BÁO CÁO TÓM TẮT : ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG CỦA NGÔ SỰ KIỆN DAS- 59122-7 ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI

QUI ĐỊNH VỀ BẢO MẬT © 2015 Pioneer Hi-Bred International, Inc Toàn quyền bảo hộ Pioneer Hi-Bred International, Inc (Pioneer) sở hữu quyền bảo hộ theo pháp luật thông tin, liệu tài liệu khác ("Thông Tin") Pioneer, cung cấp phần hồ sơ Bộ Nơng nghiệp-PTNT thành viên Ủy ban An tồn Sinh học Nhóm Cố vấn Kỹ thuật sử dụng Thông Tin cung cấp hồ sơ việc xét duyệt, đánh giá hồ sơ theo đề nghị Pioneer Bất kỳ sử dụng khác Thông Tin coi vi phạm tuân theo điều luật hành Bộ Tư Pháp Việt Nam tiết lộ thông tin; nhiên, miễn Bộ Nông nghiệp-PTNT Bộ Tư Pháp Việt Nam tuân thủ yêu cầu bảo vệ hành dành cho Pioneer Thông Tin hồ sơ để đáp lại yêu cầu cụ thể Sự đồng ý có giới hạn không xem cho phép Bộ Nông nghiệp-PTNT tham khảo, sử dụng, xem xét khác Thơng Tin nói trên, trực tiếp hay gián tiếp, để hỗ trợ đơn nộp đương đơn khác khơng có đồng ý trước văn Pioneer không miễn trừ, hình thức nào, quyền Pioneer (bao gồm quyền quyền sở hữu bồi thường) Thông Tin Pioneer quyền liên quan đến đơn vị khác MỤC LỤC I THÔNG TIN CHUNG Tổ đ n ấp Giấy xác nhận: Tên kiện chuyển en đ n II ấp Giấy xác nhận: THÔNG TIN VỀ CÂY CHỦ NHẬN GEN Tên chủ nhận gen Đặ điểm sinh học ngô: i n ệ i i n ựn i n đ n in ọ i iệ n in n ận ậ III THÔNG TIN VỀ SINH VẬT CHO GEN Tên sinh vật cho gen Thông tin l ch s tự n i n i n n đến an toàn thực phẩm, thứ Thơng tin việc tìm thấy tự nhiên chấ án in n ưỡn nn i độc t chất gây d ứng Thông tin việ đ n d ng (nếu có) chuỗi thực phẩm, thứ n nn i đư n p n iễm khác ngồi s d ng có chủ đí on IV THƠNG TIN LIÊN QUAN TỚI Q TRÌNH CHUYỂN GEN Thông tin liên quan t i đo n DNA chèn Miêu tả tính tr ng m i đặ điểm ngô chuyển gen 59122 so sánh v i gi n đ i chứng không chuyển gen 10 Thông tin tr ng cấp phép s d ng kiện DAS-59122-7 gi i 11 V ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG CỦA NGÔ SỰ KIỆN 59122 ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI 13 So sánh khác biệt thành phần in DAS-59122-7 ưỡng ngô kiện 13 đ i chứng truyền th ng không biến đổi gen: 13 Đán iá ả chuyển hóa thành phần in ưỡn đặc biệt chất m i sản phẩm biểu gen chuyển nế s d ng làm thực phẩ TĂC 14 Đán iá ả n n độc tính củ p o ein C y34Ab1 C y35Ab1 PAT cấy vào s d ng làm thực phẩ TĂC 14 Đán iá khả n n ây ứng chất m i sản phẩm biểu gen chuyển nế s d ng làm thực phẩm, thứ n n n i 19 VI ĐỀ XUẤT CÁC BIỆN PHÁP QUẢN LÝ RỦI RO TIỀM ẨN CỦA THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN ĐỐI VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI, VẬT NUÔI 22 VII KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 23 Kết luận: 23 Đề ngh : 23 BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÁ H GIÁ RỦI RO CỦA NGÔ SỰ KIỆN DAS-59122-7 ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI, VẬT NI (Theo Phụ lục 03 Thơng tư số: 02/2014/TT-BNNPTNT, ngày 24/01/2014 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn) I THƠNG TIN CHUNG Tổ chức đ n - cấp Giấy xác nhận: Tên tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Pioneer Hi-Bred Việt Nam; Người đại diện tổ chức: Nguyễn Thanh Sang, Tổng Giám đốc; Đầu mối liên lạc tổ chức: Nguyễn Thanh Sang, Tổng Giám đốc; Địa chỉ: Tầng 11, Central Plaza Office Building, 17 Lê Duẩn, Quận 1, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Điện thoại: (+84) 3825 1610 Fax: (+84) 3825 1620 E-mail: sang.nguyenthanh@pioneer.com Tên kiện chuyển en đ n - - II ấp Giấy xác nhận: Tên thông thường: Ngô, bắp (tiếng Việt) Maize/ Corn(tiếng Anh) Tên khoa học: Zea mays L Tên thương mại: Herculex® Sự kiện chuyển gen: Sự kiện DAS-59122-7 Tính trạng liên quan đến gen chuyển: Kháng sâu hại cánh cứng (protein Cry34Ab1 protein Cry35Ab1) kháng thuốc diệt cỏ gốc glyphosate (protein PAT sử dụng chất thị chọn lọc) Mã nhận dạng (nếu có): DAS-59122-7 Tên tổ chức tạo giống: Pioneer Hi-Bred International, Inc THÔNG TIN VỀ CÂY CHỦ NHẬN GEN Tên chủ nhận gen a Tên thông thường: Ngô, bắp( tiếng Việt) Maize/ Corn (tiếng Anh) b Tên khoa học: Zea mays L c Vị trí phân loại: Cây ngơ (Zea mays L.) thuộc chi ngơ (Zea), ngơ (Maydeae), họ phụ hịa thảo (Panicoideae), họ hịa thảo (Poaceae) Chi Zea có lồi bao gồm Zea mays Lồi Z mays có bốn phân lồi, Zea mays ssp mays nhóm hóa (ngơ) Ba phân lồi cịn lại Z mays gồm huehuetenangensis, mexicana parviglumis, gọi chung teosinte Họ hàng gần với chi Zea loài cỏ thuộc chi Tripsacum Đặ điểm sinh học ngơ: Ngơ lồi nhị bội thể (2n = 20) với mức độ hóa cao, thuộc Maydeae, họ hịa thảo, Poaceae Ngơ canh tác phổ biến tồn giới có lịch sử sử dụng an tồn lâu dài Hạt ngơ sản phẩm làm từ ngô thực phẩm thức ăn cho phần lớn dân số toàn cầu (CFIA, 1994) Theo tài liệu sinh vật học ngô truyền thống Tổ chức Hợp Tác Phát Triển Kinh Tế (OECD, 2003), ngơ lồi cỏ thân cao sinh trưởng quanh năm, thân với lớp vỏ bọc xếp chồng lên nhau, rộng mọc xen kẽ xung quanh thân Ngơ có nhiều hoa gồm râu ngô mọc lõi khoảng thân nhiều hoa đực gọi cờ mọc đỉnh thân có chức tung phấn Cây ngơ sinh sản lưỡng tính râu ngơ thụ phấn để tạo hạt ngô bắp Các hạt ngô xếp thành - 16 hàng dọc theo lõi ngô bao quanh lớp bảo vệ gọi bẹ ngô (OECD, 2003) Ngơ lồi thực vật sinh sản lưỡng tính với quan đực (bông cờ ngô) (râu ngô) tồn Phấn ngô tạo bơng cờ, thụ phấn cho râu ngơ (tự thụ phấn) cho xung quanh (thụ phấn chéo) Cả hai trình tự thụ thụ phấn chéo chịu ảnh hưởng yếu tố khoảng cách địa lý, phát tán phấn hoa khả thụ phấn Thơng thường khoảng 95% nỗn thụ phấn chéo từ lân cận 5% tự thụ phấn (Sleper Poehlman, 2006) M i n ệ i i n n in ậ n ận ựn i n đ n in ọ i iệ Ngô (Zea mays L.) có nguồn gốc từ Mexico trồng lấy thực phẩm từ năm 2.700 Trước Công Nguyên (Salvador, 1997) Khu vực Trung Mỹ phía nam Bắc Mỹ (Trung Nam Mexico Trung Mỹ) coi q hương lồi ngơ (OECD, 2003) Ngày nay, ngơ canh tác tồn cầu 166 quốc gia diện tích ước tính 184 triệu héc-ta (FAOSTAT, 2014) Ngơ có lịch sử lâu đời an toàn sử dụng làm thức ăn chăn ni, nhiên liệu thực phẩm, có vai trị quan trọng thị trường toàn cầu Khi sử dụng làm thức ăn chăn ni, tồn bắp ngơ nghiền trực tiếp, mà khơng cần tách hạt, để làm thức ăn cho động vật nhai lại (OECD, 2002b) Hoặc sau bắp ngô tách hạt, phần lõi sử dụng làm thức ăn gia súc (OECD, 2002b) Có thể cho vật ni ăn ngô nguyên hạt xử lý tối thiểu xay nghiền nấu chín (OECD, 2002b) Ngơ hạt trộn vào thành phần thức ăn chăn nuôi dạng xay, nghiền, nấu hay nén dạng viên (OECD, 2002b) Phần thân ngơ ủ chua sử dụng dạng thức ăn tươi cho vỗ béo vật nuôi gia súc lấy sữa (OECD, 2002b) Thân ngô chứa khoảng đến lần rưỡi tổng lượng chất dinh dưỡng có hạt hạt quy trình ủ chua giúp bảo toàn 90% lượng dưỡng chất (OECD, 2002b) Ngô loại thức ăn có tính chất gây dị ứng thấp (OECD, 2002b) Mặc dù có chứng nguy gây dị ứng loại protein kDa có chức vận chuyển lipit (Pastorello cs., 2000; Pastorello cs., 2003) protein 50 kDa làm giảm mức độ độ hịa tan có thành phần ngơ hạt (Pasini cs., 2002), ngô không xem loại thực phẩm hay nguồn thức ăn gây dị ứng đáng kể (Hefle cs., 1996; Moneret-Vautrin, 1998) khơng có tên danh sách thực phẩm có định gây dị ứng Cơ quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA, 2006) Ngô sử dụng Việt Nam nguồn lượng ngành công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, sử dụng làm thực phẩm dạng tinh bột ngô phần hạn chế sử dụng ngành công nghiệp khác sản xuất bia, dệt dược phẩm (USDA-FAS, 2014) Trong sử dụng làm thành phần thức ăn chăn nuôi, ngô hạt chủ yếu sử dụng chăn nuôi lợn gia cầm, chiếm khoảng 80% tổng lượng ngô hạt sử dụng nước (USDA-FAS, 2014) Tuy nhiên, hạn chế số liệu sử dụng thân ngô làm thức ăn tươi trực tiếp ủ chua Ở Việt Nam, diện tích trồng ngơ vào khoảng 1.2 triệu ha, khu vực miền núi phía Bắc với diện tích gieo trồng ước tính 502.000 ha, chiếm 42% tổng diện tích trồng ngơ Một diện tích ngơ đáng kể trồng Tây Nguyên (khoảng 247.000 ha), vùng ven biển Bắc Trung miền Trung (khoảng 202.000 ha), vùng Đông Nam (79.000 ha), đồng sông Hồng (86.000 ha) vùng đồng sông Mekong (40.000 ha) (Tổng cục Thống kê Việt Nam, 2013) III THÔNG TIN VỀ SINH VẬT CHO GEN Tên sinh vật cho gen Sinh vật cho gen cry34Ab1 cry35Ab1 a Tên thông thường: Vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) (vi khuẩn đất); b Tên khoa học: Vi khuẩn Bacillus thuringensis chủng PS149B1; c Vị trí phân loại: Lớp: Nhóm Bacillus/Clostridium (vi khuẩn Gram dương, G + C) Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Lồi: B thuringiensis Chủng: PS149B1 Sinh vật cho gen pat a Tên thông thường: Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes (vi khuẩn đất) b Tên khoa học: Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes c Vị trí phân loại: Lồi vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes: theo thứ tự thuộc Giới: Ngành: Lớp: Bộ: Họ, Chi Vi khuẩn, Actiniobacteria, Actiniobacteria, Actinomycetales, Streptomycineae, Streptomyces Thông tin l ch s tự n i n i n nuôi n đến an toàn thực phẩm, thứ n n Vi khuẩn Bacillus thuringensis cho gen cry34Ab1 cry35Ab1 Vi khuẩn Bacillus thuringensis, gọi Bt, loại vi khuẩn đất tự nhiên B thuringiensis thuộc nhóm vi khuẩn tạo nha bào, Gram dương phát lần Nhật Bản tằm bị bệnh vào năm 1901 Loại vi khuẩn tồn tự nhiên đất thực vật gồm rau, bông, thuốc lá, lấy gỗ rừng (Schnepf cs., 1998) Vi khuẩn Bt sản sinh nhiều loại protein tinh thể (Cry) có tính độc chọn lọc ấu trùng côn trùng thuộc số Bộ định Ví dụ protein Cry1 hiệu côn trung cánh màng, Lepidoptera; protein Cry3 hiệu côn trùng cánh cứng, Coleoptera (Clark cs., 2005) Nói chung, protein Cry có nguồn gốc từ vi khuẩn B thuringensis có lịch sử sử dụng an toàn lâu dài làm thuốc trừ sâu sinh học khơng có chứng ghi nhận tác hại gây protein Cry người hay động vật có mạch (US-EPA, 1995, 1996) Trong đánh giá tác động phơi nhiễm người phun Bt (Otvos cs., 2005) đến kết luận Bt thuốc trừ sâu sinh học an toàn sử dụng, không ghi nhận trường hợp nhiễm độc hay vấn đề sức khỏe người liên quan đến việc sử dụng chúng làm thuốc trừ sâu kể từ cách bốn thập kỷ Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes cho gen pat: Gen pat kiện DAS-59122-7 phiên có sửa đổi trình tự gen so với gen pat sinh vật cho gen, S viridochromogenes dòng Tü494 (Eckes cs., 1989) Đây loại vi khuẩn đất Gram dương, hình thành bào tử phổ biến, có khả tổng hợp tripeptide, L-phosphinothricyl-L-alanyl-alanine (L-PPT), chất sử dụng để tạo thuốc diệt cỏ không chọn lọc gốc phosphinothricin (OECD, 1999, 2002c) Tính an tồn protein PAT người động vật chứng minh qua nghiên cứu độc tính đường miệng cấp tính chuột với protein PAT nghiên cứu kéo dài 90 ngày động vật gặm nhấm ăn ngô kiện DAS-591227(Brooks, 2000; MacKenzie cs., 2007); Khơng có tương đồng trình tự chuỗi axít amin protein PAT với chất gây độc hay dị ứng biết đến (Krauss, 2013a, b; Meyer, 1999; OECD, 1999); nhanh chóng bị phân giải protein PAT dịch dày mơ (OECD, 1999); tính khơng bền với nhiệt protein PAT (Hérouet cs., 2005; OECD, 1999) Thơng tin chi tiết protein PAT tham khảo tài liệu thống Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế thông tin chung liên quan đến gen enzym liên quan tới khả kháng thuốc diệt cỏ gốc phosphinothricin (OECD, 1999) Thơng tin việc tìm thấy tự nhiên chấ chất gây d ứng án in ưỡn độc t Vi khuẩn B thuringiensis cho gen cry34Ab1 cry35Ab1 Trong khoảng 50 năm qua, nhiều loài vi khuẩn Bt có chứa protein Cry sử dụng an toàn làm thuốc trừ sâu lĩnh vực nơng nghiệp thương mại hóa (Siegel, 2001) sản phẩm có nguồn gốc từ chuyển gen có chứa protein Bt thương mại hóa từ năm 1996 sử dụng tương đối rộng rãi an toàn làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi (Hammond Koch, 2012) Tại thời điểm đó, hồn tồn khơng có ghi nhận tác động bất lợi đáng kể gây protein Cry người động vật có mạch (US-EPA, 1995, 1996) Sản phẩm Bt thương mại thử nghiệm điều kiện đồng ruộng Hoa Kỳ vào năm 1958 (Faust, 1974) cơng thức có thành phần kết hợp số nhóm protein Cry đăng ký Mỹ từ năm 1961 (Betz cs., 2000; Schnepf cs., 1998) Trong lịch sử sử dụng rộng rã liên tục suốt 50 năm qua, chưa có báo cáo hay ghi nhận tác động tiêu cực đáng kể đến người hay môi trường môi trường từ việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt (Betz cs., 2000) Vi khuẩn S viridochromogenes cho gen pat Bản thân S viridochromogenes xác định tác nhân gây bệnh người khơng liên quan đến thuộc tính khác (ví dụ tính sinh độc tố) biết có ảnh hưởng đến sức khỏe người Một đánh giá an toàn chi tiết bao gồm đánh giá tính độc tính gây dị ứng đưa đến kết luận việc đưa protein PAT từ Streptomyces vào thực phẩm thức ăn chăn nuôi không làm ảnh hưởng đến tính an tồn người hay vật nuôi (Hérouet cs., 2005) Thông tin việ đ n d ng (nếu có) chuỗi thực phẩm, thứ nn i on đư n p n iễm khác ngồi s d ng có chủ đí n Bacillus thuringensis Streptomyces viridochromogenes vi khuẩn phổ biến đất B thuringensis sử dụng tác nhân kiểm sốt trùng qua nhiều thập kỷ Chế phẩm Bt thương mại hóa sản xuất Pháp vào năm 1938 (OECD, 2002a), sau có nhiều sản phẩm sản xuất từ nhiều công thức khác bán sử dụng cho mục đích kiểm sốt nhiều lồi sâu hại khác nhiều loại trồng khác Lịch sử lâu dài việc sử dụng an tồn có sản phẩm từ B thuringensis sử dụng trừ sâu sinh học (Mendelsohn cs., 2003) Ngồi ra, (Otvos cs., 2005) chứng minh khơng tồn nguy đáng kể sức khỏe người liên quan đến việc sử dụng sản phẩm B.thuringensis trồng Việc không tồn tác động bất lợi động vật có vú, bao gồm người, không không tồn môi trường pH kiềm ruột enzym cần thiết để hoạt hóa δ-endotoxin, mà cịn nhanh chóng bị phân giải (dưới giờ) độc chất thành chất khơng có tính độc (Otvos cs., 2005) Ngoài ra, bào tử hay tinh thể Bt lại sau qua dày tiết, thường vòng vài ngày, không gây nên tác dụng bất lợi Các kết có từ nghiên cứu thực nghiệm cho thấy tế bào động vật có vú khơng có thụ quan cụ thể để liên kết với độc chất Bt (Otvos cs., 2005) Tương tự, báo cáo Chương Trình An Tồn Hóa Học Quốc Tế Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) tiêu chí sức khỏe mơi trường Bt kết luận rằng: “Do cách thức hoạt tính đặc trưng, sản phẩm Bt khơng có khả gây nguy hại người lồi động vật có mạch khác…” “Chưa có chứng ghi nhận tác động tiêu cực Bt gây sức khỏe người diện nước uống thực phẩm” (IPCS, 1999) Các loài Streptomyces phân bố rộng rãi tự nhiên, phần phổ biến sinh toàn giới Có lồi Streptomyces liên quan đến tác nhân gây bệnh người, động vật thực vật Có nhiều lồi Streptomyces tương tự với S viridochromogenes nhiều lồi số có chứa gen có trình tự tương đồng với gen pat (Hérouet cs., 2005) Đặc trưng enzym tương tự sản phẩm biểu gen pat xác định có sáu lồi vi khuẩn khác đến từ năm chi vi khuẩn phổ biến đất (Bartsch Tebbe, 1989) số vi khuẩn có mang đoạn vật chất di truyền tương đồng với gen pat Tuy nhiên, khơng có gen hay đoạn vật chất di truyền tương đồng số báo cáo có nguy gây độc hay gây dị ứng người động vật (Kutzner, 1981) Kết luận, việc chuyển nạp gen vào loại trồng đoạn vật chất di truyền có nguồn gốc từ S viridochromogenes, mã hóa việc tổng hợp nên protein PAT, dự kiến không dẫn đến việc tạo loại trồng chuyển gen có khả gây bệnh, gây độc gây dị ứng cho người hay động vật (Hérouet cs., 2005) IV THƠNG TIN LIÊN QUAN TỚI Q TRÌNH CHUYỂN GEN Thông tin liên quan t i đo n DNA chèn Ngô 59122 tạo nhờ phương pháp chuyển nạp gen cry34Ab1, cry35Ab1 gen phosphinothricin acetyltransferase (pat) cách sử dụng chuyển nạp gen qua vi khuẩn trung gian Agrobacterium với plasmid PHP17662 có kích thước 50.321 bp; vào dịng ngơ Hi-II Vùng T-DNA PHP17662 kích thước 7.390 bp có chứa ba tổ hợp gen - Tổ hợp gen thứ có chứa gen cry34Ab1 có nguồn gốc từ Bt điều khiển promoter ubiZM1 Vùng promoter ubiZM1 bao gồm vùng không mã hóa 5’ (UTR) vùng intron liên quan đến promoter ubiZM1 (Christensen et al., 1992) Terminator gen cry34Ab1 có trình tự terminator từ gene ức chế proteinase (pinII) Solanumtuberosum (An et al., 1989) - Tổ hợp gen thứ hai có chứa gen cry35Ab1 từ Bt (Hertig et al., 1991) có promoter TAperox có nguồn gốc từ Triticum aestivum terminator thứ hai terminator pinII - Biểu đồng thời protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 mang lại bảo vệ chống lại phá hại loài bọ cánh cứng - Tổ hợp gen thứ ba có chứa phiên sửa đổi gen pat từ Streptomyces viridochromogenes (Wohlleben et al., 1988) điều khiển vùng promoter terminator 35S (CaMV) nguồn gốc từ vi rút khảm cải (Guilley et al., 1982) Gen pat tối ưu hóa biểu phosphinothricin acetyltransferase (PAT) cây, đem lại khả kháng L-isomer phosphinothricin (L-PPT), thành phần hoạt tính thuốc diệt cỏ glufosinate-ammonium Plasmid PHP17662 cấu tạo sau: - Trước tiên, gen cry34Ab1 cry35Ab1 mã hóa protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 có nguồn gốc từ Bt chủng PS149B1 Các trình tự mã hóa cry34Ab1 cry35Ab1 gốc sửa đổi để biểu tối ưu ngô Các gen cry34Ab1 cry35Ab1 tối ưu hóa ngơ với gen pat tối ưu hóa thực vật từ Streptomyces viridochromogenes thành phần điều khiển cần thiết sau tập hợp cấy vào vector trung gian để tạo plasmid PHP17661 - PHP17661 có chứa trình tự T-DNA biên phải liên kết với promoter ubiZM1, gen cry34Ab1, terminator pinII, promoter TAperox, gen cry35Ab1, thứ hai terminator pinII, promoter CaMV 35S, gen pat tối ưu hóa biểu thực vật terminator CaMV 35S dung hợp với trình tự T-DNA biên trái; Vector mạch bao gồm gen kháng spectinomycin (spc), trình tự ADN ori colE1có nguồn gốc vi khuẩn, vị trí cos thể thực khuẩn lambda, gen kháng tetracycline (tetA tetR), trình tự ADN oriT có nguồn gốc vi khuẩn, operon ctl điều khiển nhân vi khuẩn, trình tự ADN oriV có nguồn gốc vi khuẩn gen mang độc tính (virB, virC1, virC2 virG) từ Agrobacterium tumefaciens Plasmid PHP17661 chứa vi khuẩn Escherichia coli chủng HB101 tiếp hợp với PHP10523 bao gồm gen kháng tetracycline pSB1 (Komari et al., 1996) chứa vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 (Hoekema et al., 1983) tái tổ hợp tương đồng, tạo thành PHP17662 chứa vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 Vùng T-DNA từ plasmid PHP17662 gắn vào gen ngơ q trình chuyển nạp gen để tạo ngơ 59122 Miêu tả tính tr ng m i đặ điểm ngô chuyển gen 59122 so sánh v i gi n đ i chứng không chuyển gen - Ngô 59122 tạo nhằm kháng lại loài gây hại cánh cứng bao gồm sâu đục rễ ngơ có tên gọi western corn rootworm (WCR, Diabrotica virgifera virgifera) Tính bảo vệ tạo cách cấy vào gen cry34Ab1 cry35Ab1 phân lập từ vi khuẩn đất Bacillus thuringensis (Bt) Những gen mã hóa protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 chúng bao gồm protein tinh thể trừ sâu hoạt tính - Ngơ 59122 có chứa gen pat phân lập từ Streptomyces viridochromogenes mà mã hóa protein PAT Biểu protein PAT ngơ 59122 tính kháng thành phần hoạt tính diệt cỏ glufosinate-ammonium có chức yếu tố đánh dấu để chọn ngô chuyển nạp gen phịng thí nghiệm - Phân tích thành phần hạt ngơ kiện 59122 cho thấy có giá trị dinh dưỡng thành phần tương đương với hạt ngô truyền thống Trong nghiên cứu thành - phần này, thành phần ngơ ngun hạt kiện 59122 phân tích so với thành phần ngơ hạt từ dịng ngơ khơng chuyển gen có xét tới yếu tố khác biệt tự nhiên thành phần tính khác biệt di truyền yếu tố địa lý, mơi trường Phân tích gần mẫu hạt cho thấy hàm lượng thành phần hạt ngơ kiện 59122 hạt mẫu ngô giống đối chứng không chuyển gen tương đương nằm khoảng giới hạn công bố trước ngô hạt Các đặc điểm nông học ngô kiện 59122 đánh giá chứng minh tương đương hay không khác biệt với đặc điểm nông học ngơ truyền thống có di truyền tương đương ( Pauli et al., 2015a) Ngô 59122 ngô đối chứng có di truyền tương đương trồng bảy điểm trồng ngô thương phẩm Mỹ Canada mùa vụ 2004 (Buffington, 2005) Các địa điểm nằm Illinois (hai địa điểm), Iowa (hai địa điểm, Indiana Ontario, Canada (hai địa điểm) Theo dõi đặc điểm nông học (mật độ ban đầu, sức sống con, thời gian phun râu, tung phấn, chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, tỷ lệ gãy đổ, số lượng thu hoạch, giá trị xanh, tỷ lệ bệnh, tỷ lệ hại sâu, ẩm độ hạt) suốt mùa vụ canh tác, dựa so sánh giá trị trung bình tiêu đánh giá, kết tương đương ngô kiện 59122 ngô đối chứng Thông tin tr ng cấp phép s d ng kiện DAS-59122-7 gi i Hồ sơ phân tích đánh giá tính an tồn kiện DAS-59122-7 nộp tới quan có thẩm quyền nhiều quốc gia giới, kiện DAS-59122-7 canh tác và/hoặc sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi 13 nước (Bảng 1) Các cấp phép ngô 59122 bắt đầu vào năm 2005 kể từ sản phẩm có chứa ngơ 59122 tiêu thụ toàn cầu với lịch sử thập kỷ sử dụng an toàn Giấy phép cấp cho kiện DAS-59122-7 vào năm 2005, từ đến kiện DAS-59122-7 tiếp tục nhận ủng hộ tích cực sau thập kỷ sử dụng an toàn sản phẩm Bản 1: Danh sách quốc gia cấp phép trồng và/hoặc sử dụng kiện 59122 Lo i hình cấp phép Qu c gia i ng Úc Canada Thực phẩm và/hoặc Thứ n 2005 (Thực phẩm) 2005 Trung Quốc 2005 2006 2011 (Thực phẩm) Côlômbia 2010 (Thức ăn Chăn nuôi) EU (Liên minh Châu Âu) 2007 2005 (Thực phẩm) Nhật Bản 2006 2006 (Thức ăn Chăn nuôi) Hàn Quốc 2005 Mexico 2005 Philippin 2006 Singapore 2010 Nam Phi 2011 Đài Loan 2005 (Thực phẩm) 2004 (Thực phẩm) Mỹ 2005 2005 ức ăn Chăn nuôi) nn i V ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG CỦA NGÔ SỰ KIỆN 59122 ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI So sánh khác biệt thành phần in DAS-59122-7 ưỡng ngô kiện đ i chứng truyền th ng không biến đổi gen: Đánh giá so sánh thành phần ngô bị biến đổi gen so với thành phần ngơ chưa bị biến đổi gen có lịch sử sử dụng an toàn làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi phần quan trọng làm chứng sử dụng để đánh giá an toàn sản phẩm thực phẩm bị biến đổi gen (Codex Alimentarius Commission, 2008; OECD, 1993) So sánh thành phần thực ngô 59122 ngô đối chứng chưa bị biến đổi gen để đánh giá liệu ngơ 59122 có an tồn dinh dưỡng giống ngơ khác hay khơng sử dụng thay cho ngơ đối chứng mà khơng có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người vật nuôi hay không(Pauli et al., 2015b) Dựa chế tác động tính trạng, dự đốn protein kháng sâu côn trùng không làm thay đổi thành phần ngô Ngô đối chứng chưa biến đổi gen, có tính tương đồng gen lớn 94% so với ngô 59122 lựa chọn làm mẫu so sánh Ngô 59122 ngô đối chứng trồng bảy địa điểm cánh đồng (hai Canada năm Mỹ) Ba mẫu hạt (tại giai đoạn R6) ba mẫu (tại giai đoạn R4) thu gom địa điểm cánh đồng (21 mẫu riêng biệt hạt thân) từ ngô 59122 ngô đối chứng Các mẫu xử lý phân tích thành phần đo hạt (nguyên tố, axit béo, axit amin, khoáng chất, vitamin, chất trao đổi thứ cấp chất kháng dinh dưỡng) thân (ngun tố khống chất) Các phân tích chọn để đánh giá thành phần hướng dẫn khuyến cáo thông tin văn kiện trí OECD xem xét thành phần giống ngơ (OECD, 2002a) Phân tích hạt ngô bao gồm sản phẩm chế biến từ hạt sử dụng làm thực phảm thức ăn chăn ni; phân tích thức ăn tươi ngơ bao gồm sử dụng thân xử lý ủ xilô Thông tin chi tiết liên quan đến vật liệu phương pháp sử dụng để phân tích thành phần dinh dưỡng trình bày Phụ lục I Phân tích liệu thống kê thành phần dinh dưỡng để đánh giá khác biệt giá trị trung bình đối ngơ 59122 so với ngơ đối chứng Phân tích thống kê sử dụng mơ hình kết hợp tuyến tính phân tích riêng biệt đối chiếu với kết dương sai tất phân tích cách sử dụng phương pháp tỷ lệ phát sai (FDR) (Benjamini and Hochberg, 1995; Westfall et al., 1999) Tổng cộng có 66 phân tích (10 phân tích từ thân 56 phân tích từ hạt) sử dụng đánh giá thành phần dinh dưỡng Tổng cộng 63 phân tích thống kê phân tích mơ hình hỗn hợp tuyến tính Khơng có thống kê phân tích thực vitamin B2, β-tocopherol furfural hạt tất giá trị mẫu nằm ngưỡng LLOQ Khơng có chênh lệch có ý nghĩa thống kê ngơ 59122 ngô đối chứng 62 số 63 phân tích địa điểm Đối với nguyên tố P thân lá, quan sát chênh lệch có ý nghĩa thống kê địa điểm ngô 59122 ngô đối chứng Tất giá trị mẫu P thân ngô 59122 nằm khoảng biên độ, điều cho thấy ngơ 59122 nằm khoảng biến thiên thông thường, chênh lệch thống kê khơng có nghĩa liên quan sinh học Nhìn chung, kết đánh giá thành phần chứng minh thành phần dinh dưỡng hạt ngô 59122 tương đương với ngô chưa bị biến đổi gen ngơ 59122 an tồn có giá trị dinh dưỡng ngô chưa bị biến đổi gen để sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi (Pauli et al., 2015b) Đán iá ả chuyển hóa thành phần in ưỡn đặc biệt chất m i sản phẩm biểu gen chuyển nế s d ng làm thực phẩ TĂC Đánh giá tương đương thành phần sản phẩm biến đổi gen so với sản phẩm không biến đổi gen, với lịch sử sử dụng an toàn làm thực phẩm TĂCN phần quan trọng chứng sử dụng để khẳng định tính an tồn sản phẩm trồng chuyển gen (Codex Alimentarius Commission, 2008; OECD, 1993) Các so sánh thành phần tiến hành mô tả chi tiết mục V.1 (Pauli et al., 2015b) ngô kiện DAS-59122-7 ngô đối chứng cho kết ngơ kiện DAS-59122-7 có tính an tồn có dinh dưỡng tương đương với giống ngơ truyền thống, hồn tồn sử dụng cho mục đích thay mà khơng có nhiều nguy ảnh hưởng tiêu cực sức khỏe người, vật nuôi Trên sở hiểu biết chế hoạt động gen đích kiện, dự đốn protein có đặc tính kháng trùng kháng thuốc diệt cỏ không làm thay đổi thành phần ngơ Đán iá ả n n độc tính củ p o ein C y34Ab1 C y35Ab1 PAT cấy vào s d ng làm thực phẩ TĂC Độc tính tiềm tàng protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT đánh giá cách sử dụng hàng loạt nghiên cứu bao gồm cách sử dụng phân tích độc tính cấp tính đườn miệng, phân tích in silico, phân tích tính bền nhiệt Các kết nghiên cứu chứng minh protein khơng phải độc tố Tính tương đương protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT có nguồn gốc từ ngô 59122 hệ thống vi sinh vật Để có đủ lượng protein tinh khiết cho nghiên cứu cần thiết để đánh giá tính an toàn chúng, protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 tạo Pseudomonas fluorescens protein PAT tạo Escherichia coli Sự tương đương đặc điểm sinh hóa hoạt tính sinh học protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT có nguồn gốc từ vi khuẩn protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT biểu ngô 59122 mô tả cách sử dụng phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) kỹ thuật phân tích western blot Các kết SDS-PAGE phân tích western blot protein Cry34Ab1 biểu mô ngô 59122 Pseudomonas fluorescens Như dự đoán, protein Cry34Ab1 phát nhóm đơn xấp xỉ 14 kDa tương đồng với nhóm protein Cry34A1 đơn xấp xỉ 14kDa từ vi sinh vật (Schafer et al., 2003; Figure 4b.2) Không có protein miễn dịch phát mơ đối chứng âm Protein Cry35Ab1 phát SDS-PAGE phân tích western blot ngơ 59122 tồn hai nhóm, nhóm 44-kDa nhóm xấp xỉ 40 kDa, gọi chung “doublet” Nghiên cứu Gao et al (2000) protein Cry35Ab1 ban đầu biểu protein đầy đủ chiều dài 44 kDa protein sau tách tạo thành đoạn bị cắt ngắn 40 kDa Như biết, nội độc tố Bt nhạy cảm với protease tách ra, q trình tạo dạng bị cắt ngắn protein (Schnepf et al., 1998) Phân tích trình tự axit amin đầu N protein Cry35Ab1 nguyên cắt ngắn loại bỏ khỏi mô ngô hai có trình tự đầu N tương tự, điều cho thấy trình cắt ngắn xảy đầu C (Gao et al., 2000) Do vậy, doublet tạo từ việc cắt đầu C protease ngơ biểu protein Cry35Ab1 Phân tích protein vi khuẩn PAT SDS-PAGE chứng minh protein có mẫu, tạo nhóm với khối lượng phân tử mong đợi xấp xỉ 21 kDA (Hình 4b.4; Schafer Collins, 2003; Korjagin 2000; (OECD, 1999a) Ngoài ra, protein PAT có nguồn gốc từ vi khuẩn tất năm chiết xuất mô ngô 59122 dấu hiệu dương tính phân tích westn blot Dấu hiệu phản ứng miễn dịch chiết xuất tương tự Ngồi ra, khơng quan sát thấy protein miễn dịch mẫu đối chứng khơng quan sát thấy protein kích cỡ tương tự Đánh giá độc tính cấp đường miệng protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT Các nghiên cứu độc tính cấp đường miệng thực với protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT chuột Protein Cry34Ab1 đánh giá độc tính cấp đường miệng liều lượng thử nghiệm 5.000 mg Cry34Ab1/mỗi kg thể trọng (giá trị quy đổi protein tinh 54% tinh khiết; (54% pure; Brooks and DeWildt, 2000a) liều lượng sử dụng 2.700 mg protein Cry34Ab1 kg thể trọng Trong thời gian quan sát tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hành vi bệnh học thể trọng thể thực suốt thời gian nghiên cứu Các kết cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong q trình nghiên cứu Ngồi ra, khơng quan sát thấy có biểu lâm sàng tiêu cực nghiên cứu không ghi nhận chứng bất lợi lưu ý từ giải phẫu Vơi liều lượng tương đối cao thử nghiệm nghiên cứu hồn tồn khơng gây nên vấn đề độc tính khơng thể xác định LD50 cấp tính protein Cry34Ab1 chuột ngồi việc ước tính giá trị cao 2.700 mg Cry34Ab1/ kg thể trọng (Brooks and DeWildt, 2000a) Protein Cry35Ab1 đánh giá độc tính cấp đường miệng liều lượng thử nghiệm 5.000 mg /mỗi kg thể trọng (Brooks and DeWildt, 2000b), liều lượng sử dụng 1.850 mg protein Cry35Ab1/mỗi kg thể trọng Trong thời gian quan sát tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hành vi bệnh học thể trọng thể thực suốt thời gian nghiên cứu Các kết cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong q trình nghiên cứu Ngồi ra, khơng quan sát thấy có biểu lâm sàng tiêu cực nghiên cứu không ghi nhận chứng bất lợi lưu ý từ giải phẫu Vơi liều lượng tương đối cao thử nghiệm nghiên cứu hồn tồn khơng gây nên vấn đề độc tính khơng thể xác định LD50 cấp tính protein Cry34Ab1 chuột ngồi việc ước tính giá trị cao 1.850 mg Cry35Ab/ kg thể trọng Hỗn hợp protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 đánh giá độc tính cấp đường miệng chuột liều lượng thử nghiệm 5.000 mg /mỗi kg thể trọng (giá trị quy đổi protein tinh 54% tinh khiết protein Cry34Ab1 37% tinh khiết protein Cry35Ab1; (Brooks and DeWildt, 2000c), hỗn hợp gồm 482 mg protein Cry34Ab1/ kg thể trọng 1.520 mg protein Cry35Ab1/ kg thể trọng Trong thời gian quan sát tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hành vi bệnh học thể trọng thể thực suốt thời gian nghiên cứu Các kết cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong q trình nghiên cứu Ngồi ra, khơng quan sát thấy có biểu lâm sàng tiêu cực nghiên cứu không ghi nhận chứng bất lợi lưu ý từ giải phẫu Với liều lượng tương đối cao thử nghiệm nghiên cứu hồn tồn khơng gây nên vấn đề độc tính Do đó, khơng thể xác định LD50 cấp tính đường miệng hỗn hợp protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 chuột ước tính cao 2.000 mg/kg thể trọng hỗn hợp đẳng phân tử protein Cry34Ab1 Cry35Ab1(Brooks and DeWildt, 2000c) Protein PAT đánh giá độc tính cấp đường miệng liều lượng thử nghiệm 6.000 mg/ kg thể trọng (giá trị quy đổi protein tinh 84% tinh khiết; (Brooks, 2000), liều lượng 5.000 mg protein PAT/ kg thể trọng Trong thời gian quan sát tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hành vi bệnh học thể trọng thể thực suốt thời gian nghiên cứu Các kết cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong q trình nghiên cứu Ngồi ra, khơng quan sát thấy có biểu lâm sàng tiêu cực nghiên cứu không ghi nhận chứng bất lợi lưu ý từ giải phẫu Vơi liều lượng tương đối cao thử nghiệm nghiên cứu hồn tồn khơng gây nên vấn đề độc tính Do đó, khơng thể xác định LD50 cấp tính đường miệng protein PAT chuột ước tính hàm lượng cao 5.000 mg PAT/ trọng lượng thể Tóm lại, protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT khơng có độc tính cấp chuột (Hérouet et al., 2005; Juberg et al., 2009; US-EPA, 2010) Thông tin chi tiết liên quan đến vật liệu phương pháp sử dụng để phân tích độc tính cấp đường miệng trình bày Ph l c D Đánh giá độc tính in silico (tin sinh học) protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT ngô 59122 So sánh sàng lọc với protein tiềm ẩn độc tính tiêu chí quan trọng sử dụng tìm kiếm chứng chứng minh tính an tồn protein đích sản phẩm trồng chuyển gen (Codex Alimentarius Commission, 2003) Độc tính tiềm tàng protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT thực cách so sánh trình tự chuỗi protein với chuỗi biết sở liệu Ngân hàng liệu protein sử dụng thuộc Viện Thông Tin Công Nghệ Sinh Học Quốc Gia (National Institute for Biotechnology Information, NCBI) (cập nhật tới ngày tháng 1, 2014) (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/) Đối với protein (Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT), tiến hành tìm kiếm so sánh sử dụng công cụ phần mềm tìm kiếm so sánh chuỗi BLASTP (phiên 2.2.25) để đưa kết số lượng chuỗi mức độ tương đồng protein đích protein sở liệu Chương trình BLASTP sử dụng với thiết lập ban đầu tham số mặc định, ngoại trừ việc đặt ngưỡng giá trị E 1.0, thể tính thận trọng cao phép tìm kiếm so sánh (Pearson, 2000) Các kết chuỗi có trình tự tương đồng kiểm tra thủ công để kiểm chứng lại mối nguy gây độc có (Baxevanis, 2005; Pearson and Lipman, 1988) Kết tìm kiếm so sánh cho thấy khơng phát có tương đồng đáng kể trình tự chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT với protein gây độc xác định hay trình tự đoạn độc tiềm ẩn (ngoại trừ kết tương đồng trình tự chuỗi protein Cry1F đích với trình tự protein Cry dự kiến), chứng tỏ khơng có nguy rõ ràng tính độc protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT (Chang and Mirksy, 2014; Mirsky, 2014) Phân tích tính bền nhiệt protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT Sự ngừng hoạt động protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 tác động nhiệt kiểm chứng hoạt tính sinh học, chẳng hạn độc tính với sâu đục rễ southern corn rootworm (Diabrotica undecimpunctata howardi) sau phơi nhiễm với xử lý nhiệt Trong nghiên cứu (Herman, 2000) công thức ngậm nước Bt protein tinh thể trừ sâu (ICP) Cry34/35Ab1 ủ nhiệt độ 60, 75, 90oC 30 phút Sau ủ, southern corn rootworm non dạng ấu trùng phơi nhiễm với chất ăn thô nhân tạo xử lý với mẫu ủ ICP Sự tử vong trọng lượng côn trùng đo sau ngày ức chế sinh trưởng tính dựa so sánh với đối chứng âm Các kết ICP bị hoạt tính sau phơi nhiễm với nhiệt độ Nghiên cứu thứ hai (Herman, 2002) thực để kiểm chứng không ổn định nhiệt protein thành phần (Cry34Ab1 Cry35Ab1) cách tăng cường mẫu gia nhiệt ICP với mẫu không gia nhiệt protein thành phần Điều cho phép xác định khơng ổn định nhiệt protein bổ sung hai protein cần thiết để có đặc hiệu tối đa với sâu đục rễ ngô (Herman and Hunst, 2002) Dựa tổn thất đáng kể hoạt tính ICP có khơng có Cry35Ab1 không gia nhiệt nhiệt độ 60, 75 90 oC, Cry35Ab1 ICP chứng minh không ổn định nhiệt đáng kể Protein Cry34Ab1 cho thấy không ổn định nhiệt tương tự nghiên cứu này; nhiên, số chất dư Cry34Ab1 âm nhận thấy 60 75 oC Hoạt tính phân biệt với tác động sau phơi nhiễm với 90 oC, điều có khơng ổn định nhiệt đáng kể protein Cry34Ab1 Protein PAT thử nghiệm tính ổn định nhiệt độ 60, 75 90 °C khoảng thời gian 10, 30 60 phút (Hérouet et al., 2005) Các protein tạo thành phân tích SDS-PAGE Protein PAT phát SDS-PAGE, chẳng hạn, khơng có suy giảm protein tất nhiệt độ thời điểm thử nghiệm Những kết chứng minh kết mà Wehrmann et al (1996) thu cho thấy protein PAT hoàn tồn khơng cịn hoạt tính tác động nhiệt sau 10 phút 50 °C nhiệt độ cao bất chấp thực tế protein không bị suy giảm Các kết từ đánh giá tính khơng ổn định nhiệt chứng minh protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT không ổn định nhiệt độ cao protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT bị hoạt tính nhiều quy trình liên quan đến chế biến thực phẩm thức ăn chăn nuôi (Herman, 2000; Herman, 2002; Hérouet et al., 2005) Đán iá ả n n ây ứng chất m i sản phẩm biểu gen chuyển nế s d ng làm thực phẩm, thứ n nn i Khả gây dị ứng protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT đánh giá cách sử dụng hàng loạt nghiên cứu bao gồm phân tích in silico (tin sinh học), tính dễ bị tiêu hóa, phân tích glycosyl hóa Các kết nghiên cứu chứng minh protein chất gây dị ứng Đánh giá in silico khả gây dị ứng protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT ngô 59122 So sánh sàng lọc với protein tiềm ẩn nguy gây dị ứng cách thức quan trọng sử dụng tìm kiếm chứng chứng minh tính an tồn protein đích sản phẩm trồng chuyển gen (Codex Alimentarius Commission, 2003) Đánh giá nguy gây dị ứng protein Cry1F PAT thực cách so sánh trình tự chuỗi protein với chuỗi tác nhân gây dị ứng biết với chuỗi tiềm ẩn nguy gây dị ứng sở liệu (Chang and Mirksy, 2014; Krauss, 2014b; Krauss, 2014a) Đối với protein (Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT), bước tìm kiếm so sánh tiến hành theo hướng dẫn đánh giá khả gây dị ứng hành (Codex Alimentarius Commission, 2003; FAO/WHO, 2001) bao gồm (1) Mức tương đồng trình tự chuỗi protein đích với trình tự chuỗi tác nhân gây dị ứng tối thiểu phải 35% chiều dài chuỗi tìm phải lớn 80 a.a; (2) có giống hồn tồn axit amin liên tục trình tự chuỗi protein đích chuỗi tác nhân gây dị ứng Sử dụng chương trình tìm kiếm so sánh FASTA v35.4.4 với thiết lập tham số mặc định Phép tìm kiếm kết khớp xác trình tự axít amin tiến cách sử dụng phần mềm công ty DuPont Pioneer phát triển, cho phép tìm tất các đoạn chứa axít amin hồn tồn giống protein đích tác nhân gây dị ứng cho phép so sánh trình tự chuỗi protein đích với tồn chuỗi tác nhân gây dị ứng có sở liệu Kết so sánh trình tự chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT với trình tự chất gây dị ứng AllergenOnline v14 khơng cho thấy có liên kết vượt q ngưỡng khơng tìm thấy đoạn polypeptide chứa đầy đủ trình tự a.a trùng hợp với trình tự chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 hay PAT Do vậy, kết luận protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT sản phẩm biểu gen đích khơng có khả hay nguy gây dị ứng sử dụng làm thực phẩm, TĂCN (Chang and Mirksy, 2014; Krauss, 2014b; Krauss, 2014a) Sự phân giải protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT phản ứng mô dịch dày Khả tiêu hóa protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 nghiên cứu thơng qua thí nghiệm phản ứng mô dịch dày (SGF) (Herman et al., 2003) Protein Cry34Ab1 đánh giá cách cho ủ nhiệt với dịch dày mô SGF khoảng thời gian định sau phân tích SDS-PAGE (Brussock Currier, 1990) phân tích lai Western blot Lý thuyết enzim cổ điển phát biểu enzim (chẳng hạn: pepsin) tồn nồng độ cao đáng kể so với chất (chẳng hạn: protein Cry34Ab1), thoái biến dự đoán thể mơ hình bậc ước tính thời điểm phân hủy giá trị DT90 (thời gian tiêu hóa 90%) (Rawn, 1989) Như dự đốn, liệu thực nghiệm thu từ thí nghiệm SGF, Cry34Ab1 có khả tái sinh sản cao Không quan sát thấy đoạn cắt Cry34Ab1 SGF thu giá trị DT90 nhỏ phút protein Cry34Ab1 SGF Phân tích Glycosyl hóa Các protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 Glycosyl hóa protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 biểu ngô 59122 xác định cách sử dụng phương pháp nhuộm glycoprotein (Schafer, et al., 2003) Các mẫu protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 có nguồn gốc từ ngô 59122, đối chứng dương (horseradish peroxidase) đối chứng âm (chất ức chế trypsin đậu nành) phân tách SDS-PAGE Gel sau nhuộm Bộ GelCode Glycoprotein để phát glycoprotein Như minh họa Hình 4d.6, kết phân tích glycosyl hóa khơng phát dấu hiệu chứng tỏ protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 có nguồn gốc từ ngơ 59122 khơng bị glycosyl hố Những kết khớp với kết từ nghiên cứu (Gao et al, 2000) khơng phát glycosyl hóa protein Cry34Ab1 Cry35Ab1 có nguồn gốc từ ngơ 59122 Pseudomonas fluorescens Protein PAT Glycosyl hóa protein PAT biểu ngô 59122 xác định cách sử dụng Bộ Glyco-Profile III (Hérouet et al., 2005) Các protein PAT có nguồn gốc từ Escherichia coli thực vật đối chứng dương âm phân tách SDS-PAGE Gel sau nhuộm Bộ Glyco-Profile III để quan sát glycoprotein Chỉ protein tiêu chuẩn glycosyl hóa (α´1-acidic glycoprotein avidin) cho dấu hiệu rõ ràng với chất nhuộm màu glycoprotein Khơng phát glycosyl hóa protein PAT Các kết từ thí nghiệm nhuộm glycoprotein chứng minh protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT không bị glycosyl hóa (Hérouet et al., 2005; Schafer et al., 2003) Đán iá ả n n á động bất lợi ìn n ợp chất m i, khả n n ây bệnh đến sức khoẻ on n i vật ni Qua phân tích đánh giá, phân tích thành phần chứng minh hạt ngơ kiện 59122 giầu dinh dưỡng có thành phần hàm lượng chất tương đương với ngô hạt (giống nền) truyền thống khơng chuyển gen; Khơng có hay chứng thể có chất sản phẩm kết hợp gen cry34Ab1, cry35Ab1 pat ngô kiện 59122 Kết từ nghiên cứu độc tính cấp chuột sử dụng thức ăn trộn protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT chứng minh protein khơng có nguy gây độc người hay lồi động vật có mạch (Brooks, 2000; Kuhn, 1998; Shanahan, 1999); Khơng có tương đồng hay trùng lặp trình tự chuỗi axít amin protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT so với chất gây độc, hay chất gây dị ứng biết tới Do vậy, kết luận protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 PAT, sản phẩm biểu gen cry34Ab1, cry35Ab1 pat chuyển nạp vào ngơ kiện 59122, khơng có khả hay nguy gây bệnh hay tác động bất lợi khác, có, sức khỏe người, vật nuôi sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi VI ĐỀ XUẤT CÁC BIỆN PHÁP QUẢN LÝ RỦI RO TIỀM ẨN CỦA THỰC VẬT BIẾ ĐỔI GE ĐỐI VỚI SỨC KHỎE CO GƯỜI, VẬT NI Phân tích đặc điểm ngơ 59122 rủi ro tác động tiêu cực tiềm ẩn sức khỏe người vật nuôi từ việc sử dụng ngô 59122 làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi thấp không cần phải có chiến lược cụ thể quản lý rủi ro Khuyến cáo quản lý ngô 59122 không khác với ngô truyền thống, chưa biến đổi gen sau phê duyệt sử dụng làm thương phẩm Công ty TNHH Pioneer Hi-Bred Việt Nam cam kết tuân thủ đầy đủ quy định Thông tư số 02/2014/TT-BNNPTNT ngày 24/01/2014 Bộ Nông nghiệp PTNT quy định hành khác an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen, quy định sản xuất, kinh doanh sản phẩm Việt Nam Công ty cam kết thực đầy đủ yêu cầu xây dựng kế hoạch quản lý nhận yêu cầu từ quan quản lý Việt Nam tất các sản phẩm chuyển gen kiểm sốt trùng cơng ty, bao gồm kiện 59122, sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Cụ thể: - Định kỳ hàng năm báo cáo cập nhật thông tin cấp phép mới, hạn hay thu hồi cấp phép sử dụng kiện 59122 quốc gia giới, gửi Bộ Nông nghiệp PTNT - Báo cáo Bộ Nông nghiệp PTNT cập nhật thông tin khoa học, kỹ thuật liên quan tới rủi ro hay tính khơng an tồn, có, sử dụng kiện 59122 làm thực phẩm, TĂCN - Tuân thủ thực thi đầy đủ yêu cầu pháp luật quy định hành Việt Nam an toàn sinh học, quản lý rủi ro sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen - Báo cáo Bộ Nông nghiệp PTNT phát sinh vấn đề liên quan đến an tồn sức khỏe người, vật ni sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ ngơ kiện 59122 phối hợp xử lý VII KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Ngô 59122 phát triển cách sử dụng trình chuyển nạp gen gián tiếp Agrobacterium, tạo sản phẩm chống lại số loài sâu hại bọ cánh cứng kháng glufosinate Các sinh vật cho gen cung cấp gen sử dụng để tạo ngô 59122 có lịch sử sử dụng an tồn làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Ngô truyền thống ngơ 59122 có lịch sử sử dụng an tồn ngơ 59122 quan quản lý phủ cấp phép 13 nước khác Đề ngh : Trên sở số liệu, phân tích kết luận hồ sơ này, công ty TNHH Pioneer Hi-Bred Việt Nam kính đề nghị Bộ Nơng nghiệp PTNT thẩm định, phê duyệt cấp “Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi” kiện DAS-59122-7 Tổ đ n Tp Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 12 năm 2015 : C n y T HH Pionee Hi-Bred Vietnam