vi khuẩn bạc lá lúa xanthomonas oryzae
Trang 1Phần 1 MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)
gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều
vùng trồng lúa khác nhau trên thế giới Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây
hại ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối
với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Để phịng trừ người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ
thuật canh tác, bĩn phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng bệnh, trong đĩ chọn tạo giống kháng bệnh
cĩ ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, khơng gây ơ nhiễm mơi trường và tạo được nơng sản sạch Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải cĩ nguồn gen kháng bệnh, sau đĩ phải xác định chính xác được số và thành phần các chủng hiện cĩ ở mỗi vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống
Hiện người ta đã xác định được 29 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau
trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước cĩ một số chủng gây
bệnh nhất định như ở Philippin cĩ 6 chủng, Án độ 9 chủng, Nhật Bản cĩ 12 chủng Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tơn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây
nhiễm các dịng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu
Trang 2ở mức phân tử DNA Trên thế giới cĩ khá nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên cơng bố đã xác định được
trình tự DNA của genom vi khuân Xoo, vịng genom dai 4,9 triệu bp, trong
đĩ đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng dễ biến động, đây
cĩ thé là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau Sau đĩ Tika và cộng sự, 1999 đã sử dụng phương pháp rep-PCR và IS-PCR để nghiên cứu đa
dạng đi truyền của 171 chủng vi khuân Xoo phân lập ở Nepal và đã phân ra
được 31 nhĩm chủng khác nhau Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu và
ứng đụng chỉ thị phân tử DNA đề xác định một cách chính xác các chủng vi
khuẩn bệnh bạc lá lúa vẫn chưa được tiến hành Vì vậy, được sự phân cơng
và hướng dẫn chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae ở miền Bắc
Việt Nam ”
II Mục đích và yêu cầu
1 Mục đích
Nghiên cứu xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá sử dụng kỹ thuật rep — PCR va IS-PCR, phục vụ cơng tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững
2 Yêu cầu
- Nuơi cấy, phân lập thành cơng và xác định chính xác các mẫu vi
khuẩn Xoo
- Lây nhiễm các dịng đẳng đơn gen, xác định tính độc của mẫu vi khuẩn và phơ kháng nhiễm
- Sử dụng kỹ thuật rep — PCR và IS-PCR theo phương pháp của Tika và cộng su, 1999 xác định đa dạng di truyền các mẫu vi khuẩn Xoo, trên cơ
Trang 3Phần 2 TỎNG QUAN TÀI LIỆU I Tổng quan về bệnh bạc lá và vi khuẩn Xøø 1 Tổng quan bệnh bạc lá lúa 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào
năm 1884 Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là đo acid đất (Bokura, 1911) Nhưng khơng lâu sau đĩ, người ta đã cơng nhận nguyên nhân của nĩ là do vi khuẩn gây nên và theo
Ishiyama,1922 thudc loai Bacillus oryzae Vi khuan này sau đĩ được Tagami, Mizukami, 1962 va Mizukami, Wakimoto, 1969 dat tén là Pseudomonas oryzae, cuối cùng Oku, 1972 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gay nên
Bệnh bạc lá lúa trở nên phơ biến ở tat ca các vùng trồng lúa trên khắp
thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1957), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ
sau hịa bình lập lại (1945) trên các giống lúa địa phương cao cây Sau đĩ, do phong trào thâm canh lúa tăng cao đã làm bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh trên diện rộng và phức tạp, khĩ phịng trừ và thường xuyên gây hại nặng ở vụ mùa Bệnh đã phát triển thành dịch lớn ở một số tỉnh Đồng bằng sơng Hồng trong vịng từ năm 1968 - 1975 Trong những năm gần đây, ở miền
Trang 41.2 Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra
Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa tồn thế giới giảm từ
10-20% do các bệnh vi khuẩn, trong đĩ 50% là do bệnh bạc lá gây nên
(Mew, 1989)
O Viét Nam bénh da duoc phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên
các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc
Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm cây
bị nhiễm bệnh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tác hại của bệnh chủ yếu là
làm cho lá địng sớm tàn khơ xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa Theo nghiên cứu của Tika, Mew & cộng sự, 1999 năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bơng và
khối lượng 1000 hạt
1.3 Triệu chứng bệnh
Vi khuẩn Xøò gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là:
bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (cịn được gọi là Kresek) Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong
nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc
dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh Các giống lúa khác
nhau cĩ thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá Triệu chứng
vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên
hoặc cũng cĩ thé là do độc tố (toxin) của vi khuan san sinh ra
Trang 5Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài
theo gân chính, cĩ khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra Vết bệnh
lan từ mép ngồi vào gân lá theo đường gợn sĩng Vào lúc trời âm hoặc buổi
sáng sớm, đầu hoặc mép lá cĩ dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuân màu hồ phách
Hiện nay cĩ hai dạng triệu chứng là bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh Trong đĩ, dạng bạc lá gợn vàng phổ biến hơn
1.4 Quy luật và các yếu tơ ảnh hướng đến phát sinh, phát triển bệnh
1.4.1 Quy luật phát sinh, phát triển
Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc
Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90
%, đặc biệt khi cĩ mưa to và giĩ lớn lam rap nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân Vu chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, cịn vụ mùa là tháng 8-9
khi cĩ nhiều mưa bão gây tơn thương cho lá lúa
Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm địng
đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá
Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá Xoo cho thấy ở mỗi
vùng, lãnh thổ lại cĩ một số chung vi khuẩn bạc lá đặc trưng Sự cĩ mặt của
các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và điều kiện
tự nhiên của mỗi vùng Như ở Philipin ton tai 6 chung, Nhat Ban 12 chung, An D6 9 chung (Tika B Adhikari và cộng sự, 1999) Cịn ở Việt Nam, theo
nghiên cứu của Phan Hữu Tơn và cộng sự năm 2002 đã phân lập và xác định
được ở miền Bắc Việt Nam cĩ 10 chủng đang ton tai Gan day, trong nghién
cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự, 2005
đã nhận thấy các nhĩm chủng Xøò thường xuất hiện đan xen, ở một địa
Trang 6hiện điện ở nhiều địa phương Trên một vết bệnh đơi khi cĩ thể tồn tại một
hoặc một 86 chung vi khuẩn nhất định
1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh
Cĩ nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển
của bệnh Âm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo giĩ bão khơng những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn đễ dàng xâm nhập mà cịn tạo
điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chĩng
Phân bĩn và thời kỳ bĩn cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát
sinh phát triển của bệnh Lượng đạm bĩn lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Bĩn sớm, tập trung
sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bĩn muộn, rải rác Bĩn đạm cân đối với
lân và kali cũng làm giảm khả năng nhiễm bệnh Tuy nhiên, nếu bĩn quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bĩn thêm lân và kali cũng khơng cịn tác dụng
Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cần
cỗi Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bĩng bệnh cũng phát triển mạnh hơn
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của
bệnh bạc lá Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với
các giống lúa nhập nội cĩ thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn Theo điều tra của Viện bảo vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm
1993 — 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%,
Trang 71.5 Nghiên cứu về cách chẵn đốn bệnh bạc lá
Hiện nay đã cĩ nhiều phương pháp khác nhau đề chân đốn bệnh bạc
lá Mỗi phương pháp đều cĩ ưu và nhược điểm riêng của mình Cĩ thể kể ra ở đây một vài phương pháp và kỹ thuật chân đốn phổ biến như sau:
- Phương pháp giọt dịch - Phương pháp ELISA
- Phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting)
- Su dung que DNA/RNA
- Phương pháp thấm hút nén (Squash blot method)
- Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mỗi XOR theo Adachi
và cộng sự, 1990
Trong số các phương pháp kể trên thì phương pháp của Adachi, 2000 là tiên tiến và cho kết quả chính xác nhất Phương pháp này khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp khác và là phương pháp thích hợp được sử dụng trong điều kiện nghiên cứu tại phịng thí nghiệm
Các bước thực hiện phương pháp này như sau: thu thập mẫu bệnh,
phân lập, chiết tách DNA của chúng và tiến hành PCR nhân đoạn DNA bảo thủ nằm giữa 2 gen tổng hợp cấu tử rDNA 16S và 23S của vi khuân Xoo với
chu trình nhiệt độ và thành phần phản ứng PCR thích hợp
Sử dụng 2 đọan mỗi cĩ trình tự:
XOR-F: 5'- GCA TGA CGT CAT CGT CCT GT-3' XOR-R2: 5'- CTC GGA GCT ATA TGC CGT GC-3'
1.6 Các biện pháp phịng trừ bệnh bạc lá
Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại,
phun thuốc trừ bệnh, tăng cường chăm sĩc bĩn phân đúng cách, thích hợp và điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giống kháng bệnh Ngồi ra cịn cĩ
Trang 8Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là
biện pháp cĩ hiệu quả và khả thi nhất 2 Vi khuan Xoo
2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc
Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadacedae, cĩ dạng hình gậy hai đầu hơi trịn, cĩ một lơng roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 um Trên mơi trường nhân tạo khuẩn lạc cầu vi khuẩn cĩ dang hình trịn, màu vàng sáp, rìa
nhẫn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm Vi khuẩn khơng cĩ
khả năng phân giải nitrat, khơng dịch hố gelatin, khơng tạo NHạ, nhưng tạo HS, tạo khí nhưng khơng tạo axít trong mơi trường cĩ đường Nhiệt độ
thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30C, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5°C, tối đa 40°C nếu cao hơn 53°C sẽ làm vi khuẩn chết Vi khuân cĩ thể sống
trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5 thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2
Hình 1 Ảnh hiển vi điện tử quét tế bào — Hình 2 Hình dạng tế bào vi
vi khuẩn Xoo trong mạch dẫn của lá khuẩn bệnh bạc lá lúa (Anna
Trang 92.2 Nghiên cứu đặc điểm bộ genom Xoo
Hiện đã cĩ một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi
khuan Xoo, trong đĩ gần đây nhất phải kể đến là cơng trình nghiên cứu về cấu trúc genom của hai chủng phơ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật
Bản) và KACCI033I (Hàn Quốc), được cơng bố trên website:
http://microbe.dna.affre.go.jp
2.2.1 B6 genome Xoo ching MAFF311018
Hinh 3 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018
Hình phía trên trình bầy cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xøo
chủng MAFF311018 biểu hiện bằng tám vịng trịn Vịng ngồi cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị 100 kb, vịng thứ 2 và 3 biểu
hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác nhau tương ứng Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen chưa xác
Trang 10tụ tập của các gen zp và những gen gây độc avzr ký hiệu màu xanh Vịng
trịn thứ năm biểu hiện vị trí của các trình tự gắn chèn Vịng thứ sáu biểu thị
hàm lượng C + G của mỗi trung bình 20 kb của mỗi đoạn Vịng số bây biêu
hiện vị trí của các gen mã hĩa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn Cuối cùng là vịng số tám biểu hiện vị trí của các prophage cùng các gen của
phage
Theo dé genom ctia Xoo chủng MAFF 311018 gồm một nhiễm sắc thé
vịng đài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7% Bên trong khơng phát hiện thấy cĩ chứa một thể plasmid nào Trong đĩ phát hiện thấy cĩ hai bản copy của operon zzz và thứ tự liền kề một số gen như sau:
16S-tRNA“" -tRNA™ -23S-5S Genom chứa tổng số 53 gen mã hĩa tạo
thành các tRNĐAs đại diện cho 43 loai tRNA khác nhau
Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFS) trong gøenom chủng MAFF311018 thì cĩ 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%) proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi khuẩn Xoo nhưng chưa biết rõ chức năng Cĩ 190 gen (4%) được xác định là khơng tương đồng rõ rệt với những gen đã được xác định và cơng bồ trước đĩ của vi khuẩn
2.2.2 Cấu trúc genom chúng KACC10331
Theo Lee và cộng sự, 2008 thì genom vi khudn Xoo ching KACC10331 cĩ cấu trúc như sau: Tổng genom nhiễm sắc thể vịng dài 4.941.439 bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7% Genom cĩ 4637 khung
đọc mở, trong đĩ cĩ 3340 (72.0%) cĩ thể xác định được chức năng Khoảng 80% số gen trong đĩ được phát hiện thay trong các lồi vi khuẩn X axonopodis pv citri (Xac) va X.campestris pv campestris (Xcc) Tuy nhién,
245 gen được xác định là chi đặc thù đối với Xoo, trong đĩ cĩ 8 gen gây độc
Trang 11ứng siêu man (rp), nhimng gen sinh ra v6 polysaccharide, gen ma hdéa tao enzyme phan ra mang tế bào thực vật Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được
cơ chế tương tác giữa vi khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hịa thảo 2.2.3 Nghiên cứu trình tự chèn trên bộ genom Xoo
Hiện đã xác định được tất cả cĩ 611 trình tự chèn IS, chúng thuộc 25 kiểu chèn xen khác nhau trong bộ genom Xøo, chiếm sắp xỉ 10% tổng chiều dai cua genom vi khuẩn Tỷ lệ này là khá cao nếu so sánh với các lồi vi khuẩn gây bệnh thực vật khác, đây cĩ thé là một đặc điểm của vi khuẩn Xøo
Bảng 1 Liệt kê các yếu tổ IS cĩ mặt trong genom vi khuẩn Xoo ching MAFF 311018 number of number of partial name family group full-length (trunceted) structure copies copies ISXoi 155 155 42 2 orfA IãXo2 ISNCY 7 3 orfA IãXo3 155 182032 30 10 or fA / orfB I8¥o5 ISVCY 47 21 orfA ISXo7 15630 + ũ orfA IãXo& ISI 36 34 orfA 1522722 1530 20 12 orfA 1851173 ISNCY 8 2 orfA ISXoa2 15630 11 15 orfA
ISXaa3 IS? 18407 16 26 0rfA / orfB
ISXoo¢ Iss 1855 11 41 orfA
ISXoo5S 155 1855 10 2 orfA
18X06 155 1855 10 2 orfA
ISXoo7 155 155 2 ũ orfA
ISXoa8 Is¢ 11 3 orfA
ISXoa9 IS? 1857 1 1 orfA / orfB
ISXoal0 ISMCV 1 0 orfA
ISXũii unknown 46 0 orfA
IsƠeei2 unknown ISÂ 42 0 orfA
ISXeoi3 I83L 19 6 orfA
IsXool¢ ISS 5 1 orfA IRãXoeoi5 1530 2 16 orfA ISXeoié 15630 2 7 orfA others 183 0 8 unknown 0 8
Trang 12xác định được đầy đủ trình tự của 386 IS và cịn lại 225 IS đang được tiếp tục nghiên cứu Theo số liệu trình tự, người ta chia chúng ra thành 7 nhĩm
khác nhau, trong đĩ nhĩm IS5 và ISNCY phổ biến hơn cả, mỗi IS cĩ lần lượt từ 110 đến 63 bản copy Trong đĩ cĩ 6 trình tự đặc thù là: ISXoo11, ISXoo012, ISXoo/3, ISXoo/4, ISXoo15 va ISXoo16
2.2.3 Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity- related genes)
- Nhĩm gen hrp
Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen #zp mã hĩa cho hệ thống tiết dịch loại II (TTSS) là đĩng vai trị quan trọng nhất Những gen này thường ổn định trong các vi sinh vật gây bệnh ở động vật và
thực vật, chúng tiêm những protein hữu hiệu vào tế bào kí chủ Nhĩm gen
hrp tim thay trong genom Xoo gém 27 gen ki hiéu tir hpa2 dén hpaF va chúng cĩ cấu trúc giống với cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc lồi Xen/homonas, loại trừ trường hợp ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF Trong genom vi khuẩn Xoo, thấy cĩ 3 gen đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF Một gen định vị tại phần sau của gen hpaB (hrpE2) và cĩ cùng hướng phiên mã với operon hrpE Hai gen cịn lại cũng nằm ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng phiên mã theo chiều ngược lại Theo sơ đồ này cĩ 4 tương đồng chuyền vị liên tục nằm ở vùng giữa
Trang 13^
( Conserved Arp region t }( Variable region )
reac" yp, MBB tse pe Ma ac ¢ FT w Js U V ars ap a7 8564 08207 040%4F1 apa P a a — — —— B _—fzZ2xoo0102x000104 Xoo hipE! (hoeB, (hịpE3) (hoaO) ISXoð8 ISXơf ISXo8 ISXeoÐ6 hệt - hoạF e ep >) = |: mmỳ—mmmỳ X000103 (Apsc) AE? hypornetical Xac PE (2B protein hưpF hpaF hypothetical hưpE? protein Xec ApEt (hpah hip Dip sess°se mm) cnH—— ”—" —dB————— $imilar to € tereanal region of XOO0103 Hình 4 So sánh tổ chức di truyền nhĩm gen hrp của 3 lồi vì khuẩn Xoo, Xcc và Xac
A Tổ chức di truyền của những gen bình thường
B Những vùng biến động của nhĩm gen #z? Mỗi một gen cĩ tên nằm trên
hoặc dưới các mũi tên Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các
Nueleotit được xác định trong ngân hang gen (GenBankdatabase) Trình tự được xác định trên cơ sở sử dụng các gen của chung X.axonpodis pv.citri 306 (kí hiệu AE008923) và gen của chủng X.campestris pv.campestris ATCC 33913 (kí hiệu AE008922)
- Nhĩm gen awr
Trang 14d6c avrBs3/pth, day là một trong những nhĩm gen khơng độc avr Trong genom vi khudn Xoo, nhém tac giả đã phát hiện cĩ 17 bản copy phân bố và
tụ tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây: Bang 2 Ban liệt kê I7 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth No of Gene ID position stramd av region ra Tepe at note units 001132 1228783-123 1791 1 3,009 12.5 X001134 1232781-1236191 1 3411 16.5 X001136 1237181-124 1629 1 4440 26.5 001138 12426 19-1246335 1 3/717 19.5 XOOL996 3201149-220466¢ I 3,516 17.5 001998 22056 54-2209376 I1 3,723 19.5 3002001 23212644-2216771 T 4128 33.5 002127 2352186-2356040 I 3855 20.5 002129 23570 30-2360329 Hi 3300 15.5 002158 23831 15-2386828 + IV 3/714 19.5 4002160 23879 18-239 2653 + IV 4836 30.2 ™Mo02667 2999333-300 1924 : Vv 2592 17.5 imsertion of ISXa00 002864 3213703-3218643 + VI 4941 31.5 4002865 32196 33-3223352 + v1 3,720 19.5 002866 3224342-3228793 + VI 4452 26.5 4002868 3229783-3234123 + VI 4341 25.5 ident alwith avi? XO0+014 45254 16-4529345 + a 3,930 21.3
Nuanba of 102-bp (Bt -aa) repeat wuts ithe central domain
Mặc dù chúng cĩ trình tự rất khá giống nhau nhưng chúng hồn tồn
phân biệt được với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp
lai nam ở vùng trung tâm Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2
đến 4 gen avr hầu hết nằm ở những vùng khơng gây độc, và những yếu tố di động như ISs và những gen cĩ lien quan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh VỊ trí của những gen khơng gây độc này được trình bày ở
hình dưới Riêng vùng avr V, chúng bị ngắt quãng bởi một gen di động là
ISXoo9 nằm ở đầu 3° Hướng phiên mã của gen khơng độc avr ở vùng I, II
và III là sợi anti-sense, nhưng đối với vung IV, VI va VII thi la soi sense
Trang 15truncated truncated 1$9992 transposase Phage related transposase ©oneerued tai transposase “s2 ween —_ ~ m 001132 X01134 XD 1136 X00 1138 1 ¬" XG018 XƯ01098 XũưZ001 " conserved as 8 truncata” 1SXoo 5 alte nein ISXe# coreerweed XD 02127 DCO02120 = m oe —_———— serene led „ - e.en
mí protein phage related x phage related ~
genes cluster "ơơ protein 168 l6) -ôe<=e Saree XO 02153 x0027160 AT ane -šE- a5 truncated truncated X002697 transposase transposa se vw ISXœo 8 ISXo# transposase wansposase phage related con served Protein protein x002864 XODO2965 XO02966 “02868 " + mm mm mm | man); conserved protean 240044014 truncated p Se Vu) 3kh
Hình 5 Bản đồ vị trí các gen khơng độc avr/pth của vì khuẩn Xoo
Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều đài của mỗi gen nh ư sau: v
ung I dai 1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186- 2,360,329 bp; IV, 2,383,115-2,392,653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; va vung VII dai 4,525,416-4,529,345 bp
- Gen diéu hoa HrpX
Trong vi khuan Xanthomonads, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc
TTSS và một số gen hiệu ứng được điều hịa bởi sản phẩm của các gen
hrpG v à hrpX, các gen sản phẩm này đều cĩ mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xzc và Xcc Một số gen hoạt động phụ thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự giống nhau la : TTCGC N15 TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box)
Hộp PIP này là một chỉ tiêu để phán đốn liệu gen nào đĩ cĩ bị điều khiển
Trang 16copy hộp PIP hồn chỉnh hoặc gần hồn chỉnh cĩ trình tự:
TTCGN N15 TTCGN, nằm ở vùng điều khiển của gen Năm trong số
đĩ năm ở cụm tụ điêm của các gen Arp, so con lai nam rai rac 6 vung khac trong genom Bảng 3 Danh sách các gen chịu sự điều hịa bởi gen HrpX trong genom Xoo PP position Distarce Gere ID Gere product hợp gene cluster 87,199 214 xOO008) = Hpa2 87,290 136 X000081 Hpal 96,205 82 <OO0090 HypBl 96,243 70 XOO(MI HwU (HCl) 99,847 249 XOOD0M HrQ(HmDl) others
107,769 97 XOODID —_rypothetical protein
1387 66 XOOUL48 avmulerw prolem(AvrHs2 hormolsg)
398,953 47 XOO(G27 —_rypothetical protein
482,182 147 XOO(M4O — ribemekosils-dplcsphateredoetase betaclain(NrdB) 535,147 2L XOO(MSĐ conserved Iyypothetical protein
1,293,989 250 XOO1183 RNA polymense sigma-S4 factor(RpaN) 1,630,648 65 XOOI4S8 —_rypothetical protein
1,819,604 7l XOOI6ếØ2 lamenrihprobsim
1,823,472 I7l XOOI66® ccmervelhypothebealpotirt 1,833 (4 192 XOOIØðM conserved lyypoyhetical protein 1,881,304 18 001705 Ton B-dependent receptor (BtaB)
2012015 Bl XOOIS2 homocysteine S-amethyltramsferase (MlmuM) 2,017,385 147 XOOIS32 conserved hypothetical protein
2,028,028 94 XOOIS42 —comserved hypothetical protein 2,128,487 296 XOOI925 œoghtarats delgdiogersse(CMhẢ) 2151,054 Z8 XOOI9S) traweripiomalreeulator
2,431,957 lđl X002193 6phøphoehaecemoletmze 2,519,236 218 XOOZ263 — cowverved hypothetical protein 2,824, 592 95 002532 peptidase
3,063,415 219 XOOZTI6 —_beta-keto-adipate enol lactone: hydrolase (PesD)) 3,246, 583 192 X002877 —comerved hypothetical protein
3,281,958 191 X002901 conserved lyypothetical protein 3,285,423 118 002905 conserved hypothetical protein 3,359,421 154 XOO296? — comerved hypothetical protein 4,301,354 196 XOO3800 —comerved hypothetical protein
Trang 17II Đa đạng các chủng vi khuẩn Xoo
2.1 Tổng quan da dang sinh hoc
Theo Cơng ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học”
(biodiversity, biological diversity) cĩ nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh
vat sống ở tắt cả mọi nơi, bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn, trong đại đương và các hệ sinh thái thuỷ vực khác, cũng như các phức hệ sinh thai ma các sinh vật là một thành phân; thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong
một lồi, giữa các lồi và giữa các hệ sinh thái
Cĩ thể coi, thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên được Norse and McManus, 1980 định nghĩa, bao hàm hai khái niệm cĩ liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một lồi) và đa dạng sinh thái (số lượng các lồi trong một quần xã sinh vật) Hiện nay cĩ ít nhất 25 định nghĩa nữa cho thuật ngữ "đa dạng sinh học Định nghĩa được đưa ở
trên là định nghĩa được dùng trong Cơng ước Đa dạng sinh học 2.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng sinh học
Nhìn chung, việc nghiên cứu đa dạng sinh học cĩ ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc phân lập và sử dụng một cách hiệu quả nhất các nguồn tài
nguyên sinh học cĩ lợi cũng như cĩ được những biện pháp phịng tránh hữu hiệu nhất đối với các nguồn tài nguyên sinh học cĩ hại trong sản xuất và đời
sống của con người Đối với vi sinh vật gây bệnh, việc xác định chính xác
thành phần và số lượng các chủng ở một vùng sinh thái nhất định cĩ một ý
nghĩa đặc biệt quan trọng Vì cĩ xác định được đúng chủng loại mới xác
định được khả năng kháng hữu hiệu của từng gen kháng đối với mỗi chủng,
từ đĩ cĩ chiến lược quy tụ nhiều øen kháng hữu hiệu vào một giống nhằm tạo ra tính kháng bền vững trong tương lai đối với từng vùng sinh thái nhất
định Ngồi ra việc xác định đúng thành phần chủng cịn giúp cơng tác kiêm
Trang 18tiêu diệt bởi một số thuốc nhất định từ đĩ giúp nhà bảo vệ thực vật sử dụng
thuốc hĩa học để phịng trừ bệnh một cách hợp lý
2.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học cúa vi khuẩn Xøo
hiện nay trên thế giới
Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D Krishnaveni, A.P.K.Reddy va
R.V.Sonti da thu thap 67 isolate tt năm 1994 dén 1995 trén 18 vung cua An Độ Sử dụng phương phap DNA (RFLP) véi hai mau do (probe) 1a các trình tu lap lai riéng biét:
Probe dua vào trình tu gen avrXal0
Probe dya vào trình tự yếu tố chén IS1112
Kết quả, với Probe avrXa10 tir 67 Isolate tac giả đã phân ra 9 kiểu sai khac phan tir dya vao enzyme cat gidi han BamHI Probe IS 1112 phan ra 11 kiểu sai khác phân tử dya vao enzyme cat gidi han EcoRI Cuéi cing, cac tác gia tong hop ca hai Probe avrXal0 va Probe IS 1112 thu duoc 15 kiéu sai khác phân tử
Nam 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, va Jan E Leach su dung 2 phuong phap rep-PCR va IS-PCR dé tién hanh nghiên cứu da dang di truyén
đối với 171 Isolate phân lập được ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal Trong đĩ tác giả sử dụng 3 mỗi ERICIR, ERIC2 (trong cùng một phản ứng)
cho rep-PCR và mồi J3 cho IS-PCR Mơi ERICIR va ERIC2 được thiết kế
trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (enterobacterial
repetitive intergenic consensus) cĩ kích thước 124 - 127 bp Con mơi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113 Kết quả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 Isolate nghiên cứu
ERICIR: 5’ - ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC - 3’
Trang 1943: 5’ — GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG - 3’
Nam 2000, Edmilson R Gonc: alves va Yoko B Rosato su dung mơi
BOXAIR với trình ty: 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’ cho phản ứng rep-PCR Kết quả từ 55 Isolate thu thập được đã phân lập thành 16
species (loai) Xanthomonas and Pseudomonas syringae pv Passiorae
Tiép nối thành cong cua Tika B.Adhikari(1999), thang 6 nam 2007, J¡ajian và cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mơi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xòo tồn tại tại Trung Quốc Khi so sánh với DNA ladder và so sánh
với trình tự genome của 2 chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018
(Nhật Bản), các tác giả đã phát hiện ra 3 locus mới trên trình tự chèn ISI112: (A) IS1112d GATATCGATATGGGT|GGCGAATT // AAGCCGCC| GGTGGATTCTTCCGGCG GATATCGATATGGGT GGATTCTTCCGGCG 405 (B) IS///2a TGAGCCAGTGTTTTG|GGCGGCTT // AATTCGCC ACAGAAAACGCGGGT TGAGCCAGTGTTT ACAGAAAACGCGGGT (©) IS/112b GCTTCAACCGCCGATTCGACC |GGCGGCTTCAACTCTGGAT GCTTCAACCGCCGATTCGACCTGAAACAGATGCTGCCGCG SX02 957 Hình 6: ba trình tự locus mới trên trình tự chèn IS1I I12 được phát hiện tại Trung Quốc (2007)
2.5 Nghiên cứu đa dạng vi khuân Xøø tại Việt Nam
Những nghiên cứu ré da dang vi khudn Xoo tai mién Bac Viét Nam
Trang 20hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhĩm chủng cĩ biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dịng đắng đơn gen Cịn những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thực thụ thì gần như chưa được tiễn hành hoặc mới chỉ sử dụng chỉ thị phân tử để xác
định vi khuẩn Xøo mà thơi
Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 cĩ 4 nịi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta (Nguyễn Văn Viết, 2005) Nhưng
nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tơn và cộng sự, 2002 thì trên các mẫu
bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân biệt được 154 isolate trong đĩ
64 isolate thuộc 16 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tuy trong kết quả
nghiên cứu của tác giả cĩ kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là
chủng 2 và chủng 3 ở vùng Đồng bằng sơng Hồng Song những chủng cịn lại vẫn cĩ tiềm năng gây nguy hiểm vì đù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn cĩ khả năng gây bệnh với các giống lúa Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chĩng và đa dạng, địi hỏi cần phải cĩ những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn
Xoo dang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đĩ cĩ kế
Trang 21Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu sử dụng II mẫu vi khuẩn Xoo là các chủng vi
khuân đã được Phan Hữu Tơn và cộng sự phân lập năm 2002 bằng phương
pháp lây nhiễm nhân tạo (Bảng 1) Bên cạnh đĩ cịn sử dụng 9 mẫu vi khuân
Xoo (ki hiệu bằng số 1,2,4 ) mới được tiến hành thu thập và phân lập ở
một số huyện ngoại thành Hà Nội trong vụ mùa 2007 (Bảng 2) Các mẫu vi khuẩn đều được bảo quản tại phịng thí nghiệm sinh học phân tử trực thuộc
Khoa Cơng nghệ sinh học — trường ĐH Nơng nghiệp Hà Nội
Bảng 4 Danh sách và nguồn gốc của 11 chúng vi khuẩn phân lập năm
2002 (Phan Hữu Tơn và cộng sự, 2002) Tên mẫu Tên giống thu thập | Địa điểm thu thập 1 RI HAU 01043 TN 13-4 Hà Nội
2 R2 HAU 02036I | Nêp Tân Thuận Châu, Sơn La
3 R3 HAU 020083 | Nhị ưu - 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An
4 R5 HAU 020131 | Khang Dân Diễn Châu, Nghệ An
5 R6 HAU 020346 | Nhị ưu — 838 Yên Bình, Yên Bái
6 R7 HAU 020191 | Q5 Bình Giang, Hải Dương 7 R8 HAU 020201 | Nêp Thơm Bình Giang, Hải Dương
§ R9 HAU 020371 |IR 64 Thuận Châu, Sơn La
9_ |RI0 |HAU02032I | Hybrid rice Yên Bình, Yên Bái
10 |RII | HAU 020081 | Nhị ưu - 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An
11 |RI2 |HAU010081 | Té do Hai Duong
Trang 22Dung 9 dong dang don gen (dong chi thi) la: IRBB1, IRBB2, IRBB3,
IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBBI0, IRBBI14, IRBB2I chứa lần lượt các gen kháng bệnh la: Xa-1, Xa-2, Xa-3, Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-10, Xa-14, Xa-21 Đối chứng là giống IR24 mẫn cảm với bệnh bạc lá (khơng chứa một gen kháng bệnh bạc lá nào) Bảng 5 Danh sách và địa điểm các mẫu bệnh thu thập
Tên giống thu thập | Địa điểm thu thập Thời gian
I1 |I | Té thom (BT7) Cơ Loa, Đơng Anh, Hà Nội 8/9/2007
2 12 Khang dân Cơ Loa, Đơng Anh, Hà Nội 8/9/2007
3 |4 | Khang dân Tiên Dược, Sĩc Sơn, Hà Nội 8/9/2007
4 |5 | Tẻthơm(BT7) Tiên Dược, Sĩc Sơn, Hà Nội 8/9/2007
5 |8 | TẻThơm2 (BT7) Tiên Dược, Sĩc Sơn, Hà Nội 8/9/2007
6 12 |Q5 An Bình, Nam Sách, Hải Dương 9/9/2007
7 | l5 | Tẻ Thơm(BT7) Cộng Hồ, Chí Linh, Hải Dương | 9/9/2007
8 |36 |Q5 Thanh Trì, Hà Nội 16/9/2007
9 |70 | TH3-3 Thanh Trì, Hà Nội 19/9/2007
3.4 Nội dung nghiên cứu
- Thu thập, phân lập và xác định chính xác các chủng vi khuẩn Xòo từ
một số mẫu vi khuẩn mới thu thập ở Hà Nội và lặp lại ở 11 mẫu vi khuẩn
Xoo theo Phan Hữu Tơn và cộng sự, 2002 Phân chủng bằng phương pháp
lây nhiễm nhân tạo dịng đắng gen
- Xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA trên cơ sở sử
dụng và phân tích những trình tự lặp lại và trình tự chèn ISII12, IS1113 của 20 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu
- Thiết lập cây phân loại thể hiện mối tương quan về mặt di truyền
Trang 233.5 Phương pháp nghiên cứu
Nội dung và phương pháp nghiên cứu của đề tài được tĩm tắt như sau: Phân lập, nuơi cây vi khuân Xác định vi khuẩn Xoo bằng PCR
Nghiên cứu đa hình Nghiên cứu đa dạng di các mẫu vi khuẩn bằng truyền các mẫu vi khuẩn
lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp rep-
PCR và IS-PCR
3.5.1 Phân lập và nuơi cấy các mẫu vi khuẩn
- Phương pháp tiến hành theo N Furuya và cộng sự, 2003: Các mẫu vi khuân được phân lập bằng phương pháp nuơi cấy đơn tế bào trên mơi
trường đặc hiệu Wakimoto Cơng việc được thực hiện trên đĩa petri trong
điều kiên vơ trùng trong buồng cấy sau đĩ mẫu vi khuẩn được lưu giữ trong ống nghiệm
- Chuẩn bị mơi trường Wakimoto:
Thành phần mơi trường (tính trên 500ml mơi trường):
Trang 24+ Khoai tây gọt vỏ, cho vào nồi, thêm 700ml nước cất và đun sơi trong 15-20 phút sau đĩ thu lấy dịch
+ Hịa tan dịch khoai tây với đầy đủ hĩa chất và thêm nước cất cho đủ 500ml, dùng khuấy từ khuấy đều và chuẩn độ cho pH = 7,0
+ Đem hấp khử tring 6 121°C; 1,5atm; trong vong 20’
- Phân lập bằng phương pháp đơn tế bào:
+ Từ mẫu bệnh thu được cắt thành những đoạn nhỏ 5 x 5 mm phần tiếp
giáp giữa mơ bệnh và mơ khoẻ của vết bệnh đang phát triển + Ngâm các đoạn cắt trong cồn 70% trong 10 giây + Chuyền sang ngâm trong nước Javen trong 5 phút + Rửa sạch trong nước vơ trùng 2 — 3 lần
+ Thực hiện cắt nhỏ và dùng chày nghiền mẫu với 1 ml nước cất vơ trùng đến khi được dung dịch đồng nhất
+ Hút Iml dung dịch thu đựơc cho vào 9 ml nude cất, thực hiện 3 lần
+ Hut 1 ml tir dung dich đã pha lỗng ở cả 3 nồng độ pha lỗng 10,
100, 1000 lần trải đều trên mặt các đĩa petri
+ Sau 2 — 3 ngày xuất hiện khuẩn lạc Quan sát và chọn các khuẩn lạc cĩ hình đạng trịn, nhẫn bĩng, lỗi lên, màu vàng chanh nổi trên bề mặt thạch
Dùng que cấy vơ trùng tách 4 đơn khuẩn lạc riêng rẽ ra 1 đĩa mơi trường, cấy theo đường ziczăc Sau đĩ cho vào tủ định ơn ở nhiệt độ 25.5°C khoảng
1-2 ngày Nuơi cấy và được bảo quản trong mơi trường Skim milk
- Mơi trường báo quản vi khuẩn:
Các mẫu vi khuẩn sau phân lập được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ là
— 80C trong mơi trường Skim milk Thành phần mdi trvong Skim milk: + Skim-milk:10 g
+ L-glutamic:1.5 g
Trang 253.5.2 Sứ dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo
Trong một vết bệnh bạc lá đang phát triển, bên cạnh vi khuẩn Xoo cĩ
thể tồn tại nhiều loại vi khuẩn khác Những loại vi khuẩn này cĩ thể cũng cĩ khả năng tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẫn bĩng giống như vi khuẩn Xoo khi
nuơi cấy, do đĩ khi phân lập chúng ta khĩ cĩ thể phân biệt được chúng
Chúng tơi đã tiến hành phương pháp sử dụng PCR được đề xuất bởi Adachi, 1990 để nhận biết các vi khuẩn Xoo dựa trên trình tự bảo thủ giữa 2 đoạn
tổng hợp rDNA 16s và 23s của chúng Đầu tiên, chúng tơi sử dụng dung dịch protease K để tiến hành chiết tách DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn đã phân lập Sau khi đã kiểm tra kết quả chiết tách trên gel agarose 1%,
chúng tơi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mơi XOR-R2, XOR-F với
thành phần phản ứng PCR và chu kì nhiệt độ thích hợp Sản phẩm PCR
được điện đi và so sánh kích thước với DNA ladder 1kb để đưa ra kết luận
cuối cùng
- Chiết tách DNA tổng số của vi khuẩn Xoo
+ Hịa tan 1-2 vịng que cấy vi khuẩn trong 200u1 hỗn hop dung dich
Protease K và giữ ở 56°C trong 15 phút
+ Đột ngột tăng nhiệt độ lên 80°C trong 15 phút để làm biến tính Protease K sau đĩ ly tâm ở 13.000 vịng/phút trong Š phút
+ Cuối cùng hút lớp dịch lỏng phía trên (DNA) và loại bỏ phần cặn phía đưới sang một ống eppendoff mới và bảo quản ở 4°C
- Điện di kiểm tra kết quả chiết tách:
+ Tiến hành điện di điện di sản phẩm chiết tách trén gel agarose 1%,
sử dụng nguồn điện 1 chiều cĩ U = 65V, trong khoảng 45 > 60 phút
+ Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết
quả trong buồng chụp UV Những mẫu chiết tách thành cơng sẽ xuất hiện
Trang 26- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mỗi XOR-R2, XOR-F:
+ Các mẫu DNA chiết tách thành cơng sẽ được sử dụng đề thực hiện phản ứng PCR Cặp mồi sử dụng: Tên mồi Trình tự mồi XOR - R2 5’ — CTCGGAGCTATATGCCGTGC - 3° XOR-F 5’ — GCATGACGTCATCGTCCTGT -— 3”
+ Thanh phan phan ung PCR: \x Taq buffer; 2.5 mM MgCl; 0.2 mM
dNTPs; 0.2 uM Primer XOR — R2 va Primer XOR — F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 l DNA khuơn cịn lại la water PCR, tong cong là 25uI
+ Tiến hành chạy PCR theo chu trình nhiệt: nâng lên 94°C trong 30s,
hồn thành 30 chu kì với 94°C trong 1 phut — 60°C trong 30s — 72°C trong 1
phút, sau đĩ giữ ở 72°C trong 7 phút va cuối cùng là bảo quản sản pham
PCR ở4C
- Điện di kiểm tra kết quả PCR:
+ Tiến hành điện di điện di sản phẩm PCR cĩ kèm DNA ladder IKb để so sánh kích thước trên gel agarose 2%, sử dụng nguồn điện 1 chiều cĩ U
= 80V, trong khoảng 60 > 90 phút
+ Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV Những mẫu chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ cho hiện I vạch băng sáng cĩ kích thước 470 bp trên bản gel Những mẫu khơng phải là Xoo sẽ khơng cho hiện vạch băng hoặc vạch băng khơng đúng kích
Trang 273.5.3 Xác định da dạng di truyền DNA của các mẫu vỉ khuẩn Xoo bang pháp rep PCR và IS-PCR
- Phương pháp rep-PCR (repetifive sequence-based PCR):
+ Theo Tika B Adhikari và cộng sự, 999 rep-PCR là phương pháp sử
dụng dé nghiên cứu đa dang di truyền dựa trên sự đa hình về các trình tự lặp lại trong bộ genome của vi khuân nghiên cứu, những trình tự này là bảo thủ giữa các chủng vi khuẩn nên cĩ thể sử dụng chúng đề nghiên cứu sự đa dạng
của các chủng trong cùng một lồi
St dung méi don ERIC2F (Vera Cruz, 2003) và mỗi BOXAIRF
(Adhikari, 1999) với trình tự như sau: Tên mỗi Trình tự ERIC2F 5— AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG - 3' BOXAIRF_ | 5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3'
+ Thành phân phản ứng PCR : : 1x Taq buffr; 1.5 mM MgCl;; 0.2 mM dNTPs; 0.2 uM primer ERIC2F ( va primer BOXAIRF); 1.25U Taq DNA polymerase; 2 4] DNA tempale solution cén lai 1a water PCR, téng cong 1a 25 ul
+ Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95°C trong 7phút, hồn thành 35 chu kì với 94°C trong 1 phút - 48°C (với ERIC2F) và 53°C (với
moi BOXAIRF) trong 2 phut — 72°C trong 1 phút, sau đĩ giữ ở 72°C trong 7
phút và cuối cùng là bảo quản ở 4°C
San pham PCR được điện di trên gel agarose 1% Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu được thống kê dưới dạng nhị thức và sử đụng phần mềm
Trang 28- Phwong phap IS-PCR (insertiton sequence-based PCR)
+ Cũng theo nghiên cứu của Adhikari, 1999 thi trong b6 genome cua vi khuẩn Xoo cĩ nhiều nhĩm các trình tự chèn với kích thước, số lượng khác
nhau Ơng đã chỉ ra rằng 2 trình tự IS1112 và IS1113 sẽ thê hiện tốt nhất sự
đa dạng giữa các chủng Xoo Sử dụng kỹ thuật IS-PCR với mỗi đơn J3F [5°
— GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG - 3’] cho phép nghiên cứu 2 trình tự đĩ
+ Thành phan phan ung PCR: 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl); 0.2 mM
dNTPs; 0.2 uM primer J3F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 nl DNA tempale solution con lai là water PCR, tong cong là 25uI
+ Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95°C trong 7phit, hồn
thành 30 chu kì tại 94°C trong 1 phút — 48°C trong 2 phút — 72°C trong I phút, sau đĩ giữ ở 72°C trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4°C
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu cũng được thống kê đưới dạng nhị thức và sử đụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích, đánh giá sự đa dạng của các mẫu vi khuẩn 3.5.4 Nghiên cứu đa hình các mẫu vì khuẩn bằng phương pháp lây
nhiễm nhân tạo
Phương pháp tiến hành theo đề xuất của Taura và cộng sự, 2000:
- Chọn thời điểm lây nhiễm: Lây nhiễm lúc trên mặt lá lúa khơng đọng sương hay nước mưa, thời tiết thống mát, khơ ráo Đảm bảo sau khi lây
nhiễm ít nhất 3h trời khơng mưa to Tiến hành lây nhiễm vào cuối của giai
đoạn đẻ nhánh đến giai đoạn lúa bắt đầu phân hĩa địng
- Cách thức tiễn hành lây nhiễm: Các chủng vi khuẩn được nuơi cấy trên
mơi trường Wakimoto trong khoảng từ 72 - 96 tiếng (3 - 4 ngày) Trộn đều
4 que cấy vi khuân trong 10ml nước cất đã được hấp khử trùng, sau đĩ dùng
Trang 29hành lây nhiễm Mỗi mẫu vi khuẩn dùng một kéo khác nhau Cat 2-3 cm đầu lá, cắt ít nhất 5/mau vi khuan/dong dang don gen
- Kiểm tra kết quả lây nhiễm: Sau 18 ngày kê từ ngày lây nhiễm, tiễn hành
đo chiều dài vết Dùng thước đo chiều dài vết bệnh tính từ vết cắt lây nhiễm cho đến vị trí giữa vết chết hoại và vết lan Ghi chép số liệu, xử lí số liệu, lập
bảng kháng nhiễm và phân tích sự đa hình các mẫu vi khuẩn cần phân lập dựa vào bảng kháng nhiễm theo chương trình NTSYSpc2.0
3.5.5 Cách thức phân tích số liệu
Số liệu được phân tích, đánh giá bằng phần mềm NTSYSpc2.0, xây dựng theo cơng thức tính hệ số đồng dạng di truyền của M.Nei và Li, 1979:
Sự =2N/(Đ¡ + Nj) Trong đĩ: Ni: vach của giống i
Nj: vach cua giống j
Nị: vạch chung của hai giống i và j
Kết quả số vạch nhân lên trong rep-PCR, IS-PCR sẽ được chuyên
sang dạng nhị thức Cách đánh giá: cĩ vach = 1, khong cĩ vạch = 0 Sử dụng
Trang 30Phần 4
KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và Nuơi cấy các mẫu vi khuẩn
Chúng tơi đã nuơi cấy thành cơng 20/20 mẫu vi khuẩn trên mơi trường
nhân tạo Wakimoto Sau 2 ngày nuơi cấy, các mẫu vi khuẩn đều tạo khuẩn
lạc màu vàng, nhẫn, bĩng, ăn lan 2/3 diện tích bề mặt mơi trường nuơi cấy đặc nghiêng Sau khi phân lập, các mẫu vi khuân được cấy chuyền sang ống nghiệm đề bảo quản mẫu phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo
Bry» i mm
SAT 2 NGAY CNT CAGES
Hình 7 Các mẫu vi khuẩn được nuơi cấy trong Ống nghiệm
Như vậy cĩ thể khẳng định mẫu vi khuẩn bảo quản tại phịng thí
nghiệm vẫn cĩ khả năng sống tot và phương pháp dùng mơi trường
Wakimoto 1a phù hợp với nuơi cay vi khuan Xoo
4.2 Sử dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo
- Kết quả chiết tách DNA: chúng tơi đã tiễn hành chiết tách DNA tổng số đối với tất cả 20 mẫu vi khuẩn Xoo, điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách, kết
quả các mẫu vi khuẩn đều cho hiện I vạch băng sáng, rõ nét trên bản gel
agarose Điều này chứng tỏ 20 mẫu vi khuẩn đều đã được chiết tách DNA
thành cơng (Hình 8)
Trang 31Chúng tơi nhận thấy tiến hành chiết tách DNA theo phương pháp của
N Furuya và cộng sự, 2003 cho kết quả thành cơng cao khi áp dụng với vi
khuẩn Xoo (thành cơng 20/20 mẫu vi khuẩn tiễn hành chiết tách)
- Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằngPCR:
Những mẫu DNA đã được kiểm tra là chiết tách thành cơng sẽ được sử dụng tham gia vào phản ứng PCR với cặp mỗi XOR-R2 và XOR-F để xác định chính xác vi khuẩn Xoo Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
2% và sử đụng DNA ladder Ikb để so sánh kích thước, chúng tơi đã thu
được 17/20 mẫu vi khuẩn (với mẫu DNA tương ứng) cho hiện vạch băng
sáng, rõ nét cĩ kích thước 470 bp trên bản gel, những mẫu cịn lại khơng cho
hiện vạch băng (Hình 9) Như vậy, đã xác định được chính xác 17/20 mẫu vi
khuẩn nghiên cứu là vi khuẩn Xoo Những mẫu này sẽ được tiếp tục sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo của đề tài, những mẫu khơng phải là vi
khuẩn Xoo sẽ được loại bỏ
Hình 8 Kiểm tra ADN tổng số Hình 9 Xác định Xoo bằng PCR với mồi XOR trên gel agarose 1% Giéng 1-7 Giéng 1: DNA ladder Giéng 2: RI
lần lượt là các mau 2, 4, 5, 8, Giếng 3: R2 Giéng 4: mau 1 12, R1, R2 Giéng 5: mau 36 Giéng 6: mau 4
Giéng 7: mau 5 Giéng 8: mau 12
Trang 32Trong hình 9, các mau R1, R2, 4, 5, 12 cho hiện vạch băng sáng, rõ
nét kích thước 470 bp trên bản gel điện di chứng tỏ các mẫu này chính xác là
vi khuẩn Xoo (kích thước được so sánh với DNA ladder ở giếng 1) Cac mau 1 và mẫu 36 khơng cho hiện vạch băng cĩ kích thước 470 bp nên chúng tơi
kết luận khơng phải là vi khuẩn Xoo Những mẫu này cĩ thể là một loại vi
khuẩn xanthomonas nào đĩ sống cộng sinh với vi khuẩn Xoo trong cùng vết bệnh hoặc thậm trí là các lồi khác trong cùng họ vi khuẩn Xanthomonas nhu X campestris pv citri, pv, incanae va pv zinniae
Bảng 6 Kết quả phân lập và xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ thuật PCR STT| Mẫu | Phân | Kiểm tra | STT| Mẫu | Phân | Kiểm tra lập | bằng PCR lập | bằng PCR 1 | RI + + 11|RI2| + + 2 | R2 + + 12 | 1 + - 3 | R3 + + 13 | 2 + + 4 | R5 + + 14 | 4 + + 5 | R6 + + 15 | 5 + + 6 | R7 + + 16 | 8 + + H R8 + + 17 12 + + 8 | R9 + + 18 | 15 + + 9 |RI0| + + 19 | 36 + - 10 |RII| + + 20 | 70 + - Chú thích:
(+) Phân lập thành cơng hoặc kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn Xoo
Trang 334.3 Kết quá xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo
bằng phương pháp rep PCR và IS-PCR
Chúng tơi đã tiến hành thực hiện phản ứng rep-PCR và IS-PCR đối với 17 mẫu vi khuân đã được kiểm tra chính xác là Xoo bằng kĩ thuật PCR
Khi nhuộm bản gel điện di và kiểm tra trong buồng chụp UV, chúng tơi đã
thu được số vạch băng nhân lên khá cao đối với 3 mỗi đơn ở cả 2 phương
pháp nghiên cứu được trình bầy ở các hình 10, 11 và 12
+ Rep-PCR nhân lên được 14 vạch băng cĩ kích thước khác nhau với mỗi ERIC2F và 12 vạch băng cĩ kích thước khác nhau với mồi BOXAIRF
+ IS-PCR nhan lên được 22 vạch băng cĩ kích thước khác nhau với mỗi J3F
Như vậy khi sử dụng 3 mơi với 2 phương pháp rep-PCR và IS-PCR
chúng tơi đã nhân lên được tổng cộng 48 vạch với kích thước khác nhau hiện
lên trên bản gel điện di tương ứng với 48 vùng gen khác nhau trên bộ genome của vi khuẩn Xoo Mặt khác những vùng gen này lại phân bĩ rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn Xøo do đĩ việc phân tích đa dạng các mẫu vi khuân đã phủ được một vùng DNA genom rộng lớn, đây cĩ thể là cơ sỏ phân tử đề xác định và phân nhĩm các mẫu vi khuân một các chính xác hơn
RI R2 R3 RŠ R6 R7 R§ R9 RI0RII RI2
Trang 34
RI R2 R3 RŠ Rĩ R7 R§ R9 RI0 RIIRI2 2 Cll i ed —=—— ¬——.— ——.— RI R2 R3 RŠ R6 R7 R8 R9 RI0 RiI RI2 2 li (( || | Hịa
Hình 12 Ảnh điện di sản phẩm IS-PCR với mơi J3F (22 vạch) Từ những kết quả điện di sản phẩm rep-PCR và IS-PCR, chúng tơi đã
tiến hành thống kê số vạch nhân lên của từng mẫu vi khuẩn đối với từng loại
mơi dưới dạng nhị thức Kết quả được biểu diễn ở các bảng 1, 2 và 3 trong
Trang 35Khi đã cĩ được những thống kê trên, chúng tơi đã sử dụng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc2.0 để xác định hệ số đồng dạng về mặt di truyền
giữa các mẫu vi khẩn nghiên cứu (bảng 4, phần phụ lục bảng) Đồng thời chúng tơi cũng đã xây dựng được cây phân loại biêu diễn mỗi quan hệ về
mặt di truyền giữa các mẫu vi khuẩn (Hình 13) F— rễ ——¬ 046 059 072 085 0.95 ›» Coefficient Hinh 13 Cây phân loại của mơi BOXAIRE, J3 và ERIC2F theo chương trình NTSYSpc2.0
Phần mềm NTSYSpc2.0 được xây dựng dựa trên cơng thức tính hệ số
tương quan về mặt di truyền của M.Nei và Li, 1979 Phần mềm này cho
phép chúng tơi xác định được hệ số tương đồng di truyền cĩ ý nghĩa là r = 0,95 và trong đề tài này chúng tơi đã chọn hệ số tương đồng di truyền 0,95 để phân loại các mẫu vi khuẩn Xoo vào các nhĩm chủng khác nhau
Trang 36Từ cây phân loại với thước đo hệ số đồng đạng phía đưới, chúng tơi
nhận thấy các mẫu R2 với R3; mẫu 5 và 15; mẫu Rĩ với các mẫu R7, R8 cĩ
hệ số đồng dạng về mặt di truyền cao ( > 0,95) nên chúng tơi đã xếp các mẫu
vi khuẩn này thuộc vào cùng một nhĩm chủng Những mẫu cịn lại cĩ hệ số
tương đồng đi truyền < 0,95 sẽ được phân vào những nhĩm chủng riêng biệt Như vậy, bằng phương pháp rep-PCR và IS-PCR, từ 17 mẫu vi khuân nghiên cứu chúng tơi đã phân lập được I3 chủng khác nhau tại hệ sỐ tương
đồng cĩ ý nghĩa về mặt di truyền là r = 0,95 Các nhĩm đĩ là:
- Nhĩm 1: mẫu RI - Nhĩm 6: mẫu R6, R7,R8 - Nhớm 1I:mẫu 2 - Nhĩm 2: mẫu R2, R3 - Nhĩm 7: mẫu 8 - Nhĩm 12: mẫu 4 - Nhĩm 3: mẫu R11 - Nhĩm 8: mẫu R9 - Nhĩm 13: mẫu 12 - Nhĩm 4: mẫu R5, 15 - Nhĩm 9: mẫu R12
- Nhĩm 5: mẫu 10 - Nhĩm 10: mẫu 5
4.4 Kết quả xác định đa dạng các mẫu vi khuẩn Xøø bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dịng đẳng don gen
Quá trình bảo quản và cấy chuyên các mẫu vi khuẩn cĩ thể làm cho hoạt tính của các mẫu vi khuẩn bị giảm hoặc mất đi Điều này sẽ ảnh hưởng
đến kết quả của phương pháp Đề kiểm nghiệm, chúng tơi đã tiến hành lây
nhiễm các mẫu vi khuẩn trên cả giống đối chứng mẫn cảm IR24 và các địng
đăng đơn gen Những mẫu Xoo cho kết quả nhiễm với IR24 thì được xác
định là độc tính vẫn ơn định Kết quả lây nhiễm được biểu diễn ở bang 5, phần phụ lục bảng Với đ (cm) là chiều đài trung bình của vết bệnh thì:
d<8= kháng, kí hiệu R
§ < đ< 12 = kháng TB hoặc nhiễm TB, kí hiệu M
Trang 38Từ kết quả đánh giá ở phổ kháng nhiễm (bảng 7), chúng tơi nhận thấy:
- Ba dịng đẳng đơn gen BB5, BB7, BB2I tương ứng chứa các gen kháng bạc lá xa5, Xa7, Xa21 cho kết quả kháng cao đối với các chung vi khuẩn Xoo:
+ BB5 kháng được 17/17 chủng vi khuân nghiên cứu > khang 100 % + BB7 kháng được 16/17 chủng vi khuân nghiên cứu > kháng 94 % + BB2I kháng được 16/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu > kháng 94 %
- Dịng đẳng đơn gen BB14 tương ứng chứa gen kháng Xal4 cho kết quả
kháng kém với các mẫu vi khuẩn Xoo BB14 kháng được 8/17 mẫu vi khuẩn
(trong đĩ kháng trung bình với 2 mẫu vi khuẩn) đạt tỉ lệ kháng là 47 % - Các mẫu vi khuẩn nhiễm được nhiều dịng đẳng gen nhất là R9 và mẫu
R11
+ Mẫu R9 nhiễm được 7/9 dịng đăng đơn gen, tỉ lệ nhiễm là 78 % Nguồn
gốc thu thập: trên giống IR 64 tại Thuận Châu, Sơn La
+ Mẫu R11 nhiễm được 6/9 dong dang don gen, tỉ lệ nhiễm 67% Nguồn gốc
thu thập: trên giống Nhị ưu - 838 tại Quỳnh Lưu, Nghệ An
NTSYSpc2.0 là phần mềm chuyên dụng trong việc phân tích đa dạng di truyền, thường được sử dụng trong những phương pháp đánh giá trên bộ
genome nhu RFLP, RAPD., Trong dé tai này, vì mục đích cĩ được sự so
sánh giữa 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng: phương pháp lây nhiễm nhân tạo và phương pháp nghiên cứu với rep-PCR, IS-PCR chúng tơi đã sử dụng phần mềm này để phân tích đối với cả kết quả của phương pháp lây nhiễm
nhân tạo Để thuận tiện cho việc đánh giá đa dạng trên phần mềm NTSYSpc2.0, từ phổ kháng nhiễm chúng tơi đã tiến hành cho điểm như sau:
Trang 39Xử lí kết quả đánh giá này trên phần mềm NTSYSpc2.0, chúng tơi đã
xác định được hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn nghiên cứu (bảng 7,
phần phụ lục bảng) và cũng xây dựng được cây phân loại biểu diễn mỗi quan
hệ về mặt kiều hình giữa các mẫu vi khuẩn (Hình 14) BĨC os 0,95 7 im
Hình 14 Cây phân loại theo phổ kháng nhiễm, phân tích bằng NTSYSpc2.0 Dé tiến hành so sánh với kết quả phân loại của phương pháp phân tích
đa dạng sử dụng rep-PCR và IS-PCR, chúng tơi đã chọn cùng hệ sé tuong đồng là 0,95 để cĩ được sự đồng nhất trong tiến hành 2 phương pháp
Như vậy, bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dịng đẳng
gen, chúng tơi đã phân lập 17 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu thành 8 nhĩm
Trang 404.5 Kết quả so sánh 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng các mẫu Xoo
Khi so sánh ở cùng mức độ tương đồng là 0,95 chúng tơi nhận thấy:
phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng rep-PCR và IS-PCR
phân lập được nhiều chủng nhĩm hơn (13 nhĩm chủng so với 8 nhĩm chủng theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo) Điều này chứng tỏ mức độ phân lập của phương pháp này sâu hơn và chính xác hơn so với phương pháp lây
nhiễm nhân tạo truyền thống Lây nhiễm nhân tạo Hình I5 So sánh cây phán loại của 2 phương pháp nghiên cứu ở cùng hệ số tương đồng là (0,95
Bên cạnh đĩ chúng tơi cũng thấy cĩ nhiều sự khác biệt về kết quả các