Trƣớc khi nhân dòng vùng 16S rRNA trên mtDNA của tất cả các mẫu cá phân tích, chúng tôi thực hiện 2 lần thí nghiệm trên 3 loài đã định danh hình thái
35
đối với mẫu thu năm 2006 và 1 lần thí nghiệm cho mẫu năm 2005 bảo quản trong formol 5%:
Lần 1: 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 15 mm, 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 24 mm và 1 mẫu cá tra bảo quản trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử dùng làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có 1 mẫu 5T (giếng thứ 1) cho kết quả, 4 mẫu còn lại không có vạch DNA nào (hình A).
Lần 2:Tiếp tục tách 2 mẫu cá tra kích thƣớc 19 mm, từ các mẫu đã định danh năm 2006 và 1 mẫu cá tra (ký hiệu 5T) phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân tử làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có mẫu 5T cho một vạch DNA (giếng thứ 1), hai mẫu còn lại âm tính (giếng 1 và giếng 2) (hình B).
Lần 3: Cũng theo phƣơng pháp định danh nhƣ thế chúng tôi chọn 6 mẫu cá lớn đã xác định chính xác là cá họ Pangasiidae (kích thƣớc: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm), nhằm mục đích kiểm chứng lại DNA có bị phân huỷ bởi formol không và 1 mẫu chứng dƣơng 5T đã sử dụng cho lần thí nghiệm 1 và 2. Kết quả tƣơng tự, cả 6 mẫu cá lớn thuộc họ Pangasiidae bảo quản trong formol năm 2005 đều cho kết quả âm tính, chỉ có mẫu 5T là cho 1 băng DNA duy nhất (hình C).
Hình 4.4: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005. Hình A: lần thí nghiệm thứ nhất với 2 mẫu cá P. macronema 15 mm (giếng 1, giếng 2)
36
và 2 mẫu cá 24 mm (giếng 3 và giếng 4). 5T: mẫu đối chứng dƣơng.
Hình B: lần thí nghiệm thứ 2 với 2 mẫu cá P. hypophthalmus 19 mm (giếng 1, giếng 2). Mẫu 5T làm đối chứng dƣơng và M: thang Lambda DNA ECoRI Hind III.
Hình C: lần thí nghiệm thứ 3 với 6 mẫu cá thuộc họ Pangasiidae có kích thƣớc lần lƣợc là: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm (giếng thứ 1 đến giếng thứ 6). 5T là mẫu đối
chứng dƣơng.
Kết quả cả 3 lần thí nghiệm trên đều cho một kết quả duy nhất là mẫu 5T từ phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đều cho kết quả dƣơng và duy nhất chỉ có một vạch DNA. Nhƣ vậy, sản phẩm DNA rất tinh, phản ứng PCR chạy tốt. Trong hai lần thí nghiệm đầu, sau khi thực hiện phản ứng PCR các mẫu phân tích không cho vạch băng DNA nào có thể là do định danh sai hay DNA bị phá hủy bởi formol. Nhƣng với lần thí nghiệm thứ 3, thực hiện trên cả 6 mẫu cá lớn vẫn không cho một vạch băng DNA nào trong khi mẫu 5T vẫn hiện một vạch băng DNA rất rõ. Đến đây chúng tôi có thể kết luận rằng, formol đã phá hủy DNA.
Nhƣ vậy, mẫu cá năm 2006 không thể tiến hành phân tích DNA đƣợc. Chúng tôi tiến hành định danh bổ sung 64 mẫu cá thu vào tháng 6/2007 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu với phƣơng pháp định danh nhƣ đã định danh các mẫu cá năm 2006 và cách bố trí thí nghiệm tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục 3.4. Từ kết quả này, chúng tôi chọn 26 cá thể ngẫu nhiên từ 3 loài và có kích thƣớc chiều dài thân từ 15 mm đến 30 mm để kiểm tra trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA (Bảng 4.1).
37
Tên loài Ký hiệu Chiều dài thân (mm) P. hypophthalmus H1 15 H2 16 H3 17 H4 17 H5 18 H6 20 H7 21 H8 21 H9 21 P. larnaudii L1 20 L2 22 L3 23 L4 25 L5 27 L6 27 L7 28 L8 30 P. macronema M1 15 M2 17 M3 20 M4 22 M5 22 M6 22 M7 22 M8 25 M9 30 Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích
DNA ty thể từ các mẫu cá đã chọn đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp phenol- chloroform. MtDNA sau khi tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong 100 µl nƣớc cất khử ion và sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA trên mtDNA. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 1% (Hình 4.5).
38
Kết quả cho thấy, mồi chuyên biệt 16Sar và 16Sbr đã khuếch đại đặc hiệu với trình tự đích trên mtDNA để cho ra một băng sản phẩm duy nhất có kích thƣớc khoảng 630 bp. Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Na-Nakorn và cộng sự (2006). Đến đây chúng tôi có thể xác định đƣợc các mẫu cá trên thuộc họ
Pangasiidae. Chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự tất cả 26 mẫu cá phân tích, để xác định chính xác từng loài. Đồng thời kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái.