Bài viết nghiên cứu phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria) từ chất thải ở trại chăn nuôi bằng kỹ thuật PCR nhằm ứng dụng các dòng vi khuẩn này trong xử lý chất thải ở trại chăn nuôi. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của bài viết này.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN KHỬ ĐẠM (DENITRIFYING BACTERIA) TỪ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI Nguyễn Thành Nhân* Trường Đại học Tiền Giang * Tác giả liên hệ: nguyenthanhnhan@tgu.edu.vn TĨM TẮT 30 dịng vi khuẩn khử đạm phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo huyện Châu Thành Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang xác định 21 dòng vi khuẩn tổng số 30 dòng vi khuẩn kỹ thuật PCR 16S-rDNA với cặp mồi tổng xác định 17 dòng/21 dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri với cặp mồi đặc hiệu Tiến hành giải trình tự dịng vi khuẩn 17 dòng vi khuẩn so sánh với ngân hàng liệu phần mềm BLASTN cho thấy dòng vi khuẩn có mức độ đồng hình 99% với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri chuẩn từ phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường Từ khóa: Chất thải trại chăn ni heo, vi khuẩn khử đạm, PCR, giải trình tự, Pseudomonas stutzeri DETERMINATION AND IDENTIFICATION OF A NUMBER OF (DENITRIFYING BACTERIA) FROM FARMING WASTE Nguyen Thanh Nhan* Tien Giang University *Corresponding Author: nguyenthanhnhan@tgu.edu.vn ABSTRACT Thirty denitrifying bacteria isolates were isolated from piggery farms wastes in Chau Thanh and Cho Gao district, Tien Giang province Among 30 isolates, 21 isolates were identified with PCR 16S-rDNA technique with universal primers, and 17/21 isolates as Pseudomonas stutzeri with specific primers 3/17 isolates were sequenced and compared with genebank data by BLAST N software, the result showed that three isolates have 99% homology with standard Pseudomonas stutzeri Keywords: Piggery wastes, denitrifying bacteria, PCR, sequencing, Pseudomonas stutzeri TỔNG QUAN Tốc độ cơng nghiệp hóa thị hóa nhanh với gia tăng dân số gây áp lực ngày nặng nề tài nguyên nước vùng lãnh thổ Môi trường nước nhiều đô thị, khu công nghiệp làng nghề ngày bị ô nhiễm nước thải, khí thải chất thải rắn, số BOD5, oxy hoà tan, chất ammonium, nitrite, nitrate mức báo động Trong ô nhiễm nitrate ưu tư lớn Nitrate nguồn nước nguy ảnh hưởng đến sức khoẻ người thú vật, trẻ sáu tháng, mối nguy lớn cho ngành chăn nuôi thủy sản Nhiều nghiên cứu cho thấy số dịng vi khuẩn tham gia chu trình nitơ (đặc biệt vi khuẩn có mang gen mã hóa enzyme nitrite reductase- nirK & nirS enzyme nitrous oxide reductase-nosZ) có khả khử đạm nước thải phân súc vật, giúp giảm lượng nitrate, ammonium gây mùi làm nhiễm nguồn nước.Vì việc nghiên cứu phân lập nhận diện số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria) từ chất thải trại chăn nuôi kỹ thuật PCR nhằm ứng dụng dòng vi khuẩn xử lý chất thải trại chăn nuôi PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện mẫu nghiên cứu Cân điện tử, tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, tủ lạnh giữ mẫu, ống tube dùng để chạy PCR, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, lam, lamen, bịch nylon chai đựng mẫu bùn mẫu nước Mẫu chất thải rắn lỏng thu từ trại chăn nuôi heo huyện Chợ Gạo Châu Thành, tỉnh Tiền Giang 123 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Phương pháp nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Nhận diện vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phương pháp PCR Kiểm tra khả khử Nitrate, Nitrite oxid hóa Ammonium dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Giải trình tự DNA vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập STT Dòng Đặc điểm vi Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn Hình Chuyển Màu sắc Hình Dạng bìa Độ dạng động dạng 1RA 1RB 1RC 2RB 2NA 3NA 3NC 4RA 4RB 10 4RC 11 5RA 12 5NA 13 6NB 14 6RC 15 7RA 16 7RC 17 7RD 18 7RE 19 8NA 20 8NB Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ Trắng sữa Trịn Bìa ngun Mơ Kích thước (mm) 0,6 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,2 ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 + Vàng Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng, trịn Trịn Bìa ngun Mơ 0,4 ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,4 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng đục Trắng đục Bìa cưa Bìa ngun Mơ ++ Khơng Trịn Mơ ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,4 ++ Vàng nhạt 0,8 Trắng đục Bìa cưa Bìa ngun Lài ++ Khơng Trịn Lài 0,8 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng sữa Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,6 ++ Trắng đục Trịn Lài 0,8 ++ Trắng đục Trịn Bìa cưa Bìa ngun Mô 0,8 124 Kỷ yếu Hội nghị khoa học 21 9RA 22 9NB 23 9NC 24 10RA 25 10RB 26 10RD 27 10NA 28 10NB 29 10NC 30 10ND Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,4 ++ Trắng đục Trịn Lài 0,8 ++ Trắng đục Trịn Bìa cưa Bìa ngun Mơ ++ Vàng Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 + Trắng sữa Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 ++ Vàng nhạt Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 ++ Trắng đục Trịn Bìa ngun Lài 0,8 + Trắng đục Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 ++ Trắng sữa Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 ++ Trắng sữa Trịn Bìa ngun Mơ 0,8 Ghi chú: (+): Vi khuẩn chuyển động chậm; (++): Vi khuẩn chuyển động nhanh Từ 30 dòng vi khuẩn phân lập tiến hành quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc với kết hầu hết khuẩn lạc màu trắng đục, trắng sữa hay vàng, bề mặt khuẩn lạc mơ trơn, số có dạng lài, bìa ngun hay cưa, kích thước khoảng 0,2÷1mm Về đặc điểm vi khuẩn cho thấy tất dòng vi khuẩn có dạng que ngắn có khả chuyển động mơi trường lỏng nhờ tế bào có chiên mao.Trong vi khuẩn chuyển động nhanh chiếm đa số với 27/30 dòng, chiếm tỷ lệ 90%, vi khuẩn chuyển động chậm có 3/30 dịng, chiếm tỷ lệ 10% Kết phù hợp với mô tả Han-Woong Lee et al.(2002) Lalucat et al., (2006) Về đặc điểm khuẩn lạc tổng số 30 dịng vi khuẩn phân lập có 21/30 dịng vi khuẩn có màu trắng sữa hay trắng đục chiếm tỷ lệ 70% có 9/30 dịng có màu vàng hay vàng nhạt chiếm tỷ lệ 30% Về hình dạng bìa khuẩn lạc: Kết phân lập cho thấy có 26/30 dịng vi khuẩn có dạng bìa ngun chiếm tỷ lệ 86,67% có 4/30 dịng vi khuẩn có dạng bìa cưa chiếm tỷ lệ 13,33% Chọn dòng vi khuẩn chụp hình kính hiển vi điện tử qt ta nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que có chiên mao đỉnh Kết phù hợp với mô tả Lalucat et al., (2006) Nhận diện vi khuẩn Pseudomonas stutzeri kỹ thuật PCR Khi phân tích PCR với cặp primer tổng 16f27; 16r1488 để nhận diện dịng vi khuẩn Pseudomonas (Hình 1) Kết nhận thấy có 21/30 dịng vi khuẩn phân lập có band vị trí 1500bp dịng Pseudomonas phù hợp với band vi khuẩn đối chứng dương Pseudomonas stutzeri ATTC 14405 21 dòng Pseudomonas là: 1RB, 1RC, 2NA, 2RB, 3NA, 3NC, 4RC, 5NA, 5RA, 6NB, 6RC, 7RA, 7RC, 7RD, 7RE, 9RA, 9NB, 8NB, 10RD, 10NA, 10NB 125 Hình Phổ điện di DNA dịng vi khuẩn Pseudomonas Kỷ yếu Hội nghị khoa học Chú thích: 1: Thang chuẩn 100bp plus 2: ATCC 14405 20: 5N 4: 3NC 22: 6RC 6: 4RC 23: 6NB 7: 2RB 24: 7RE 9: 1RB 25: 7RD 10: 7RA 26: 2NA 11: 1RC 27: 9RA 12: 7RC 29: 9NB 15: 3NA 30: 8NB 19: 5RA 31: 10RD 32: 10NA 33: 10ND Tiếp tục kiểm tra sản phẩm PCR khuyếch đại với cặp mồi đặc hiệu fps158; rps743 21 dịng vi khuẩn Pseudomonas gel argarose 1,2% (Hình 2) Chú thích: 1: Thang chuẩn 100bp 2: ATCC14405 15: 2NA 3: 6NB 16: 3NA 4: 2RB 17: 3NC 6: 7RA 18: 4RC 8: 5NA 19: 6RC 10: 1RB 20: 1RC 11: 10ND 21: 7RE 13: 8NB 22: 7RD 14: 10NA 23: 5RA Kiểm tra khả khử Nitrate, Nitrite oxid hóa Ammonium dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Kết kiểm tra cho thấy 17/17 dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập có khả oxid hóa ammonium, chiếm tỷ lệ 100% Trong có dòng là: 6RC, 7RA, 7RD, 10ND, 10NA, 8NB có khả oxid hóa ammonium mạnh, dịng gồm: 4RC, 1RB, 5NA, 5RA, 6NB, 2NA có khả oxid hóa ammonium trung bình, cịn lại dịng là: 3NC, 1RC, 2RB, 7RE, 3NA có khả oxid hóa ammonium yếu (Bảng 2) Hình Phổ điện di DNA dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Bảng Kết kiểm tra phát triển dòng vi khuẩn môi trường Môi Nitrite Nitrate Ammonium STT trường Dòng Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 3NC + + + + + ++ 4RC ++ ++ ++ ++ − − 1RC − + + + − + 1RB ++ ++ ++ ++ + + 2RB − + + + − + 5NA + ++ + ++ − − 5RA ++ ++ ++ ++ ++ ++ 6NB − + + ++ + + 6RC +++ +++ +++ +++ ++ +++ 10 7RA + ++ +++ +++ + ++ 11 7RD + ++ + +++ + ++ 12 7RE + + + + + ++ 13 10ND + + +++ +++ + + 14 2NA + + + ++ − + 15 3NA − + + + − + 16 10NA + ++ ++ +++ + ++ 17 8NB + + ++ +++ − − Chú thích: ( - ): khơng phát triển; ( ++): phát triển trung bình; ( +): phát triển yếu (+++): phát triển mạnh 126 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Tiến hành đo nồng độ DNA dòng vi độ DNA tốt (Bảng 3) khuẩn 6RC, 7RA 10NA với kết nồng Bảng Kết nồng độ DNA dịng vi khuẩn giải trình tự STT Tên dòng Độ hấp thụ 260nm Độ hấp thụ 280nm 260nm/280nm 6RC 0,1518 0,0823 1,8445 7RA 0,1353 0,0735 1,8408 10NA 0,1485 0,0785 1,8917 Kết giải trình tự máy ABI 3130 dòng vi khuẩn 6RC, 7RA 10NA trình bày bảng 6, 8, 10 sử dụng phần mềm BLASTN để so sánh trình tự dịng vi khuẩn với trình tự vi khuẩn ngân hàng gen (EMBL Nucleotide Sequence database) cho thấy dòng 6RC, 7RA 10NA có mức độ đồng hình với dòng Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 99% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Phân lập 30 dòng vi khuẩn từ nhóm mẫu chất thải rắn lỏng thu từ trại chăn nuôi heo huyện Châu Thành Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang Các dòng vi khuẩn có đặc điểm như: hình que, màu trắng đục, trắng sữa hay màu vàng, bề mặt khuẩn lạc mô trơn hay có dạng lài Phân tích PCR với cặp mồi tổng nhận diện 21/30 dòng vi khuẩn Pseudomonas có 17 dịng Pseudomonas stutzeri phân tích với cặp mồi đặc hiệu Các dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả khử đạm, chọn dòng 6RC, 7RA 10NA để tiến hành giải trình tự Kết quả, dịng có mức độ đồng hình với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 chuẩn 99% Đối với dòng vi khuẩn nhận diện cần phải tiếp tục kiểm tra khả khử đạm, thí nghiệm xử lý nguồn nhiễm amonium Đặc biệt xử lý ô nhiểm chất thải trại chăn nuôi heo Tiếp tục phân lập nhận diện dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả khử đạm hiệu hơn, phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Ngọc Điệp ,Nguyễn Hữu Hiệp, (2002), Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Dương Tấn Lộc (2006) Để thị trường cá tra bền vững Tạp chí khoa học Cần Thơ.16 (2): tr.20 - 23 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002) Sinh học phân tử (tái lần 2) NXB Giáo dục.Chương 14 Nguyễn Đức Lượng Công nghệ vi sinh vật tập Cơ sở vi sinh vật công nghiệp.NXB Đại quốc gia TPHCM Nguyễn Văn Cách.(2005) Tin sinh học NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2005) Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng NXB Nông Nghiệp TPHCM Nguyễn Trần Hải Bằng.(2008), Nhận diện gen nosZ, cd1- nir vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học Baggi, G., P Barbieri, E Galli, and S Tollari (1987), “Isolation of a Pseudomonas stutzeri strain that degrades oxylene”, Appl Environ.Microbiol., 53(9),pp.2129- 3132 Bennasar, A., R Rosselló- Mora, J Lalucat and E R B Moore (1996), “16S rRNA gene sequence analyses relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of Pseudomonas balearica sp.nov”, Int J Syst Bacteriol., 46(1), pp 200 – 205 127 ... với dòng vi khuẩn nhận diện cần phải tiếp tục kiểm tra khả khử đạm, thí nghiệm xử lý nguồn nhiễm amonium Đặc biệt xử lý ô nhiểm chất thải trại chăn nuôi heo Tiếp tục phân lập nhận diện dịng vi khuẩn. .. cho thấy dòng 6RC, 7RA 10NA có mức độ đồng hình với dòng Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 99% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Phân lập 30 dòng vi khuẩn từ nhóm mẫu chất thải rắn lỏng thu từ trại chăn nuôi heo... stutzeri Giải trình tự DNA vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập STT Dòng Đặc điểm vi Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn Hình Chuyển Màu