SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN từ DỊCH ép hỗn hợp vỏ TRÁI cây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ DỊCH ÉP HỖN HỢP VỎ TRÁI CÂY GVHD: TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN ThS TRẦN THỊ TƯỞNG AN SVTH: NGUYỄN THỊ YẾN NGỌC MSSV: 15070039 LỚP: 18SH01 BÌNH DƯƠNG - 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ YẾN NGỌC SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN TỪ DỊCH ÉP HỖN HỢP VỎ TRÁI CÂY LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD: TS NGUYỄN ĐÌNH QUÂN ThS TRẦN THỊ TƯỞNG AN BÌNH DƯƠNG - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Đình Quân cô Th.S Trần Thị Tưởng An hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn thầy tận tình hướng dẫn, giảng dạy suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Bình Dương Mặc dù kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân chưa có nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo không tránh khỏi thiếu xót, em mong nhận góp ý, bảo thêm quý thầy cô để báo cáo hoàn thiện Một lần em xin gửi đến thầy cô, bạn bè lời cảm ơn chân thành tốt đẹp Thủ Dầu Một, ngày 30 tháng 07 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Yến Ngọc i MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh sách từ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi Tóm tắt luận văn ix Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose - BC) 2.1.1 Lược sử nghiên cứu sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 2.1.2 Cellulose vi khuẩn tính chất cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 2.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A xylinum 10 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose A xylinum 10 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 11 2.3 Các nguồn nguyên liệu sử dụng để lên men BC 14 2.3.1 Nước dừa già 14 2.3.2 Rỉ đường 14 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lên men thu BC 15 2.5 Ứng dụng cellulose vi khuẩn 16 2.5.1 Thực phẩm 16 ii 2.3.2 Y học 18 2.5.3 Sinh học 19 2.5.4 Các ngành công nghiệp khác 20 2.6 Nguồn nguyên liệu phế phẩm trái dùng để sản xuất BC 21 2.7 Tình hình nghiên cứu BC ngồi nước hướng đề tài 22 2.7.1 Ngoài nước 22 2.7.2 Trong nước 24 Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 3.1 Địa điểm thời gian thực 26 3.2 Vật liệu 26 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.2.2 Chủng vi sinh vật 26 3.2.3 Hóa chất thiết bị 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 28 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28 3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 3.2.3 Phương pháp phân tích 30 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34 4.1 Kết khảo sát đặc điểm A xylinum 34 4.2 Kết khảo sát đường cong sinh trưởng A xylinum môi trường nhân giống 37 4.3 Kết khảo sát thời gian lên men tỷ lệ giống bổ sung thu BC vi khuẩn A xylinum từ dịch ép phế phẩm trái 37 iii 4.4 Kết khảo sát yếu tố pH thu BC vi khuẩn A xylinum 42 4.5 Kết phân tích cellulose mẫu BC nhiễu xạ tia X 45 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT A xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial cellulose PC Plant cellulose DP Degree of polymerization GK Glucokinase Glc-6-P Glucose - - phosphate DNS Dinitrolicylic DAP Diamonium phosphate SA Amonium sulfate XRD Nhiễu xạ tia X v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 So sánh đường kính sợi cellulose với sợi tự nhiên Bảng 2.2 Các loài vi sinh vật có khả tổng hợp cellulose vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc màng cellulose vi khuẩn Hình 2.2: Con đường tổng hợp cellulose A xylinum 11 Hình 2.3: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.4: Sự giải phóng cellulose mơi trường ngồi từ A xylinum 13 Hình 2.5: Thạch dừa dùng thực phẩm 17 Hình 2.6: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC 18 Hình 2.7: Ứng dụng BC làm giá thể nuôi cấy cụm chồi thuốc 20 Hình 2.8: Ứng dụng BC vật liệu (làm xốp) 21 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28 Hình 4.1: Ống giống cấp 33 Hình 4.2: Chai giống cấp 33 Hình 4.3: Khuẩn lạc A xylinum sau 72 nuôi cấy 34 Hình 4.4: Tế bào A xylinum quan sát kính hiển vi 35 Hình 4.5: Đường cong sinh trưởng A xylinum 36 Hình 4.6: Ảnh hưởng thời gian lên men đến trình tổng hợp BC 37 Hình 4.7: Màng BC thu sau 21 ngày lên men 39 Hình 4.8: Màng BC sấy khơ sau 21 ngày lên men 39 Hình 4.9: Ảnh ưởng đến trình tổng hợp BC 40 Hình 4.10: BC tỷ lệ giống bổ sung 41 Hình 4.11: Ảnh hưởng pH lên men đến trình tổng hợp BC 42 Hình 4.12: Màng BC thu pH 44 vii Hình 4.13: XRD mẫu BC 45 viii 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN LÊN MEN VÀ TỶ LỆ GIỐNG BỔ SUNG THU BC CỦA VI KHUẨN A XYLINUM TỪ DỊCH ÉP PHẾ PHẨM TRÁI CÂY 4.3.1 Thời gian lên men Thời gian lên men lượng giống bổ sung yếu tố quan trọng ảnh hưởng trình lên men cellulose vi khuẩn Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn A xylinum thời gian lên men từ - 21 ngày, với tỉ lệ giống thay đổi 6%; 8%; 10%; 12 %Sử dụng dịch giống cấp với tỉ lệ giống 8%; 10%; 12% để nuôi cấy thu nhận cellulose môi trường dịch ép hổn hợp vỏ trái phế thải bình 250ml chứa 100ml dịch lên men, nhiệt độ phịng Trong trình lên men, khảo sát hàm lượng cellulose tổng hợp khoảng thời gian khác Khảo sát lập lại lần Hình 4.6: Ảnh hưởng thời gian lên men đến trình tổng hợp BC 37 Theo hình 4.6 ngày đầu, chuyển từ môi trường nhân giống sang môi trường lên men nên có thay đổi mơi trường, số lượng tế bào môi trường chưa đủ lớn nên tạo thành cellulose chưa có Sau ngày xuất sợi cellulose mảnh lơ lửng môi trường bề mặt bắt đầu xuất lớp màng mỏng, trắng Sang ngày thứ tốc độ tạo cellulose tăng lên bề mặt bình lên men có lớp màng cellulose dày Tuy nhiên lượng cellulose sau ngày cịn nên chưa xác định khối lượng Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ Theo David Holmes (2004), hàm lượng glucose môi trường giảm sau 150 lên men, tác giả cho sau ngày lên men, nguồn cung cacbon ban đầu giảm vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic 5-keto acid gluconic trình trao đổi chất Sau thời gian ngày độ kết tinh màng đạt trạng thái tốt nhất.Vì định sử dụng bổ sung hàm lượng giống ban đầu 10 % thu nhận màng sau ngày lên men * Kết cho thấy, trọng lượng cellulose thu sau 21 ngày lên men cao so với ngày 19 chênh lệch khơng đáng kể Do để rút ngắn thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc 19 ngày lên men 38 Hình 4.7: Màng BC thu sau 21 ngày lên men Hình 4.8: Màng BC sấy khô sau 21 ngày lên men 39 *Nhận xét: Từ kết ta chọn thời gian thu nhận BC từ môi trường lên men 19 ngày, nhiệt độ phòng, nồng độ Bx 8,5 - 9, điều chỉnh pH≈5 Sau lên men thu nhận BC, tiến hành xử lý BC cách ngâm với NaOH rửa nước đem sấy 100℃ Tỷ lệ giống 6% không phù hợp: thời gian lên men kéo dài, sản lượng BC thấp, dễ bị nhiễm tạp Trong trường hợp muốn rút ngắn thời gian lên men phải tăng tỷ lệ giống 8%; 10%, 12% ( tương ứng với tỷ lệ giống bổ sung 8:100; 10:100; 12:100) 4.3.2 Tỷ lệ giống bổ sung Tỷ lệ giống bổ sung Hình 4.9: Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến trình tổng hợp BC * Nhận xét: từ kết chọn tỷ lệ giống bổ sung tốt 12%, thời gian 19 ngày lên men 40 a) b) c) Hình 4.10: BC tỷ lệ giống bổ sung a ) Tỷ lệ bổ sung giống 8% b ) Tỷ lệ bổ sung giống 10% c ) Tỷ lệ bổ sung giống 12% 41 4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT YẾU TỐ PH THU BC CỦA VI KHUẨN A XYLINUM Tiến hành lên men thu nhận cellulose nuôi cấy vi khuẩn A xylinum môi trường dịch ép hổn hợp trái phế thải (MT3) điểm pH ban đầu khác nhau, thời gian lên men ngày Các giá trị pH khảo sát 3,5; 4; 4,5; Khảo sát hàm lượng cellulose thu được, đánh giá ảnh hưởng pH lên khả tạo cellulose vi khuẩn Từ chọn pH tốt cho mơ trường lên men Kết thu cho thấy, giá trị pH khác lượng cellulose thu khác nhau, chứng tỏ pH ảnh hưởng đến khả tổng hợp cellulose A xylinum Hình 4.11: Ảnh hưởng pH lên men đến trình tổng hợp BC Khoảng pH cho chủng A xylinum thí nghiệm khoảng từ 3.5 - 5, lượng cellulose tạo giá trị pH khác 42 Với q trình tổng hợp cellulose, A xylinum cịn tổng hợp cellulase Khi cellulase tạo nhiều khả polymer hóa tạo cellulose vi khuẩn giảm, lượng cllulose tạo Khi pH cao (pH>5) lượng cellulase tạo nhiều làm cho cellulose giảm Khi pH thấp (pH