Chín mẫu cá ngẫu nhiên của loài P. macronema đƣợc đánh số ký hiệu từ M1 đến M9, mỗi cá thể có kích thƣớc khác nhau nhƣ đã trình bày ở bảng 4.1. Trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của từng cá thể đƣợc phân tích bằng chƣơng trình BLAST cho thấy cả chín trình tự đều có độ tƣơng đồng cao nhất với kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gene DQ334314). Trên cơ sở kết quả này, chƣơng trình DNAMAN đƣợc sử dụng để thực hiện phép so sánh trình tự giữa 9 mẫu phân tích với hai trình tự kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gen DQ334314) và P. macronema haplotype Pm02 ( mã số
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Hình 4.5.:Sản phẩm PCR khuếch đại một vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại điện; M : thang
LambdaDNA ECoRI Hind III; giếng1, 2, 3: loài P.
hypophthalmus ; giếng 4, 5, 6 loài P. larnaudii; giếng 7, 8,
9: loài P. macronema.
947 bp 564 bp 831 bp
39
trên ngân hàng gen DQ334315). Kích thƣớc các cá thể phân tích xem chi tiết ở bảng 4.1. DQ334314 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334315 --- 50 M1 --- 50 M2 --- 50 M3 --- 50 M4 ---t 50 M5 ---t 50 M6 --- 50 M7 ---t 50 M8 --- 50 M9 --- 50 Hình 4.6a DQ334314 TTTGTTCAACGATTAAAGTCCT 572 DQ334315 --- 572 M1 ---- 554 M2 ---a---t--- 572 M3 ---a---t--- 571 M4 ---a---t--- 572 M5 ---a---t--- 572 M6 ---a---t--- 572 M7 ---a---t--- 572 M8 ---a---t--- 572 M9 ---a---t--- 572 Hình 4.6b
Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA loài P.macronema trên ngân hàng gen (DQ334314, DQ334315) với trình tự 8 mẫu P. macronema phân tích (từ M1 – M9).
Hình 4.6a: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 50 của mẫu M4, M5, M7 so với hai trình tự chuẩn. Hình 4.6b: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 556 và 566 của 8 mẫu cá P. macronema (từ M2 đến M9) đang phân tích với hai trình tự chuẩn trên
ngân hàng gene.
Theo kết quả so sánh trình tự vùng 16S rRNA của mẫu cá M1 tƣơng đồng cao nhất so với kiểu gen P. macronema (Pm01) là 100% (xem phần phụ lục). Đặc biệt, kết quả phân tích cho thấy có 1 đột biến thay thế nucleotide ở 8/9 mẫu phân tích (mẫu M1 không có dữ liệu) có kết quả thống nhất khác biệt so với P. macronema (Pm01) và P. macronema (Pm02), đây là hai đột biến thay thế tại vị trí 556 (Thymine đƣợc thay bằng Adenine) và 566 (Adenine đƣợc thay bằng Thymine) (hình 4.6b).
40
Ngoài ra, còn ba vị trí mang đột biến thay thế nucleotide khác cũng đƣợc ghi nhận là Adenine thứ 50 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M4, M5, M7 (hình 4.6a); Cytosine thứ 251 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M2 (xem phụ lục), và cuối cùng là vị trí Cytosine thứ 326 của mẫu M8 đƣợc thay bằng Thymine (hình 4.6a).
Từ kết quả trên chứng tỏ rằng, khóa phân loài dựa vào hình thái đối với loài
P. macronema mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp khi định danh lại bằng cách so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của mtDNA. Khi nhìn vào trình tự giữa các cá thể chúng tôi phân tích và trình tự P. macronema (DQ334314) có vài điểm không tƣơng đồng. Có thể là lý do sau: trong quá trình tiến hóa các cá thể có thể gặp những biến cố về môi trƣờng dẫn đến một số nucleotide bị biến đổi để quy định các tính trạng phù hơp hơn với môi trƣờng sống. Rất có thể đây là những kiểu gen mới mà các tác giả đi trƣớc chƣa ghi nhận đƣợc trong khi hai trình tự của P. macronema
trên ngân hàng genbank chỉ khác nhau duy nhất một nucleotide tại vị trí 267 Thymine đƣợc thay bằng Cytosine (xem phần phụ lục).