau ngày xuất sợi cellulose mảnh lơ lửng mơi trường hình thành lớp màng cellulose dày hơn, màu trắng Sang ngày thứ trở tốc độ tạo cellulose tăng lên đáng kể bề mặt bình lên men có lớp màng cellulose dày Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ 10 đến ngày thứ 17 Đây thời gian vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose mạnh sau thích nghi với mơi trường số lượng tế bào đủ lớn Sau ngày 20 hàm lượng cellulose tăng lên khơng đáng kể lượng chất dinh dưỡng môi trường hết Mặc khác, trình lên men, pH dịch lên men giảm dần Song song với tổng 39 hợp cellulose, lượng cellulose tăng lên pH dịch lên men giảm Sự giảm pH có nguyên nhân xác định trình sinh trưởng phát triển, A.xylinum sử dụng đường để tạo acid gluconic (Tahara et al., 1997) Bên cạnh đó, Hai-Peng et al (2002) nghiên cứu chủng A.xylinum sucrofermentans BPR2001 cho thấy, sau giai đoạn thích nghi, glucose chuyển thành acid gluconic mạnh pH dịch lên men giảm rõ rệt 4.5 KIỂM TRA CELULOSE TRONG MẪU NGUYÊN LIỆU VÀ MẪU BC Counts BC NL nsi inte 10 15 20 25 30 Theta Hình 4.10: XRD mẫu nguyên liệu BC Các mẫu XRD bùn giấy BC hiển thị hình Các mẫu thể đỉnh tinh thể 2θ = 22o cho cấu trúc điển hình cellulose I Cellulose tinh thể tồn dị hình I-IV, cellulose I cellulose tinh thể phổ biến nguồn tự nhiên (Lu, Gui, Zheng, & Lie, 2013; Chen et al,2011) 40 Ở mẫu BC đỉnh tinh thể cellulose khoảng 608, mẫu nguyên liệu đỉnh tinh thể cellulose 581 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Khi khảo sát trình sinh trưởng chủng A.xylinum mơi trường có thành phần dinh dưỡng glucose thủy phân từ bùn giấy, acid H2SO4 5% ngày lượng glucose 1,02(mg/ml) Cho thấy chủng A.xylinum có khả sinh trưởng tốt mơi trường bán tổng hợp có bổ sung thêm chất dinh dưỡng Kết cho thấy, từ nguồn nguyên liệu bùn giấy phế thải tận dụng sản xuất BC Với nguồn nguyên liệu bỏ làm làm chi phí sản xuất BC tăng hiệu kinh tế Kết cho thấy trình tổng hợp cellulose A.xylinum bị tác động yếu tố: pH, thời gian lên men tỉ lệ vi sinh vật Có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose cách tác động đến yếu tố ảnh hưởng 5.2 ĐỀ NGHỊ - Thủy phân bùn giấy cellulase -Thủy phân bùn giấy loại acid khác -Tìm thêm mơi trường khác từ phế phẩm cơng nơng nghiệp nhằm tìm nguồn chất hiệu mà rẻ tiền, giảm chi phí sản xuất -Nghiên cứu thêm khả ứng dụng cellulose vi khuẩn thực phẩm sinh học: màng bao thực phẩm chống vi sinh vật, cố định vi sinh vật,… 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Phạm Thị Thanh Hịa 2018 Nghiên cứu cơng nghệ xử lí bùn thải giấy theo hướng sản xuất nhiên liệu sinh học ethanol Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 27 trang [2] Nguyễn Thúy Hương 2008 Ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men đến suất chất lượng cellulose vi khuẩn Tạp chí Khoa học ĐHQGHN , Khoa học Tự nhiên Công nghệ (24):205-210 [3].Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh 2006 Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học (361): 18-20 [4] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Như Quỳnh 2012 Nghiên cứu vi khuẩn acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50(4): 453-462 [5] PGS TS Nguyễn Văn Phước, Trịnh Bảo Sơn, Trần Minh Hương, Nguyễn Thị Thu Hiền 2012 Giáo trình Cơng nghệ Xử lý Bùn Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [6] Tràng Văn Phong, Đồn Thị Ngọc 2016 Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ dịch tổng hợp Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP Hồ Chí Minh 61 trang Tài liệu tiếng Anh [6] Brown R M., Willison J H., Richardson C L.1976 Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: Visualization of the site of synthsis and direct measurrement of the in vivo process Proceedings of the National Acedemy of Science.(73): 4565-4569 [7] JinboChen 2019 In situ preparation of bacterial cellulose with antimicrobial properties from bioconversion of mulberry leaves Carbohydrate Polymer (220): 170-175 [8] Maria R Kosseva, Mengmeng Li, Juyan Zhang, Yiting He, Natasia A.S Tjutju 2017 Study on the bacterial cellulose production from fruit juices.International Conference on Bioscience and Biotechnology (2): 36-42 [9] Puji Lestar, Nitariani Elfrida, Ani Suryani and Yadi Suryadi 2013 Study on the Production of Bacterial Cellulose from Acetobacter xylinum using Agro-Waste Jordan Journal of Biological Sciences (7): 75-80 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cách dựng đường chuẩn glucose Cân xác 1g glucose hào tan 200ml nước cất Hút 1, 2, 3, 4, ml dung dịch đường glucose vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch định mức Các dung dịch pha có nồng độ glucose 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/ml Hút 1ml dung dịch glucose nồng độ vào ống nghiệm chứa 3ml dung dịch DNS Mẫu trắng: Hút 1ml nước cất vào ống nghiệm chứa 3ml dung dịch DNS Đun cách thủy hỗn hợp 15-20 phút Làm lạnh nhanh đo OD bước sóng 540nm Từ kết đo được, ta xác định đường chuẩn Phụ lục 2: Bổ sung số liệu kết Bảng: Hàm lượng glucose khảo sát thủy phân (mg/ml) H2SO4 1% H2SO4 3% H2SO4 5% H2SO4 7% H2SO4 9% Ngày 0,37 0,64 0,68 1,01 1,88 Ngày 0,35 0,54 0,64 1,39 2,02 Ngày 0,55 0,74 1,02 1,86 2,54 Bảng: Nồng độ pH trình thủy phân H2SO4 5% H2SO4 7% H2SO4 9% Ngày 3,44 0,68 0,43 Ngày 4,02 0,73 0,56 Ngày 4,96 0,84 0,64 Bảng: Hàm lượng BC thô thu khảo sát lên men (g) Tỉ lệ giống bổ sung Ngày lên men 8% 10% 12% 0,59 0,63 0,68 0,62 0,66 0,65 11 0,76 0,86 0,89 13 0,86 0,87 1,05 15 0,99 1,07 17 1,21 1,25 1,34 19 1,25 1,27 1,35 21 1,28 1,29 1,35 ... 2.2.1 Lượng bùn giấy thải từ nhà máy Nước thải sản xuất giấy: Giấy, bìa sản xuất từ bột giấy tái sinh, hỗn hợp, tẩy trắng chưa tẩy trắng Đối với loại hình sản xuất giấy từ bột giấy nước thải phát... khả sử dụng sản phẩm phụ chế biến trái để sản xuất cellulose vi khuẩn có giá trị gia tăng cao làm cho vi? ??c sản xuất cellulose vi khuẩn hiệu VictorRevin Sản xuất cellulose vi Các sản phẩm phụ... công nghệ sản xuất giấy bột giấy phần nước thải từ nhà máy giấy túy (không sản xuất bột) sạch, chủ yếu nước thải từ khâu xeo giấy, tạp chất cặn lơ lửng (thường xơ sợi giấy, bột độn, bột màu, phụ