Trong nghiên cứu này tác giả tiến hành giải trình tự hệ gen và phân lập đầy đủ TAL effector của 1 chủng Xoo và tiến hành nghiên cứu độc tính riêng rẽ của từng TAL effector. Nghiên cứu gợi mở khả năng khám phá chức năng. toàn bộ hệ TAL effector (TALome) của vi khuẩn Xanthomonas, xác định các TAL effector có độc tính làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống kháng bạc lá trong các bước tiếp theo
Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG TALOME CỦA VI KHUẨN Xanthomonas oryzae pv oryzae GÂY BỆNH BẠC LÁ Trần Tuấn Tú1 Phạm Xuân Hội1 Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam TĨM TẮT TAL effector protein tiết loại đặc trưng cho chi Xanthomonas gây bệnh rộng rãi nhiều loại trồng khác chúng có vai trị định tương tác đặc hiệu vi khuẩn chủ Các nghiên cứu gần cho thấy vài TAL effector riêng lẻ có khả định độc tính vi khuẩn Xanthomonas thơng qua việc hoạt hóa gen nhiễm Trong nghiên cứu tiến hành giải trình tự hệ gen phân lập đầy đủ TAL effector chủng Xoo tiến hành nghiên cứu độc tính riêng rẽ TAL effector Kết nghiên cứu cho thấy có TAL effector có độc tính tiến hành lây nhiễm giống lúa Azucena Hai số TAL effector có độc tính có gen đích OsSWEET14 gen nhiễm điển hình vi khuẩn bạc lúa Gen thứ có hai gen đích gen biết OsTFX1 gen tạm gọi UPTAL2 (thuộc nhóm mã hóa nhân tố phiên mã ERF) Nghiên cứu gợi mở khả khám phá chức toàn hệ TAL effector (TALome) vi khuẩn Xanthomonas, xác định TAL effector có độc tính làm sở cho cơng tác chọn tạo giống kháng bạc bước Từ khóa: bệnh bạc lá, chọn tạo giống kháng, TAL effector, TALome, tương tác vi sinh vật-cây trồng, gen kháng, gen nhiễm I MỞ ĐẦU TAL (transcription activator-like) effector tiêm vào tế bào chủ dựa hệ thống tiết loại III loài vi khuẩn Xanthomonas Các TAL effector xâm nhập vào nhân tế bào chủ có khả bám đặc hiệu vào trình tự promoter chủ hoạt hóa biểu gen đích giúp thúc đẩy q trình lây nhiễm vi khuẩn (giúp tăng sinh giúp vi khuẩn di chuyển xa chủ cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn ) Các TAL effector có vai trị quan trọng tương tác Xanthomonas chủ tùy thuộc vào chức gen đích chủ, gen đích gen nhiễm (susceptibility S gene, cần thiết cho trình lây nhiễm) vi khuẩn có khả gây bệnh, ngược lại gen đích gen kháng (resistance R gene) chủ có khả kháng bệnh Trong thực tế đột biến vùng promoter gen nhiễm khiến TAL effector khơng có khả bám tăng cường biểu gen nhiễm, kết kháng bệnh ví dụ gen kháng xa13 xa25 (Chu et al., 2006; Yang et al., 2006) Khả bám đặc hiệu TAL effector định dựa trật tự vùng trung tâm protein với trình tự amino acid giống lặp lại liên tục ngoại trừ hai vị trí thứ 12 13 hai vị trí siêu biến đổi (Repeat Variable Diresidue, RVD) Kể từ năm 2009, tương tác đặc hiệu RVD acid nucleic, cụ thể NI = A, HD = C, NG = T, NN = R (G A), NS = N (A, C, G, hay T) cơng bố hai nhóm nghiên cứu độc lập (Boch et al., 2009; Moscou Bogdanove, 2009) Phát có ý nghĩa to lớn kể từ dựa trình tự chuỗi RVD nhà khoa học dự đốn gen đích vi khuẩn Xanthomonas, kết hợp với liệu transcriptome RNAseq phản ứng chủ vi khuẩn nhà khoa học dự đốn/phân lập gen kháng/nhiễm Ngồi với cơng nghệ chỉnh sửa hệ gen (genome editting) dựa hiểu biết mối tương tác TAL effector gen nhiễm nhà khoa học tạo gen kháng từ làm sở chọn tạo giống kháng nhiễm vi khuẩn Xanthmonas, ví dụ nhóm tác giả Mỹ tác động lên promoter gen nhiễm nghiên cứu kỹ (OsSWEET14) để tạo giống lúa kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae (Li et al., 2012) Trong nghiên cứu chúng tơi trình bày phương pháp thu nhận trình tự TALome vi khuẩn bạc từ trình tự hệ gen phân 307 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM lập TAL effector riêng lẻ phân tích chức TAL effector riêng lẻ vi khuẩn bạc Kết gợi mở khả kiểm tra toàn hệ TALome vi khuẩn bạc đại diện Việt Nam từ tạo sở cho việc biên tập hệ gen phục vụ công tác tạo giống kháng bạc phổ rộng bền vững Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Vật liệu Nghiên cứu sử dụng nguồn vi khuẩn gây bệnh bạc cung cấp phịng thí nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu phát triển IRD, cộng hòa Pháp Giống lúa chuẩn nhiễm sử dụng giống lúa japonica: Azucena Các hóa chất thiết bị nghiên cứu sinh học phân tử cung cấp từ hãng Invitrogen, Sigma, Qiagen Giải trình tự hệ gen vi khuẩn cung cấp dịch vụ phịng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Icahn, New York-Mỹ theo hệ thống Pacbio sequencer Giải trình tự vector cung cấp dịch vụ công ty Beckman Coulter Genomics theo phương pháp Sanger 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Giải trình tự hệ gen vi khuẩn bạc Vi khuẩn bạc nuôi cấy môi trường PSA đặc có bổ sung kháng sinh gentamycin (20mg/l) để thu khuẩn lạc đơn trước nuôi cấy để thu sinh khối lớn DNA vi khuẩn thu nhận kit tách chiết DNA tổng số Blood & Cell Culture DNA Midi Kit hãng Qiagen (Cat No 13343) DNA tổng số kiểm tra điện di xung đẩy chiều trước chuẩn bị thư viện cho giải trình tự hệ gen hệ thống giải trình tự Pacbio Việc lắp ghép liệu giải trình tự cung cấp Viện Nghiên cứu Icahn Hệ genome vi khuẩn thích so sánh công cụ mở website: http://rast.nmpdr.org/ https://benchling.com/ 308 2.2.2 Trích xuất TALome vi khuẩn bạc Kết giải trình tự hệ gen vi khuẩn bạc sử dụng để trích xuất trình tự RVD trình tự nucleotide thực phần mềm AnnoTALE kiểm tra phương pháp Southern Blot để xác định số lượng kích thước xác thành viên 2.2.3 Phân lập TAL effector vi khuẩn bạc Các TAL effector vi khuẩn bạc sàng lọc phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu từ thư viện pSKX1/TAL-BamHI làm giàu nhờ thao tác cắt đồng thời hệ gen vi khuẩn với enzyme cắt giới hạn BamHI, SfoI ApalI Các khuẩn lạc dương tính tách plasmid, kiểm tra lại với phản ứng cắt giới hạn enzyme BamHI trước giải trình tự vùng N C vùng trung tâm với phương pháp giải trình tự Sanger 2.2.4 Tải nạp TAL effector vào vi khuẩn Xanthomonas oryzae X11-5A DNA plasmid chứa phân đoạn mã hóa TAL effector sau kiểm tra trình tự biến nạp vào vi khuẩn E coli chủng S17.1 tiếp tải nạp vào vi khuẩn Xanthomonas oryzae X11-5A phương pháp bi-parent conjugation (Verdier et al., 2012) 2.2.5 Đánh giá độc tính TAL effector Độc tính TAL effector riêng lẻ đánh giá phương pháp cắt đầu lúa Azucena giai đoạn sinh dưỡng (30 ngày sau gieo hạt) với dung dịch vi khuẩn Xo X11-5A tải nạp (OD600 = 0.2) Vết bệnh đo thời điểm 15 ngày sau lây nhiễm, thí nghiệm tiến hành lặp lại lần, lần (2 cây) Kết xử lý thống kê xây dựng đồ thị phần mềm Graphpad Pism 2.2.6 Dự đốn gen đích TAL effector Trình tự bám danh sách gen đích TAL effector tính tốn dựa phần mềm TALvez 3.1 TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai Bảng Danh sách trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Tên mồi pthXo1-nt-Fw1 pthXo1-nt-rev1 pSKX1-For pSKX1-REV talc-repeat-rev talc-repeat-FW TFX1-For TFX1-REV ERF-Rev ERF-For Trình tự GCAGCTTCAGCGATCTGCTC TGGACCTCTCAACTCTCCCGCCA GGCACGACAGGTTTCCCGAC GGGCACCAATAACTGCCTTA GCCGGATCAGGGCGAGATAACT CACTGACGGGTGCCCCCCTGAA ACTGCCTCTCACCTCCAAGC GGTAGGCGTCATCTGTGCTG CTTGTTGGTGGTGTGGTCTC GCGCGGCGCCAACGCCGTCC Chú thích Southern blot sàng lọc thư viện Giải trình tự plasmid tái tổ hợp(1) Giải trình tự plasmid tái tổ hợp(2) SqRT-PCR : giải trình tự vùng N C TAL effector; 2: giải trình tự vùng trung tâm TAL effector III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Giải trình tự hệ gen TALome vi khuẩn bạc Trình tự hệ gen chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo 1, Xoo Xoo 3) tiến hành giải trình tự phương pháp Pacbio sequencing Phương pháp sử dụng cơng nghệ đọc trình tự thời gian thực phân tử DNA (single molecule, real-time: SMRT sequencing) cho phép đọc trình tự phân đoạn DNA có kích thước lên đến 20 kb Phương pháp cho phép thu nhận trình tự hệ gen chất lượng tốt, độ xác cao đặc biệt vùng có độ lặp lại lớn (do có khả đọc dài) đặc biệt thích hợp cho hệ gen nhỏ vi khuẩn Sử dụng phương pháp nhóm tác giả A Bogdanove thu nhận 10 hệ gen vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzicola (Wilkins et al.,, 2015) thích lại số sai sót giải trình tự hệ gen trước vi khuẩn Xoo PXO99A (Sebra et al., 2015) Sơ phân tích kết chúng tơi nhận thấy chất lượng giải trình tự tốt, hệ gen lắp ghép contig cho vi khuẩn với kích thước xấp xỉ 4,7 Mb thành phần GC xấp xỉ 63,9%, số lượng RNAs (ARN nhỏ) 59 số lượng gen mã hóa cho chủng 4442, 4517 4530 Hình Cây quan hệ phát sinh chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae xây dựng dựa so sánh trật tự nucleotide 31 gen giữ nhà phần mềm Mega 6.0 309 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai Nhằm so sánh hệ gen chủng vi khuẩn nghiên cứu với trình tự hệ gen vi khuẩn Xanthomonas oryzae cơng bố trước đây, trình tự 31 gene giữ nhà (house keeping gene) chủng thu nhận phần mềm AMPHORA sau ghép nối lại thành trình tự gọi trình tự gen giữ nhà tiến hành so sánh trình tự, xây dựng quan hệ phát sinh phần mềm Mega 6.0 Kết cho thấy trình tự hệ gen nằm riêng biệt khỏi nhóm vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzicola nằm gần nhóm vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae khác châu Á (hình 1) Kết cho thấy có phân biệt rõ nhóm vi khuẩn Xoo Xoc gen giữ nhà chúng 3.2 Phân lập TAL effector vi khuẩn bạc Bằng cách sử dụng phần mềm AnnoTALE, thu nhận trình tự RVD trình tự nucleotide TALome chủng vi khuẩn Theo với chủng vi khuẩn có Tal effector TALome với kích thước tối đa 25,5 repeat cho hệ TALome Đây khác biệt so với hệ TALome cơng bố trước số lượng tương đối (thơng thường từ 16-19 TAL effector cho vi khuẩn Xoo 26-30 cho vi khuẩn Xoc) Để khẳng định kết này, thí nghiệm Southern Blot tiến hành cho chủng Xoo Xoo Hình ảnh thu phản ứng lai với mồi đặc hiệu thiết kế vùng C TAL effector cho phép khẳng định số lượng kích thước TAL effector chủng trùng khớp với kết phân tích phần mềm AnnoTALE Tiến hành so sánh sơ tổng thể vùng N C TAL effector TALome chủng vi khuẩn nghiên cứu với TALome chủng Xanthomonas oryzae công bố phần mềm Mega 6.0 nhận thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu tạo thành nhóm riêng so với vi khuẩn Xanthomonas oryzae khác nhóm gần gũi chủng vi khuẩn Xoc gồm chủng châu Phi chủng Đông Nam Á (hình 2) Đây điều khơng quan sát thấy so sánh hệ genome chủng nghiên cứu với chủng Xanthomonas oryzae công bố (hình 1) Hình Kết so sánh trật tự nucleic vùng N C chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae phần mềm Mega 6.0 Để tiến hành đánh giá độc tính riêng rẽ TAL effector tiến hành xây dựng thư viện TAL effector làm giàu kỹ thuật cắt đồng thời gDNA tổng số chủng với enzyme cắt giới hạn nhân dòng trực tiếp vector biểu vị trí BamHI Phương pháp giúp rút ngắn thời gian không cần sàng lọc thư viện plasmid tái tổ hợp với số lượng lớn phân đoạn TAL effector làm giàu theo tính tốn lý thuyết 60-70% Kết thực nghiệm cho thấy 25-30% khuẩn lạc sàng lọc mang phân đoạn TAL effector (dương tính với 310 phản ứng PCR mồi đặc hiệu thiết kế đầu N) Đây kết tốt so sánh với số phương pháp khác PCR (bị hạn chế cấu trúc lặp vùng trung tâm TAL effector) hay phương pháp tạo thư viện thông thường (dưới 0,1%) 3.3 Phân tích chức TAL effector TALome chủng Xoo phân lập hoàn toàn vector biểu tiến hành tải nạp vào chủng vi khuẩn Xo X11-5A Đây chủng Xanthomonas oryzae đặc biệt hệ gen không mang 310 Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai TAL effector có độc lực yếu thí nghiệm cắt đầu giống chuẩn nhiễm sử dụng Azucena Chủng X115A khơng có TAL effector tự thân nên tải nạp TAL effector từ vi khuẩn Xanthomonas oryzae khác thể độc tính TAL effector tải nạp (Verdier et al., 2012) Kết thí nghiệm lây nhiễm phương pháp cắt đầu giống Azucena cho thấy có TAL effector chủng Xoo có khả tăng cường độc tính cho vi khuẩn X11-5A tải nạp so với vi khuẩn gốc (hình 3) Tiến hành phân tích trật tự bám dự đốn gen đích cho TAL effector với phần mềm Talvez 3.1 Tal targetter 2.0 cho thấy TAL effector có gen đích OsSWEET14 nhiên với hai trình tự EBE độc lập Đây kết thú vị gene OsSWEET14 biết gen nhiễm nghiên cứu tốt cho vi khuẩn bạc gen đích nhiều chủng vi khuẩn bạc gây bệnh lúa Tuy nhiên lần thấy chủng vi khuẩn có khả tác động đến vị trí khác vùng promoter gen nhiễm lúa Riêng với trường hợp TAL effector cịn lại (số 2) danh sách gen đích khơng có gen thơng báo trước có vai trị q trình lây nhiễm vi khuẩn Tuy nhiên kiểm tra danh sách đối chiếu với liệu biểu gen tổng số kiểm tra lại phương pháp sqRT-PCR phát gen đích tiềm OsTFX1 gen đích TAL effector pthXo6 cơng bố trước Ngồi cịn gen có tiềm thuộc nhóm gen mã hóa cho nhân tố phiên mã ERF, kết nghiên cứu trình bày cơng bố khác Hình Kết lây nhiễm nhân tạo phương pháp cắt đầu chủng vi khuẩn X11-5A tải nạp 15 ngày sau lây nhiễm (Graphpad Prism 6.0) IV KẾT LUẬN Kết nghiên cứu khẳng định khả tiếp cận phương pháp giải trình tự hệ gen Pacbio Trong nghiên cứu đề xuất phương pháp nhằm phân lập TAL effector riêng rẽ, cho phép nhanh chóng nghiên cứu độc tính TAL effector Đây bước tiếp cận giúp chúng tơi nhanh chóng nghiên cứu xác định vai trò TAL effector riêng lẻ tương tác vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae với chủ Kết nghiên cứu gợi ý cho chúng tơi khả thu nhận tranh toàn cảnh TALome cho quần thể vi khuẩn bạc Việt Nam nhằm tạo sở cho việc nghiên cứu tương tác vi khuẩn bạc lúa nước ta, ngồi cịn phục vụ trực tiếp cho cơng tác tạo giống kháng bạc TÀI LIỆU THAM KHẢO Boch, J., Scholze, H., Schornack, S., Landgraf, A., Hahn, S., Kay, S., Lahaye, T., Nickstadt, A., and Bonas, U., 2009 311 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors Science, 326:1509-1512 Chu, Z., Yuan, M., Yao, J., Ge, X., Yuan, B., Xu, C., Li, X., Fu, B., Li, Z., Bennetzen, J L., Zhang, Q., and Wang, S., 2006 Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice Genes Dev., 20:12501205 Li, T., Liu, B., Spalding, M H., Weeks, D P., and Yang, B., 2012 High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice Nat Biotechnol., 30:390-392 Moscou, M J., and Bogdanove, A J., 2009 A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors Science., 326:1501 Sebra, R P., Salzberg, S L., Carpenter, S C D D., Wang, L., Booher, N J., Bogdanove, A J., and Leach, J E., 2015 Single molecule real-time sequencing of Xanthomonas oryzae genomes reveals a dynamic structure and complex TAL (transcription activator-like) effector gene relationships Microb Genomics., (4): Doi: 10.1099/mgen.0.000032 Verdier, V., Triplett, L R., Hummel, A W., Corral, R., Cernadas, R A., Schmidt, C L., Bogdanove, A J., and Leach, J E., 2012 Transcription activator-like (TAL) effectors targeting OsSWEET genes enhance virulence on diverse rice (Oryza sativa) varieties when expressed individually in a TAL effector-deficient strain of Xanthomonas oryzae New Phytol., 196:1197-1207 Wilkins, K E., Booher, N J., Wang, L., and Bogdanove, A J., 2015 TAL effectors and activation of predicted host targets distinguish Asian from African strains of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv oryzicola while strict conservation suggests universal importance of five TAL effectors Front Plant Sci., 6:536 Yang, B., Sugio, A., and White, F F., 2006 Os8N3 is a host disease-susceptibility gene for bacterial blight of rice Proc Natl Acad Sci U S A., 103:10503-10508 ABSTRACT Talome functioning by Xanthomonas oryzae pv oryzae causing rice bacterial leaf blight TAL effector is an excretion protein 3, which becomes specific to Xanthomonas genus The bacteria caused serious diseases to various crop species with specific host-pathogen relationship Recent studies showed that some individual TAL effectors could identify the virulence by Xanthomonas through inducing susceptible genes In the study, genome sequencing and TAL effectors’ identification were carried out with particular virulence in each effector At least three TAL effectors induced the virulence in case of Azucena genotype inoculated by Xoo Of three effectors, two exhibited their virulence, which controlled by OsSWEET14 gene The third one related two target genes as OsTFX1 and one new gene UPTAL2 (belonging to transcription factor of ERF) The study will help us detect the function of whole TAL effector (TALome) of Xanthomonas, identify TAL effectors with highly toxic virulence, and help rice breeders improve bacterial blight resistant rice varieties Keywords: bacterial blight, host-pathogen relationship, resistance genes, susceptible genes, TAL effector, TALome Người phản biện: TS Khuất Hữu Trung 312 ... effector TALome chủng vi khuẩn nghiên cứu với TALome chủng Xanthomonas oryzae công bố phần mềm Mega 6.0 nhận thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu tạo thành nhóm riêng so với vi khuẩn Xanthomonas oryzae. .. tương tác vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae với chủ Kết nghiên cứu gợi ý cho chúng tơi khả thu nhận tranh toàn cảnh TALome cho quần thể vi khuẩn bạc Vi? ??t Nam nhằm tạo sở cho vi? ??c nghiên cứu tương... Đây kết thú vị gene OsSWEET14 biết gen nhiễm nghiên cứu tốt cho vi khuẩn bạc gen đích nhiều chủng vi khuẩn bạc gây bệnh lúa Tuy nhiên lần thấy chủng vi khuẩn có khả tác động đến vị trí khác vùng