Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16s rRNA trên DNA ty thể

Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16s rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ Pangasiidae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT

THUỘC HỌ Pangasiidae

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN KIỀU DỢI

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000********

ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT

THUỘC HỌ Pangasiidae

ThS NGUYỄN VIẾT DŨNG KS NGUYỄN NGUYỄN DU

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn Chương Trình Thuỷ Sản Ủy Hội Sông MêKông đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi đặc biệt cảm ơn anh Nguyễn Nguyễn Du, anh Nguyễn Viết Dũng đã tận tâm, nhiệt tình hướng dẫn trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn anh Lâm Ngọc Châu, anh Nguyễn Văn Phụng phòng Nguồn Lợi Thủy Sản cùng chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hòan thành tốt đề tài

Sau cùng tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học k29 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN KIỀU DỢI

ABSTRACT

Morphological study plays important role in post-larvae fish taxonomy of the

family Pangasiidae that contributes significantly to economy of the MeKong River

Basin However, this method bring limit true results therefore we analysised the level of genetic diversity (A partial region of mitochondrial 16S rRNA gene, approximately 568 base pairs) of three catfish species to support morphological method.

In this study, 976 specimens, originating from Mekong and Bassac River (from june 2006 to september 2006) were analysed morphologically The result, the

family Pangasiidae rate of 36,56% per in total specimens in 2006; three species (P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema) rate of 33,63% per in total Pangasiidae specimens and individual rate of 11,36% per in total number Pangasiidae

All Pangasiidae specimens of 2006 don’t analysised DNA because DNA

was broke by formol 26 individuals (size from 15 mm to 30 mm) from 64

specimens (6/2007) were add from three species: P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema All specimens were sequenced and compared with standard sequence in genbank This result, Sequences of 8/9 samples P hypophthalmus similary with P hypophthalmus (DQ334282, DQ334385, DQ334287) The exception of H1

sample, with one mutation at site nucleotide 26 to GenBank (DQ334282 –

DQ334289); Sequences of 9 samples P macronema similary from 99% to 100% sequences of P macronema to GenBank (DQ334314); Sequences of 8 samples P larnaudii similary 100% sequences of three haplotypes P larnaudii (DQ334303,

DQ334312, DQ334313) All in all, findings from this study demonstrated that

morphological method correspond with three species P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema

TÓM TẮT

Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá

bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng

Sông Cửu Long Tuy nhiên, phương pháp này cho độ chính xác nhất định Vì vậy chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ 568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để hỗ trợ phương pháp định danh hình thái

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu Kết quả

họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu được năm 2006; 3 loài phân tích (P

hypophthalmus, P larnaudii, P macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu Pangasiidae thu được nhưng số lượng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lượng cá thể họ Pangasidae

Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích được DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến tháng 30/6/2007 được bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thước khác nhau (từ 15 mm – 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để kiểm tra lại độ tin cậy của phương pháp phân tích hình thái Kết quả đạt được như sau:

 Trình tự 8/9 mẫu loài P hypophthalmus tương đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287)

Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene

 Trình tự 9 mẫu phân tích loài P macronema giống từ 99% - 100% trình tự

P macronema trên ngân hàng gene (DQ334314)

 Trình tự 8 mẫu loài P larnaudii tương đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P

larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313)

Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định được khoá phân loại hình thái đối với các loài mà chúng tôi đưa ra là phù hợp

2.1 Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá 3

2.1.1 Nghiên cứu thế giới 3

2.1.2 Nghiên cứu trong nước 4

2.2 Phương pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae 5

2.3 Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá 8

2.3.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 8

2.3.2 Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 8

2.3.3 Phương pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 8

2.3.4 Phân tích DNA ty thể (mtDNA) 9

2.3.5 Phương pháp PCR 11

2.3.6 Phương pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động 12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 13

3.3.1 Phương pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột 15

3.3.2 Phương pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform 16

3.3.3 Phương pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA 16

3.3.4 Phương pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose 17

3.4.2 Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA 21

3.4.3 Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae 23

4.1.1 Kết quả hình thái phân loại 23

4.1.2 Kết quả giai đoạn định tính 25

4.1.2.1 Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu được

năm 2006 25

4.1.2.2 Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae 27

4.1.3 Kết quả giai đoạn định lượng 29

4.1.3.1 Tỉ lệ số lượng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29

4.1.2.4 Tỉ lệ số lượng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lượng cá thể họ Pangasiidae 31

4.2 Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA 33

4.3 Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 34

4.3.1 Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA 34

4.3.2 Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 38

4.3.2.1 Định danh 9 mẫu thuộc loài P macronema 38

4.3.2.2 Định danh 9 mẫu thuộc loài P hypophthalmus 40

4.3.2.3 Định danh 8 mẫu thuộc loài P larnaudii 42

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp Cặp bazơ

DNA Deoxyribonucleic acid

rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid

S Svedberg – đơn vị đo lường vận tốc lắng PCR Polymerase chain reaction

RFLP Restriction Fragment Length Lolymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Taq Thermus aquaticus

UI Unit

UV Ultra violet

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm 6

Hình 2.2 Pangasius larnaudii Bocourt, 1866 16 mm 6

Hình 2.3 Pangasius macronema Bleeker, 1851 15 mm 7

Hình 2.4: H.2.5a Cấu tạo tổng quát của ty thể 9

Hình 2.5 Các picks màu quan sát trên máy Scan 12

Hình 4.1 Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm 33

Hình 4.2 Pangasius larnaudii Bocourt, 1866 20 mm 34

Hình 4.3 Pangasius macronema Bleeker, 1851 15 mm 34

Hình 4.4 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005 35

Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại diện 38

Hình 4.6:Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P macronema 39

Hình 4.7: Sự tương đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P hypophthalmus 41

Hình 4.8: Sự tương đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P larnaudii 43

Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 25

Biểu đồ 4.2 Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae 25

Biểu đồ 4.3 Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc 27

Biểu đồ 4.4 Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu Pangasiidae 27

Biểu đồ 4.5 Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29

Biểu đồ 4.6 Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae 29

Biểu đồ 4.7 Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae 31

Biểu đồ 4.8 Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae 31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đồng Bằng Sông Cửu Long nước ta thuộc khu vực hạ lưu sông Mekong, vốn có nguồn tài nguyên thủy sản phong phú Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng và sự thay đổi thành phần các loài cá sẽ giúp ích cho việc quản lý và phát triển chiến lược cho nghề nuôi trồng thủy sản tại khu vực này

Phương pháp định danh trong phân loại học đóng vai trò quan trọng vào việc xác định sự đa dạng các loài cá trong tự nhiên Theo truyền thống, phương pháp định danh dựa trên các đặc điểm hình thái là phương pháp đã được phát triển lâu đời và có độ tin cậy Tuy nhiên, trong một số trường hợp có thể khó phân biệt được sự khác nhau giữa những loài có quan hệ gần, do có sự giới hạn về một số đặc trưng về hình thái học, đặc biệt khi mẫu vật là cá bột, hơn nữa công tác bảo quản mẫu cá cũng có thể làm thay đổi màu sắc tự nhiên của cá dẫn đến khó khăn khi phân loại một số lượng lớn mẫu trong thời gian dài

Gần đây, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học phân tử, nhiều chỉ thị sinh học phân tử đã được nghiên cứu và ứng dụng như là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác định danh các loài cá Định danh các loài cá dựa vào vật liệu di truyền cho độ chính xác cao Tuy nhiên, trong trường hợp định danh trên cơ sở phân tích DNA bộ gen thường gặp một số khó khăn do bộ gen có kích thước lớn, một gen có thể có nhiều bản sao trên nhiều locus, mỗi locus có nhiều allen khác nhau Mặt khác, cá chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường, nên có thể mang nhiều biến dị di truyền trên DNA bộ gen làm cho việc phân tích kết quả lại gặp càng nhiều khó khăn Các chỉ thị phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thường là những trình tự có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến dị khác biệt giữa các loài, vì thế các gen mã hóa ribosomal RNA (rRNA) là một ứng viên tốt dùng định danh các loài sinh vật Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu công bố về phân loại

cá dựa vào bộ gen Trong nghiên cứu này chúng tôi bước đầu “Ứng dụng khóa

phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột

thuộc họ Pangasiidae” Nhằm hỗ trợ định danh một số loài cá có giá trị kinh tế quan

trọng thuộc họ Pangasiidae trong khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long

1.2 Mục tiêu đề tài

Ứng dụng một số chỉ tiêu trong hệ thống phân loại hình thái vào phân loại cá bột

thuộc họ Pangasidae để xác định số lượng và tỷ lệ các loài Pangasianodon hypophthalmus, P larnaudii, P macronema trong các mẫu thu được từ tháng

6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra đánh giá độ tin cậy củakhóa phân loại hình thái nêu trên

1.3 Nội dung đề tài

Định danh các mẫu cá thu được trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long trong năm 2006 và 64 mẫu cá bột bổ sung thu từ 22/6/2007 đến 30/6/2007

Giải trình tự 26 cá thể (vùng 16S rRNA mã hóa bởi mtDNA) các loài: P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema thu vào tháng 6/2007

So sánh trình tự gen trên mtDNA mã hóa vùng 16S rRNA của một số mẫu phân tích với trình tự có sẵn trên ngân hàng genbank (dữ liệu di truyền) để kiểm tra và đánh giá phương pháp định danh hình thái truyền thống sử dụng trên cá bột

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá

2.1.1 Nghiên cứu thế giới

Các loài cá thuộc họ Pangasiidae (cá da trơn) được nhiều nhà khoa học trên

thế giới quan tâm từ rất lâu do đặc tính cho thịt ngon, dồi dào trong tự nhiên và đặc biệt có giá trị kinh tế cao

Hàng loạt các công trình nghiên cứu phân loại cá Pangasiidae ra đời trên

nguyên tắc chung là dựa vào các đặc điểm hình thái bên ngoài Theo tác giả Roberts

và Vidthayanon (1991), họ cá tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm hai giống: giống Helicophagus Bleeker, 1858, giống này có hai loài; giống Pangasius

Valenciennes, 1840 có 19 loài Sau đó, tác giả Walter J Rainboth (1996), đã bổ

sung thêm ba giống mới là Laides Jordan, 1919; Pangasianodon Chevey, 1930 và Pteropagasius Flowe, 1937 Tuy nhiên, việc định danh các loài cá thuộc họ Pangasiidae đều dựa vào một số các đặc trưng chung: số tiết cơ, số lượng vi, số

lượng và hình dạng răng, vị trí sắc tố xuất hiện và hình dạng cơ thể Ngoài ra, tác giả Gehrke (1991), cũng công bố dữ liệu về ảnh hưởng thức ăn tự nhiên lên sự phát triển của cá bột Đặc biệt là xây dựng bộ hình mô tả điểm đặc trưng gần 500 loài cá trên sông MeKong Riêng Apichart Termvidchakorn từ năm 1983 đã tiến hành

nghiên cứu về sự phân bố và phát triển của cá Caragid ở sông Kuroshio và các vùng

lân cận Cho đến năm 2003 ông mới xuất bản bộ hình cá bột và cá con thuộc lưu vực sông Mekong, với 62 loài khác nhau thuộc 21 họ và 14 bộ

Việc phân loại dựa vào hình thái để phân biệt các loài cá thuộc họ

Pangasiidae đem lại nhiều dữ liệu có giá trị Tuy nhiên, công tác định danh cá bột

và cá con dựa vào các chỉ tiêu bên ngoài cho độ chính xác nhất định do cá có kích thước quá nhỏ và chưa trưởng thành Vì vậy, việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử (DNA marker) có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ định danh các loài cá bột

và cá con Các kỹ thuật hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi trong thuỷ sản để tạo ra các DNA marker như: RFLP, RAPD, AFLP (xem mục 2.3.1; 2.3.2 và mục 2.3.3) Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm việc định danh hình thái cá bột và cá con dựa vào vùng 12S rRNA và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể (mtDNA) (xem mục 2.3.4)

2.1.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu phân loại bằng hình thái cá nước ngọt Đồng Bằng Sông Cửu Long tuy đã bắt đầu từ lâu nhưng đến nay chưa có một tài liệu nào

hoàn chỉnh, đặc biệt là các loại cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae Mai Đình

Yên và cộng sự (1962) thống kê thành phần loài của một số loài cá bột và cá con vớt được trên sông Hồng ở Hà Nội, tuy nhiên lại ít đề cập đến việc mô tả chi tiết hình thái từng loài ở giai đoạn cá bột và con Sau đó hàng loạt các tác giả cũng công bố số liệu về thành phần loài như: Mai Đình Yên và cộng sự (1979), Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), Nguyễn Bạch Loan (1998) Các tác giải trên đều dựa vào số lượng các tia vi; hình dạng các tia vi, thân và miệng; hình dạng và

số lượng răng để định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae Sau đó, tác giả

Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) cũng đưa ra một số chỉ tiêu đặc

trưng và bộ hình về phân loại một số cá con thuộc họ Pangasiidae tương đối hoàn

chỉnh

Đến nay, Việt Nam vẫn chưa có một công bố nào về ứng dụng các chỉ thị di

truyền phân tử để định danh các loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae Nhìn

chung, phân loại cá nước ngọt trên sông Cửu Long hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn do thiếu dữ liệu Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến việc bảo tồn nguồn tài nguyên cá vốn có của vùng

2.2 Phương pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con

thuộc họ Pangasiidae

Ngày nay, việc định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae dựa vào nhiều

nguồn dữ liệu khác nhau Tuy nhiên, nguyên tắc thực hiện của phương pháp này là dựa vào các điểm đặc trưng bên ngoài như: chiều dài thân, màu sắc (màu sắc trên đầu, trên thân, trên các tia vi), số tia vi (vi hậu môn, vi ngực, vi bụng, vi lưng) Các chỉ tiêu trên quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần Ngoài ra, người ta còn phân biệt các chỉ tiêu trên theo cách khác Theo Apichart TermvidChakorn

(2003) các loài cá thuộc họ Pangasiidae đều trải qua bốn giai đoạn, mỗi giai đoạn

Ngoài ra, Apichart Termvidchakorn (2003) mô tả các chỉ tiêu để phân biệt

một số loài cá bột thuộc họ Pangasidae như sau:

Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878: Giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng

15 mm, cơ thể giống hình cái rìu nhỏ, miệng trên và ruột ngắn Cơ thể có sắc tố đen trên đầu và phần bụng của thân, sắc tố đen trên vi đuôi Đến khi chiều dài thân khoảng 30 mm, các tia vi mọc tương đối đầy đủ: vi lưng có 1 tia cứng và 6 tia mềm, vi hậu môn có 1 tia cứng và 29 – 30 tia mềm, vi ngực có một tia cứng và 8 – 9 tia mềm, vi bụng có 8 tia mềm

Hình 2.1 Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878; 15 mm

Pangasius larnaudii Bocourt, 1866: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15 mm:

có hắc tố trên đầu, thân và trên cuống đuôi, màng bụng đƣợc bao phủ bởi hắc tố, vi đuôi có hắc tố Đến giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng 30 mm: thân dài, miệng rộng, ruột ngắn, có hắc tố trên đầu, thân, vi lƣng và vi đuôi Số lƣợng các tia vi: vi lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia cứng và 28 – 32 tia mềm; vi ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng có 6 tia mềm

Hình 2.2 Pangasius larnaudii Bocourt, 1866; 16 mm

Pangasius macronema Bleeker, 1851: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15

mm, cơ thể có hắc tố trên đầu và thân, màng bụng có hàng hắc tố Giai đoạn khoảng 30 mm: cơ thể có hình cái rìu, miệng trên có hình cầu, có hắc tố trên đầu và thân Số lƣợng các tia vi: vi lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia cứng và 30 – 33 tia mềm; vi ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng 1 tia cứng và 6 tia mềm

Hình 2.3 Pangasius macronema Bleeker, 1851; 15 mm

Theo Nguyễn Văn Hảo (2005) thì mô tả hình thái đặc trưng của một số loài

cá thuộc họ Pangasiidae như sau:

P hypophthalmus: Thân dài, dẹp về phía đuôi, đầu và mõm hơi dẹp bằng,

khoảng cách hai mắt rộng, răng trên xương lá mía 2 đốm tách rời nhau, mỗi đốm này nối liền với đốm răng xương khẩu cái và song song với răng hàm trên

P larnaudii: Thân dài, phần trước tròn và dẹp dần về phía đuôi, gốc vây

lưng thẳng dốc, đầu dẹp bằng, mõm tù, hai hàm trên đều nhau, răng hàm nhỏ mịn, răng xương lá mía xếp thành hai đốm rời nhau và nối với đốm răng xương khẩu cái ở bên hoặc làm thành một vòng cung liên tục

P marcronema: Thân dài, dẹp bên, đầu rộng dẹp bằng, mõm ngắn hàm trên

nhô ra hơn hàm dưới, răng hàm nhỏ mịn, râu dài kéo quá gốc vi ngực, mắt to lưng

thẩm P macronema trông rất giống P siamensis nhưng nhìn kỹ có một vài điểm

khác nhau là: Đường lưng hơi lõm xuống, đầu hình chóp nhọn, hơi dẹp bên, râu dài

đến gốc vi bụng (dài hơn P macronema), số lượng các tia vi của hai loài như sau:

2.3 Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá

2.3.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Là phương pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn Nguyên tắc phương pháp là sau khi thực hiện phản ứng cắt bộ gen bằng một enzyme cắt giới hạn xác định, từ đó xác định được có hay không có sự thay đổi một đoạn trình tự DNA qua kết quả điện di để có thể phát hiện sự khác biệt về đa dạng di truyền của đối tượng đang nghiên cứu Enzyme nhận biết các vị trí cắt tại 4, 5, 6 hay 8 bp trên dãy trình tự và cắt tại điểm nhận biết Kết quả cho ra các đoạn DNA với kích thước khác nhau được quan sát trên gel agarose, nhận biết các đọan cần phân tích bằng cách cho lai các đoạn trên với một probe đặc biệt, tiếp tục quan sát trên gel điện di, đoạn nào gắn với probe là đoạn cần tìm (Dodgson và ctv, 1997) Khó khăn lớn nhất trong phương pháp RFLP là xác định mức độ đa hình thấp, khó thực hiện và tốn nhiều thời gian Vì vậy, phương pháp này ít được ứng dụng trong thủy sản

2.3.2 Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật này được phát triển đầu tiên bởi Welsh và MeClelland (1990); Williams và ctv (1990) Khuếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên, chiều dài khoảng 8 – 10 bp Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong thủy sản, hàng loạt các kết quả nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật này rất thành công ở một số loài thủy sinh vật: Partis và Wells (1996) sử dụng marker RAPD để phân loại thành công nhiều loài cá, phân tích cấu trúc của tảo biển do Van Oppen và ctv (1996), phân tích cấu trúc của tôm sú do Klibunga và ctv (2000)

2.3.3 Phương pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Tương tự như RFLP, nhưng AFLP là sự kết hợp giữa hai phương pháp RFLP và RAPD, nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn nhân Mồi ở đây không thiết kế ngẫu nhiên mà thiết kế trên trình tự của adaptor và gắn thêm một nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, sau đó gắn tiếp 3 nucleotide Bấy giờ những trình tự nào có gắn với adaptor mới được khuếch đại bằng mồi đặc hiệu với adaptor, điều này có ý nghĩa

chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần khuếch đại Young và cộng sự (2001) đã sử dụng phương pháp AFLP tạo ra 133 loại marker trong đó có 23 loại được dùng để chẩn đoán phân biệt các loại cá Hồi Phương pháp APLP cho độ chính xác cao tuy nhiên ít được ứng dụng rộng rãi trong thủy sản do vấn đề kinh tế

2.3.4 Phân tích DNA ty thể (mtDNA)

 Các nghiên cứu về mtDNA ứng dụng trong thủy sản

Do cấu trúc và điểm di truyền đặc biệt nêu trên nên mtDNA marker ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự đa dạng nguồn vật nuôi thủy sản gồm: cá Chình (Avise và cộng sự, 1986), cá Lam của (Graves và cộng sự, 1992), cá Đù đỏ (Gold và cộng sự 1993), cá Mập (Heist và Gold, 1999) Kết hợp với sinh tin học (bioinformatics), mtDNA được sử dụng thành công trong việc xây dựng cây phân loài Đầu tiên là công trình nghiên cứu của Wheeler và Honeycutt (1988), sau đó là Smith (1989), Hillis (1993) đều sử dụng trình tự rRNA để quan sát các điểm đột biến và ứng dụng để xây dựng cây phát sinh loài Đặc biệt là thành công của Douzery và Catzeflis (1995) đã giải trình tự vùng 12S rRNA mtDNA nhiều loài để nghiên cứu sự phân loại của động vật có xương sống Pouyaud và cộng sự (2000)

thành công về ly trích DNA của cá da trơn Pangasiidae và sử dụng cặp mồi chuyên

biệt (thiết kế bởi Chang và cộng tác viên, 1994) khuếch đại vùng 12S trên mtDNA, sau đó giải trình tự để quan sát sự khác biệt về khoảng cách di truyền giữa các loài

thuộc họ Pangaiidae qua cây phân loài Tương tự, Gustiano và cộng sự (2003) phân tích 907 mẫu cá giống Pangasius thuộc họ ca da trơn Pangasiidae thu từ một số

nước Đông Nam Á như: Việt Nam, Malaysia, Indonesia chỉ ra sự khác biệt về trình

tự vùng 12S rRNA trên mtDNA của các loài thuộc giống Pangasius ở mức độ từng

base pairs Vùng 12S rRNA trên mtDNA được sử dụng để thiết kế mồi Sau đó giải trình tự được 737 nucleotide trên vùng 12S mtDNA của tất cả các loài thuộc giống

Pangasius, và đã xác định các trình tự khác nhau của các mẫu cá phân tích Kết quả được quan sát rõ qua cây phân loài là hầu hết các loài P kunyit thu từ Việt Nam và Indonesia có khoảng cách di truyền rất gần nhau, d = 0,003; P macronema (từ Indonesia) và P polyuanodon (thu từ Việt Nam) là d = 0,004; P djambal và P bocourti có d = 0,005 Một nhóm cá P kunyit thu từ sông Mekong Việt Nam và P kunyit thu từ miền Bắc Borneo Malaysia giống nhau đến 77,2%, có khoảng cách di truyền là d = 0,01 Quan sát nhiều loài khác cũng có kết quả tương tự: P humeralis và P nieuwenhuisii d = 0,006 Nhìn chung, tất cả các nghiên cứu trên đều giải quyết

một vấn đề chung là sử dụng ưu điểm của mtDNA để xác định mối quan hệ về di

truyền của các cá thể cùng loài ở nhiều vị trí địa lý khác nhau và cho ra kết quả rất thỏa mãn mà phương pháp phân tích hình thái khó giải thích được

Pangasiide được xác định là họ có nhiều loài cá có ý nghĩa kinh tế của vùng

sông MeKong, Tác giả Na-Nakorn và cộng sự (2006) đã thực hiện nghiên cứu hơn

600 cá thể, trong đó có 143 cá thể là Pagasianodon gigas (thu từ Cambodia và Thái Lan), 95 cá thể Pangasianodon hypophthalmus và 435 cá thể thuộc 7 loài, trong đó 5 loài Pangasius: P bocourti, P conchopphilus, P larnaudii, P macronema, P sanitwongsei và hai giống với hai loài sau: Helicophagus waandersii, Pteropangasius pleurotaenia Cặp mồi được thiết kế chuyên biệt để khuếch đại

vùng 16S trên mtDNA (vùng này có chiều dài 568 bp), sau đó giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài để quan sát sự đa dạng về di truyền của 5 giống, 9 loài thuộc

họ Pangasiidae Kết quả có 56 haplotypes từ 9 loài Pagasiidae đã được xác định Trong đó, loài có số lượng haplotype cao nhất là P larnaudii với 11 kiểu và loài có số lượng haplotypes thấp nhất là P macronema với 2 kiểu Khi quan sát từ vùng

16S rRNA, sự khác nhau giữa các haplotypes về trình tự nucleotide là rất ít, chỉ từ một đến ba điểm đột biến Ở tất cả các loài, sự khác biệt giữa các haplotypes ở mức độ từ thấp đến trung bình là 0,118 – 0,667 và sự khác biệt gữa các nucleotide thì ở mức rất thấp: 0,0002 – 0,0016 Ngoài ra, trong kết quả của nghiên cứu này người ta còn thấy gần như tất cả các loài đều xuất hiện đột biến Điều này được biện luận

rằng có khả năng do họ Pangasiidae phân bố quá rộng, mặt khác do xuất hiện từ rất

lâu nên có thể bị tiến hóa theo thời gian Các kết quả trên cho thấy, khi quan sát và so sánh trình tự mtDNA giải quyết được nhiều vấn đề trong việc định danh các loài cá, về quan hệ di truyền một cách nhanh chóng mà phương pháp định danh hình thái khó giải quyết được

2.3.5 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, thực chất

đây là phương pháp tạo dòng in vitro Với sự tham gia của một enzyme chịu nhiệt DNA polymerase (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990)

Khi DNA polymerase họat động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn khi có sự hiện diện của mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Khi ta cung cấp hai mồi chuyên biệt, một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer), bắt cặp bổ sung với hai đầu của

trình tự DNA, các triphosphate deoxyribonucleotid sẽ được enzyme Taq gắn bổ

sung vào đầu 3’OH của mồi

2.3.6 Phương pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động

Đây là phương pháp giải trình tự cải tiến từ phương pháp Sager DNA được nối dài với sự xúc tác của enzyme DNA polymerase, có sự tham gia của trình tự mồi ngắn bổ sung với mạch đơn cần giải trình tự, dNTP’s và các thành phần cần thiết khác, cùng một lượng nucleotide có 2’,3’-dideoxyribose được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang (bốn màu cho bốn loại bazơ khác nhau) Sau đó, sản phẩm PCR chứa hỗn hợp các đoạn DNA khi đi qua một điện di mao quản sẽ được phân tách và phát huỳnh quang khi được kích thích bởi tia laser Trình tự DNA được ghi lại thông qua tín hiệu huỳnh quang thu được trên đồ thị sắc ký

Hình 2.5 Các picks màu quan sát trên máy Scan Pick màu xanh là vị trí của bazơ Adenine (A), pick màu đỏ là vị trí của bazơ thymine (T), pick màu đen là vị trí của bazơ Guanine (G), cuối

cùng là pick màu tím là vị trí của bazơ Cytosine (C)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian nghiên cứu: từ 19/03/2007 – 20/07/2007

Địa điểm thực hiện: Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thuỷ Sản Nội Địa và Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu cá

Các mẫu cá họ Pangasiidae có chiều dài từ 15 mm– 30 mm được thu vào

mùa lũ năm 2006 (từ tháng 6-2006 đến tháng 9-2006) và tháng 6/2007, từ hai nhánh sông Tiền và sông Hậu, hiện đang được lưu giữ tại Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thủy Sản Nội Địa, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

và chỉnh thể tích bằng H2O cho đủ 1 lít TBE 1X sử dụng trong điện di: pha 100 ml TBE 10X cho nước cất và đủ 1lít

Dung dịch nạp mẫu bromophenol 6X: 0,25% (w/v) bromophenol blue và 40% (v/v) glycerol

Ethidium bromide: hòa tan 50 mg ethidium bromide trong 5 ml nước cất hai lần và bảo quản trong chai tránh sáng

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích hình thái

o Kính hiển vi sôi nổi với độ phóng đại 40 lần

o Thước kẽ ôli, đĩa petri và các thiết bị hỗ trợ cho việc định loại o Các dụng cụ kéo, kẹp, kim

Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích DNA * Thiết bị sử dụng

- Máy Vortex (Zx3 Velp) - Máy block nhiệt khô

- Máy ly tâm

- Máy PCR (Thermocycle – Biorad)

- Bộ điện di (Biorad Hybaid)

- Bàn đọc UV (White/UV Transillminator)

- Tủ mát, tủ lạnh -200C (Liebherr) - Tủ cấy vô trùng (Laminar – Box)

- Cân phân tích

- Lò viba

* Dụng cụ sử dụng

- Pipettman loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl

- Đầu tip tương ứng với các loại pipet man

- Eppendorf loại 0,2 ml, 0,5 ml và 1,5 ml

- Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu

- Đèn cồn, kéo, kẹp, chày nhựa

3.3 Phương pháp

3.3.1 Phương pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột

Sử dụng mẫu đã được thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006, trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu Mẫu được thu mỗi ngày 4 lần: 5giờ sáng, 11 giờ, 17 giờ và 23 giờ trên mỗi nhánh sông (mỗi lần thu được tính là một mẫu) Mẫu được thu bằng lưới Bongo net có kích thước mắt lưới 2a = 1 mm Sau đó cố định mẫu bằng formol 5% và bảo quản trong ethalnol 20%, lưu giữ tại Bộ Môn Ngư Loại Học, Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thủy Sản Nội Địa Từ các mẫu được lưu giữ, chúng tôi

lần lượt tách và lựa ra các cá thể họ Pangasiidae, để riêng từng mẫu và ghi nhận lại: Vị trí thu mẫu, thời gian thu mẫu, số lượng Pangasiidae từ mẫu ban đầu

Các số liệu sau khi ghi nhận, đươc xử lý với các hàm trong Access và Excel Mẫu bổ sung thu từ 22/6/2007 – 30/6/2007, ngày hai lần trên mỗi nhánh sông với hai ngư cụ: lưới Bongo net có kích thước mắt lưới 2a = 1 mm và đáy nhỏ Sau đó mẫu được bảo quản trong ethalnol 95%

Từ các mẫu chứa họ Pangasiidae đem quan sát dưới kính hiển vi sôi nổi với

độ phóng đại 40 lần, kết hợp cùng với các tài liệu phân loại để xác định cụ thể từng

loài riêng biệt: P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema Ba lọ nhựa có dán

nhãn riêng biệt được sử dụng để lưu giữ tất cả các cá thể ứng với mỗi loài trên Đồng thời ghi lại các thông tin liên quan như: Vị trí thu mẫu, thời gian thu mẫu, số

lượng từng loài: P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema

Trong quá trình định loại, chúng tôi cố gắng phân loại hết tất cả các loài có

trong họ Pangasiidae Sỡ dĩ chúng tôi chú trọng đến ba loài trên là vì trên ngân

hàng genbank đang lưu giữ ba loài trên

3.3.2 Phương pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform

Cắt một góc vi đuôi của mỗi cá thể cho vào eppendoff và nghiền nhuyễn với 400 µl dung dịch NaOH-SDS để phá vỡ tế bào Sau đó biến tính protein bằng cách nung ở 1000C trong 7 phút và làm lạnh nhanh 5 phút Đem ly tâm 5 phút với 13000 vòng/phút, hút 350 µl dịch nổi cho vào ống eppendoff mới Tiếp tục thêm 350 µl dung dịch phenol: chlorofrom: Isoamyl và vortex mạnh, ly tâm trong 2 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút Thu nhận 300 µl dịch nổi phía trên vào ống tip mới (Bước này được lặp lại lần hai nếu thấy lớp protein tủa trắng giữa dịch nổi và pha phenol-cloroform còn nhiều) Thêm vào vào khoảng 30 µl (1/10 thể tích dịch trong DNA) dung dịch 3M sodium acetate pH 5.2 Dùng ngón tay búng mạnh nhiều lần vào ống tip, sau đó cho 2.5V ethanol 100% lạnh vào, vortex và giữ trong tủ -200C trong 30 phút để DNA tủa Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút rồi đổ bỏ phần dịch nổi và giữ lại phần cặn có chứa nucleic acid Thêm vào phần cặn tủa 1 ml ethanol 70% để rửa muối có trong cặn tủa, úp ngửa vài lần Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Dùng pipete hút bỏ ethanol, làm khô cặn trong block nhiệt khô ở nhiệt độ 560

C cho đến khô hoàn toàn Hoà tan cặn lóng DNA bằng 100 µl nước cất trong block nhiệt khô khoảng 500C trong 10 phút, sau đó sử dụng ngay hay bảo quản trong tủ -200C

3.3.3 Phương pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA

Vùng trình tự gen mã hóa 16S rRNA được khuếch đại từ mtDNA theo phương pháp PCR (Na-Nakorn và cộng sự, 2006) Cụ thể như sau: mỗi phản ứng

PCR (50 µl) gồm: 25 µl PCR Master mix (Promega, Mỹ), 0,5 µl mỗi mồi 16Sar

5’CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3,) và 16Sbr

5’CCGGTCTGAACTC-AGATCATGT 3’ (mỗi mồi có nồng độ 50 pm/µl); mtDNA từ mẫu cá: 2 µl; nước

cất: vừa đủ 50 µl

Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR: Bước thứ nhất (1 chu kỳ), DNA được

biến tính ở 940C trong 3 phút Bước thứ hai (30 chu kỳ), biến tính DNA trong 30 giây, sau đó hạ nhiệt độ xuống 500C/30 giây để DNA và mồi bắt cặp Nâng nhiệt độ lên 720C/30giây Bước thứ ba (1 chu kỳ), nối dài cuối cùng 720C/10 phút Cuối cùng là hạ xuống 40C

3.3.4 Phương pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào các đặc tính của các acid nucleic Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Thông thường người ta sử dụng gel agarose để phân tích các đoạn có kích thước từ 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phương ngang Để đọc kết quả điện di người ta bổ sung một lượng ethidium bromide, chất này cho phép gắn xen vào giữa các base của các acid nucleic, dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang, qua đó xác định được vị trí của các đoạn DNA trên gel Để ước lượng kích thước của các đoạn DNA cần phân tích thì người ta dùng thang DNA (tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết kích thước) để so sánh với các vạch của sản phẩm PCR

Nồng độ gel agarose dùng phân tích sản phẩm PCR vùng 16S rRNA của mtDNA là 1% Cân 1 g gel agarose hòa với 100 ml dung dịch đệm điện di TBE 1X Đun agarose trong lò viba khoảng 2 phút sau đó đem ra lắc đều đồng nhất mẫu, đun tiếp tục khoảng 2 phút nữa, đem ra ngoài lắc đều dưới vòi nước mạnh Đến khi agarose còn khoảng 500C cho vào 5,3 µl ethidium bromide 1%, lắc nhẹ theo cổ tay cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ đến khi đều thì đổ vào khuôn đã gắn lược, chờ gel đông thì rút lược ra

Dùng 10 µl mẫu sản phẩm PCR trộn đều với 2 µl dung dịch nạp mẫu loading dye 6X Dùng pipete hút 10 µl đặt vào giếng gel, điện di 30 phút trong dung dịch đệm TBE 1X với dòng điện 100V Đặt gel dưới tia UV và quan sát kết quả

3.3.5 Phương pháp giải trình tự

Trong nghiên cứu này, sản phẩm khuếch đại là vùng 16S rRNA trên mtDNA Sản phẩm PCR được gửi đến công ty Công nghệ Sinh Học Nam Khoa (Tp Hồ Chí Minh) để giải trình tự trực tiếp nhờ thể thống giải trình tự mao quản tự động (CEQ 8000, Beckman Coulter) Sản phẩm PCR được giải trình tự trên cả hai mạch để có độ chính xác cao bằng hai mồi đặc hiệu 16Sar và 16Sbr

3.3.6 Phương pháp so sánh các trình tự

Trình tự vùng 16S trên mtDNA của cá Pangasiidae sau khi giải xong được

phân tích bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Sau đó kiểm chứng lại kết quả định danh bằng hình thái, sử dụng phần mềm DNAMAN

để xem sự khác biệt và sự bảo tồn về trình tự của các loài 3.4 Bố trí thí nghiệm

3.4.1 Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ

Pangasiidae

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng cách thu mẫu theo Dự Án Di Cư Cá Trên Sông MeKong năm 2006 ở hai nhánh sông Tiền (tại xã Vĩnh Xương) và sông Hậu (tại xã Quốc Thái) Tổng mẫu cá thu được từ tháng 6/2006 – tháng 9/2006 là 976 mẫu và 64 mẫu bổ sung được thu từ 22/6/2007 – 30/6/2007 Quá trình định danh phân loại bằng hình thái trãi qua hai giai đoạn

3.4.1.1 Giai đoạn định tính

 Phân tích mẫu có họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu được năm 2006

Số lượng các mẫu có xuất hiện các loài thuộc họ Pangasiidae đều được chọn

ra và ghi nhận lại Ở giai đoạn này, chỉ xác định có hoặc không có sự xuất hiện cá

họ Pangasiidae trong mẫu cá thu được, mẫu có mặt bất cứ một cá thể nào thuộc họ Pangasiidae cũng được tính là một mẫu (mẫu cá có họ Pangasiidae) Ngược lại,

mẫu không có bất cứ một cá thể nào thuộc họ Pangasiidae thì được tính là mẫu họ

khác Các công thức được tính như sau:

Tỉ lệ họ Pangasiidae thu được trên tổng mẫu thu năm 2006:

 % mẫu cá có họ Pangasiidae = (tổng số mẫu cá có họ

Pangasiidae/tổng số lượng mẫu thu được)*100%

 % mẫu họ khác = (tổng số mẫu không có cá họ

Pangasiidae/tổng số lượng mẫu thu được)*100%

Tần suất xuất hiện cá họ Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa và ở các

thời điểm khác nhau trong ngày:

Cộng và so sánh tất cả các mẫu có họ Pangasiidae xuất hiện trong từng

tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9

Tương tự, cộng và so sánh tất cả các mẫu có họ Pangasiidae xuất hiện trong

từng thời điểm: buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trưa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút)

 Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae

Từ các mẫu đã chọn, lấy ra các cá thể thuộc họ Pangasiidae cho vào lọ mới (mẫu Pangasiidae, trong mẫu này chỉ có cá thuộc họ Pangasiidae) Từ các mẫu này, tiếp

tục xác định có hay không có sự có mặt của một trong ba loài nghiên cứu, mẫu có mặt bất cứ một cá thể nào thuộc 3 loài phân tích cũng được tính là một mẫu xuất hiện loài nghiên cứu Ngược lại, mẫu không có xuất hiện bất cứ một cá thể nào trong 3 loài phân tích thì được tính là mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu Các công thức được tính như sau:

Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae thu được:

 % mẫu xuất hiện loài nghiên cứu = (tổng số mẫu xuất hiện loài

nghiên cứu/tổng mẫu cá họ Pangasiidae)*100%

 % mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu = (tổng số mẫu không

xuất hiện loài nghiên cứu/tổng mẫu cá họ Pangasiidae)*100%

Tần số xuất hiện mẫu có loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae ở các tháng

khác nhau trong mùa và ở các thời điểm khác nhau trong ngày:

Cộng tất cả các mẫu có xuất hiện loài nghiên cứu xuất hiện trong từng tháng:

Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9 so sánh với tất cả các mẫu Pangasiidae trên

các tháng tương ứng

Tương tự, cộng tất cả các mẫu có xuất hiện loài nghiên cứu xuất hiện trong từng thời điểm: buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trưa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các

mẫu Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tương ứng

3.4.1.2 Giai đoạn định lượng

 Tỉ lệ số lượng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác

Từ tất cả các mẫu chỉ chứa loài thuộc họ Pangasiidae (đã chọn ra ở giai đoạn định tính), tiếp tục chọn ra ba loài phân tích (P hypophthalmus, P larnaudii, P macronema) tương ứng với ba lọ riêng biệt (số lượng cá thể các loài phân tích), các cá thể còn lại trong mẫu Pangasiidae được gọi là cá thể các loài khác Sau mỗi giai

đoạn phân tích các số liệu về vị trí thu mẫu, ngày và giờ thu, số lượng, loài được ghi lại Các phép tính như sau:

Tỉ lệ % số lượng cá thể của 3 loài phân tích và các loài khác:

 Tỉ lệ % các loài phân tích = (tổng số lượng cá thể các loài

nghiên cứu/tổng số lượng cá thể họ Pangasiidae)*100%

chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các cá

thể họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tương ứng

 Tỉ lệ số lượng cá thể của mỗi loài cá phân tích

Tỉ lệ cá thể của từng loài phân tích trong tổng lượng cá thể Pangasiidae:

 Tỉ lệ % loài P macronema = (tổng số lượng cá thể loài P

Pangasiidae trên các tháng tương ứng

Tương tự, cộng tất cả các cá thể của từng loài phân tích riêng biệt xuất hiện trong từng thời điểm buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trưa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả

các cá thể họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tương ứng

3.4.2 Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA

Từ ba lọ chứa 3 loài cá nghiên cứu, chọn ngẫu nhiên mỗi lọ 10 cá thể với kích thước từ 15 mm – 30 mm Ghi nhận và vẽ lại các điểm đặc trưng của mỗi loài nghiên cứu Mục đích của giai đoạn này nhằm đối chiếu lại độ chính xác của phương pháp định danh hình thái sau khi phân tích DNA

3.4.3 Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA

Dựa vào kết quả định danh theo phương pháp hình thái, sau khi chọn và ghi nhận lại các điểm đặc trưng của 10 cá thể ở mỗi loài (mục 3.4.2) chúng tôi tiến hành phân lập và giải trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA

Dựa trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene (genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) đã có dữ liệu về trình tự và kiểu haplotype của 3 loài

phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA gồm: Pangasianodon hypophthalmus (mã số truy cập: DQ334282 – DQ334289); P larnaudii (mã số truy cập: DQ334303 – DQ334313) và P macronema (mã số truy cập: DQ334314 – 334315) Các trình tự

chuẩn này được sử dụng để làm trình tự đối chứng định danh ba loài phân tích

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae

4.1.1 Kết quả hình thái phân loại

Phân tích 976 mẫu thu được ở hai nhánh sông Tiền và sông Hậu năm 2006

trong đó có 357 mẫu có xuất hiện cá họ Pangasiidae, chúng tôi đã xác định được 3 loài của họ cá Pangasiidae (Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii ), theo Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) vị

trí phân loại như sau:

Đặc điểm hình thái phân loại Bộ cá nheo (Siluriformes)

Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lưng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy

Đặc điểm hình thái phân loại họ cá Tra (Pangasiidae)

Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lưng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy, có vi mỡ nhỏ ở sau vi lưng, vi hậu môn có 28 – 46 tia mềm, vi đuôi phân thùy sâu, đầu hơi dẹp trên dưới, miệng dưới, mép có hai đôi râu

Đặc điểm hình thái phân loại Giống Helicophagus, Pangasianodon và

Pangasius

1 Tia vi bụng từ 8 - 9 tia: Pangasianodon

Tia vi bụng nhỏ hơn 8 tia: 2

2 Tia vi hậu môn từ 37 - 40 tia: Helicophagus

Tia vi hậu môn nhỏ hơn 37 tia : Pangasius

Theo Apichart TermvidChakorn (2003), Nguyễn Văn Hảo (2005) (mục 2.2) và tài liệu của Nguyễn Văn Trọng (1997), Mai Đình Yên và ctv (1979) chúng tôi đã tổng

hợp nên các đặc điểm hình thái phân loại loài: Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii được mô tả và ghi nhận ở mục 4.2

Họ

Pangasiidae;

357; 36,56%

Họ khác; 619; 63,44%

Thời điểm thu

4.1.2 Kết quả giai đoạn định tính

4.1.2.1 Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006

Biểu đồ 4.2 Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae

A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ở các thời điểm khác

nhau trong ngày (sáng: 5:30 – 6:30 phút; trƣa: 11:30 – 12:30 phút; chiều: 17:15 – 18:15 phút và nữa đêm: 23:30 – 0:30 phút) B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ

Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa