Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.Coly DH5α

TỔNG QUAN TÀI LYỆU

Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn

Biến nạp là quá trình mà tế bào vi khuẩn tiếp nhận DNA từ môi trường bên ngoài Hiện tượng này lần đầu tiên được phát hiện trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae bởi Fred Griffiths vào năm 1928, và sau đó được xác nhận lại bởi Avery và cộng sự.

Năm 1944, tại Viện Rockefeller, Griffiths và Avery đã nghiên cứu một chủng vi khuẩn có khả năng tiếp nhận tự nhiên, cho phép chúng hấp thu DNA từ môi trường sống Nguồn DNA này chủ yếu đến từ các tế bào chết hoặc tế bào bị phân hủy Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn đã biểu hiện một hoặc một số tính trạng mới, những tính trạng này không chỉ ổn định mà còn có khả năng di truyền.

Nghiên cứu của Griffiths và Avery cho thấy tế bào vi khuẩn cần ở trạng thái sinh lý đặc biệt, gọi là "trạng thái khả nạp", để có thể hấp thu DNA Trạng thái này tự nhiên xuất hiện ở một số loài vi khuẩn khi nồng độ dinh dưỡng và oxy trong môi trường sống giảm thấp Tuy nhiên, trong thực tế, để nghiên cứu biến nạp, cần phải xử lý tế bào vi khuẩn nhằm tăng cường khả năng hấp thu DNA.

2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen

Biến nạp là hiện tượng cho phép vi khuẩn tiếp nhận các tính trạng mới, từ đó giúp chúng thích nghi tốt hơn với môi trường sống Điều này không chỉ là cơ sở cho tiến hóa mà còn góp phần vào sự đa dạng của vi sinh vật.

Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bước đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp, cho phép chuyển gen từ động vật và cây trồng vào vi khuẩn, tạo ra sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con người Vi sinh vật được sử dụng như nhà máy sinh học, ví dụ như kháng sinh Penicillyn từ nấm Penicillyum và Streptomycin từ vi khuẩn Streptomyces griseus Kỹ thuật tái tổ hợp giúp sản xuất số lượng lớn sản phẩm mong muốn của gen, kết hợp với các phương pháp chiết xuất và tinh sạch Nhiều loại vaccine trong y học và thú y, cũng như giống cây trồng kháng bệnh đã được phát triển nhờ vào công nghệ này, thay thế cho các phương pháp truyền thống.

Biến nạp gen vào vi khuẩn không chỉ hỗ trợ trong việc đọc trình tự gen mà còn giúp kiểm tra đa dạng sinh học và bảo quản sự ổn định của đoạn gen một cách dễ dàng.

Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp

Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ

Khi nồng độ chất dinh dưỡng và oxy trong tự nhiên giảm xuống mức tối thiểu, sự sống của vi khuẩn bị ảnh hưởng, dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và đặc tính sinh lý, sinh hóa của tế bào Màng tế bào bị biến tính, tạo ra các kênh vận chuyển dạng lỏng, cho phép DNA đi vào tế bào thông qua tiếp xúc với màng và được hỗ trợ bởi hệ thống vận chuyển bên trong.

Hệ thống vận chuyển DNA trong tế bào được hình thành nhờ enzym ComC, một peptidase có khả năng biến tính protein ComG của màng tế bào, làm mất tính toàn vẹn của nó Có 7 protein tương tự ComG, tất cả đều tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA, là thể nhận DNA vào tế bào Đồng thời, ComEC tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch, cho phép DNA đi vào tế bào một cách hiệu quả (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).

ComFA là một loại helycase hoạt động cùng với ComEA và ComEC để đưa sợi DNA mạch đơn vào tế bào Trong quá trình này, sợi DNA mạch đôi gắn vào đầu Carboxyl của ComEA và được phân tách thành các đoạn nhỏ nhờ tác động của endonuclease NucA Các đoạn DNA mới cắt này sau đó được chuyển đến ComEC và ComEA để vận chuyển vào trong tế bào.

Phiên mã gen "late competence" chịu trách nhiệm cho việc sản xuất các protein cần thiết cho việc gắn kết và hấp thụ DNA, bao gồm ComC, ComE, ComF và ComG Ngoài ra, các yếu tố tái tổ hợp như recA và addAB cũng cần được kích hoạt thông qua một yếu tố có khả năng kích thích quá trình phiên mã.

ComK là yếu tố quan trọng trong việc kích hoạt sự phiên mã, với sự biểu hiện được điều chỉnh bởi một mạng lưới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB Nghiên cứu của Leendert W Hamoen và cộng sự vào năm 1998 đã chỉ ra rằng ComK nhận diện một vùng trình tự ngắn giàu A/T, được sắp xếp trong một khung đọc đặc trưng dọc theo sợi DNA Phân tích footprinting cho thấy các gốc hydroxyl của ComK bám vào promoter addAB, dẫn đến kết luận rằng ComK tương tác với vùng trình tự giàu A/T AAAAN 5 TTTT.

ComK được điều hòa âm bởi AbrB và CodY, trong khi AbrB, sinR và DegU kích hoạt ComK CodY, một protein gắn GTP nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phiên mã gen liên quan đến sự hình thành bào tử, giúp tế bào thích nghi với điều kiện dinh dưỡng hạn chế Đồng thời, DegU tăng cường sự bám chặt của ComK vào promoter của nó, đảm bảo quá trình phiên mã diễn ra chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp.

Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly

2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo

Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác

Trong phòng thí nghiệm, để nâng cao khả năng biến nạp, tế bào chủ thường được xử lý bằng các phương pháp hóa học hoặc vật lý Sau khi được xử lý, tế bào chủ sẽ được gọi là tế bào khả nạp Tế bào E.coli là một trong những tế bào chủ phổ biến, nhờ vào cấu trúc di truyền đơn giản và thông tin di truyền đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, giúp dễ dàng phát hiện các tế bào mang gen lạ.

E.coly là một vi khuẩn Gram õm, hỡnh que, dài khoảng 2,5àm, cú roi (flagella) và bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen Giống nhƣ tất cả các loài vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal

2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly

Khi có mặt glucose, E.coli phát triển nhanh chóng Tuy nhiên, khi glucose được thay thế bằng lactose (β-galactosid-glucose), sự phát triển của E.coli sẽ ngừng lại, nhưng sau đó chúng có khả năng hồi phục nhờ vào việc tổng hợp ba enzym cần thiết.

Permerase kých thích sự thấm lactose

Acetylase (vai trò chƣa rõ) Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose

Enzym này được tổng hợp chỉ khi cần thiết để giải phóng glucose từ lactose và được cảm ứng bởi lactose Jacobs và Monod (1961) đã giải thích cơ chế cảm ứng này thông qua mô hình hoạt động của operon Lac, một đoạn DNA chứa các gen liên quan đến quá trình này.

Cấu trúc gen lac bao gồm ba thành phần chính: lacZ, mã hóa β-galactosidase; lacY, mã hóa permease; và lacA, mã hóa acetylase Vùng khởi động (promoter - P) là một trình tự nucleotide đánh dấu điểm bắt đầu sao chép cho cả ba gen này Ở giữa promoter và các gen mã hóa enzym có một trình tự nucleotide gọi là vùng hoạt động (operator - O), quyết định việc RNA polymerase có liên kết với promoter hay không, từ đó di chuyển dọc theo các gen (Bùi Trang Việt, 2002).

Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly

Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002

Operon là một nhóm gen có chức năng liên quan, được kiểm soát bởi promoter và operator, chỉ xuất hiện ở procaryote Sự tổ hợp này cho phép các gen liên quan biểu hiện nhanh chóng khi có sự thay đổi môi trường, nhờ vào việc chúng được điều khiển bởi một "nút đóng mở" duy nhất, tức là operator Trước operon lacZ, có gen điều hòa I, mã hóa protein repressor, có vai trò ức chế sự biểu hiện gen Hoạt động của operon Lac được chứng minh qua các nghiên cứu.

When glucose is present and lactose is absent, the regulatory gene I is activated, producing a repressor This repressor recognizes and binds to the operator, preventing the binding of the regulatory gene.

Lac operon là một vùng cấu trúc gen quan trọng, bao gồm gen mã hóa cho enzyme và các yếu tố điều hòa như RNA polymerase và promoter Khi lactose có mặt và glucose vắng mặt, lactose liên kết với repressor, làm thay đổi hình dạng của nó, dẫn đến việc repressor không còn gắn kết với operator, cho phép operon Lac mở RNA polymerase sau đó gắn vào promoter và tiến hành tổng hợp mRNA mã hóa cho ba enzyme khác nhau Trong trường hợp có cả glucose và lactose, E coli ưu tiên sử dụng glucose, dẫn đến hiện tượng "kìm hãm dị hóa" Khi mức glucose giảm, cAMP tăng lên và gắn với protein CAP (catabolite activator protein), tạo thành phức hợp cAMP-CAP Phức hợp này gắn vào promoter, tăng cường khả năng liên kết của RNA polymerase với promoter, từ đó kích thích quá trình phiên mã.

Để duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, E.coli thường được cải tiến bằng cách loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế, nhằm ngăn chặn sự phân giải DNA lạ trong tế bào vi khuẩn Điều này dẫn đến sự thay đổi hoạt tính endonuclease, giúp tăng lượng plasmid tích lũy Thông thường, người ta gây đột biến trên gen endA (endA -), gen mã hóa cho endonuclease I, dẫn đến việc mất endonuclease này, từ đó tăng sản lượng plasmid và cải thiện chất lượng DNA chiết tách theo các phương pháp sinh hóa chuẩn (Bùi Trang Việt, 2002).

2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp

Có hai phương pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp

Phương pháp này áp dụng xung điện để tác động lên tế bào chủ, dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm của màng Một trong những ưu điểm nổi bật của phương pháp này là khả năng thực hiện nhanh chóng, đồng thời tế bào sau khi xử lý có hiệu suất biến nạp cao.

Phương pháp xử lý tế bào bằng hóa chất, có thể kết hợp với nhiệt độ, là một kỹ thuật đơn giản và dễ thực hiện Mặc dù thời gian thực hiện lâu và hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp, nhưng phương pháp này vẫn được ưa chuộng trong nhiều ứng dụng.

Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phương pháp hóa học, người ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau

Thứ nhất, phương pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu quả biến nạp cao (5x10 8 khuẩn lạc/àg plasmid DNA)

Phương pháp Inoue nổi bật với khả năng lặp lại cao hơn so với phương pháp Hanahan, cho phép tạo ra các tế bào khả nạp với hiệu quả biến nạp từ 1x10^8 đến 3x10^8 khuẩn lạc/µg plasmid DNA Trong khi đó, phương pháp Calcium chloride, đã được phát triển hơn 30 năm, tạo ra các tế bào khả nạp với hiệu quả biến nạp từ 5x10^6 đến 2x10^7 khuẩn lạc/µg plasmid DNA Thông thường, quy trình này sử dụng dung dịch muối lạnh của các kim loại hóa trị II như CaCl2, MgCl2 và RbCl2 để xử lý tế bào vi khuẩn.

Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coli đạt hiệu quả cao hơn khi có ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0-4°C), vì ion này làm xáo trộn màng tế bào, giúp DNA dễ dàng xâm nhập vào E.coli Sau đó, giai đoạn sốc nhiệt kích thích sự chuyển DNA vào tế bào, và môi trường dưỡng chất bổ sung cho phép tế bào phục hồi, từ đó DNA tiến hành sao mã và dịch mã để tạo ra các protein tương ứng.

2.3.4 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp

Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, plasmid sẽ tự tái bản và biểu hiện gen kháng kháng sinh, giúp tế bào chủ có khả năng phát triển trong môi trường có chứa kháng sinh.

Khi trải E.coli lên môi trường có chứa kháng sinh, chỉ những tế bào đã nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có khả năng sinh trưởng, trong khi các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không thể phát triển.

Vector, công cụ biến nạp DNA

Vector là vật liệu thiết yếu trong các thí nghiệm chuyển nạp DNA và nhân bản gen Việc lựa chọn vector cần đảm bảo khả năng vận chuyển một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ, đồng thời phải đáp ứng các tiêu chí tiêu chuẩn nhất định.

Vector tái tổ hợp có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ mà không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào Chúng có những đặc tính dễ dàng phát hiện tế bào vi khuẩn chứa chúng, thường được mã hóa bởi các gen chọn lọc Các vị trí nhận biết của enzym giới hạn cho phép mở rộng khả năng xây dựng vector từ vector ban đầu Kích thước nhỏ của vector giúp thu nhận tối đa DNA và dễ dàng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, từ đó được sao chép nhanh chóng và hiệu quả Ngoài ra, vector cần tồn tại lâu dài trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ mà ít gây xáo trộn cho tế bào chủ Để đảm bảo việc biểu hiện gen, các vector cần có promoter thích hợp cho sinh vật chủ.

Các dạng vector thường sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút) 2.4.1 Plasmid

Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A Brown, 1997)

Plasmid là phân tử DNA dạng vòng nhỏ, tồn tại trong vi khuẩn và các vi sinh vật khác, có khả năng tự nhân bản độc lập với chromosome của tế bào ký chủ Chúng mang một hoặc nhiều gen, thường là những gen mã hóa các chất có lợi cho vi khuẩn Chẳng hạn, plasmid chứa gen kháng Ampicillin hoặc Chloramphenicol giúp vi khuẩn kháng lại và tồn tại trong môi trường có kháng sinh Sự kháng thuốc này được xem là dấu hiệu chọn lọc, giúp xác định sự hiện diện của gen ngoại lai.

Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replication) giúp nhân bản nhanh chóng mà không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ Plasmid nhỏ sử dụng DNA của tế bào ký chủ để nhân bản, trong khi plasmid lớn mang các gen mã hóa chuyên biệt cho quá trình tái bản của chính nó Một số plasmid có khả năng gắn vào nhiễm sắc thể, dẫn đến việc số lượng plasmid được nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn Plasmid hợp nhất, gọi là episome, thường ổn định qua nhiều chu kỳ phân chia tế bào, nhưng cũng có thể tồn tại ở dạng tự do trong một giai đoạn nào đó Phân loại plasmid dựa vào các đặc tính cơ bản được mã hóa bởi các gen của chúng.

Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau:

Loại 1: F plasmid (Fertilyty) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp

Ví dụ F plasmid của E.coly Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp

Vùng chèn DNA là yếu tố quan trọng giúp tế bào ký chủ kháng lại các chất kháng sinh, như RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas Các loại plasmid khác nhau có vai trò riêng biệt: Col plasmid, ví dụ ColE1 trong E.coli, sản xuất colycin để tiêu diệt vi khuẩn khác; Degradative plasmid, như TOL plasmid trong Pseudomonas putida, giúp ký chủ tạo ra các chất sinh học đặc biệt như toluen và salicylic acid; và Virulence plasmid, ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens, xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ, gây ra bệnh bướu trên cây hai lá mầm.

Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen, plasmid thường chứa nhiều gen thiết yếu để hoạt động hiệu quả trong các ký chủ thích hợp Các gen cần thiết bao gồm gen kháng kháng sinh để chọn lọc tế bào mang plasmid, gen ori hỗ trợ quá trình sao chép, gen chỉ thị để nhận biết sự tái tổ hợp, và vùng MSC (multiple cloning site) với nhiều vị trí cắt khác nhau cho phép chèn nhiều đoạn DNA Ngoài ra, plasmid còn có các gen như promoter (p), gen chỉ thị như lacZ’, và vùng cấu trúc bổ sung của primer để thực hiện PCR kiểm tra kết quả.

Bacteriophage là loại virus tấn công vi khuẩn, với DNA của phage được truyền vào ký chủ và nhân lên số lượng Từ đặc tính này, các nhà khoa học đã thiết kế vector mang DNA vào tế bào Một dạng vector lai giữa plasmid và phage, gọi là phasmid, cho phép biểu hiện và sử dụng các chức năng của phage Các vector lai này đã được hoàn thiện và sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng như giải trình tự DNA và sản xuất mẫu dò cho nghiên cứu lai axit nucleic Những plasmid này rất quan trọng, chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, có khả năng tiếp nhận các đoạn DNA lên đến 10kb, như pEMBL9 và pBluescript.

Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA

Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector

2.5.1 Các enzym cắt giới hạn

Hiện tượng giới hạn là quá trình mà các thực khuẩn thể (phage) xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sử dụng bộ máy sinh tổng hợp của chúng để sinh sôi Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bản sao, chúng sẽ làm vỡ tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, trong một số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage không sinh sôi Nguyên nhân có thể do DNA phage gắn vào vi khuẩn dưới dạng không hoạt động trong một thời gian hoặc bị tiêu diệt bởi hệ thống bảo vệ của vi khuẩn, cụ thể là các enzym cắt giới hạn.

Nghiên cứu DNA phage bằng phương pháp Southern blot cho thấy DNA phage từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thước nguyên vẹn, trong khi DNA phage từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đoạn nhỏ hơn Dù có một số chủng vi khuẩn kháng phage, vẫn tồn tại những vi khuẩn bị phân hủy, và các phage do những vi khuẩn này phóng thích có khả năng tiêu diệt các chủng vi khuẩn trước đây đã kháng phage.

Các hiện tượng nêu trên là kết quả của hai enzym chính: enzym cắt giới hạn và Methylase Enzym cắt giới hạn cắt DNA phage tại các vị trí chuyên biệt, tạo ra những đoạn DNA có kích thước xác định Trong khi đó, Methylase gắn nhóm methyl vào các nucleotide A hoặc C tại vị trí cắt của enzym cắt giới hạn Khi A hoặc C được methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận diện được vị trí cắt, giúp bảo vệ DNA vi khuẩn khỏi sự tấn công của chính enzym cắt giới hạn của chúng.

Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ thống nào tương đương được phát hiện ở eucaryote

Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi tại những trình tự xác định Chúng được chia thành ba loại: Loại 1 di chuyển trên DNA và cắt cách vị trí nhận biết từ 1000-5000 nucleotide; Loại 2 cắt ngay tại vị trí nhận biết; và Loại 3 cắt cách vị trí nhận biết khoảng 20 nucleotide Trong các thí nghiệm, enzym cắt giới hạn loại 2 được sử dụng phổ biến nhất.

Trình tự nhận biết của enzym cắt giới hạn là một chuỗi nucleotide đặc trưng, thường từ 4 đến 8 nucleotide, phổ biến nhất là 4 hoặc 6 Các enzym cắt giới hạn khác nhau có cùng một trình tự nhận biết được gọi là isochizomers Đáng lưu ý, một số enzym không có tính chuyên biệt tuyệt đối trong trình tự nhận biết, cho phép một số nucleotide có thể được thay thế bởi nucleotide khác.

Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T

Trình tự Bgly GCCNNNNNGGC – N đại diện cho bất kỳ nucleotide nào và có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự giống hệt nhau khi đọc theo chiều 5’ đến 3’ Điều này dẫn đến việc vị trí cắt trên hai mạch là giống nhau.

Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn

(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2:

Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends) là quá trình mà một số enzyme giới hạn (RE) cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm Sau khi cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp lại, và để nối chúng lại, cần sử dụng enzym T4 ligase.

Cắt đầu dính (cohesive ends) xảy ra khi vị trí cắt trên hai mạch của một số RE không đồng nhất Trong tình huống này, các đầu dính bổ sung có khả năng bắt cặp trở lại, tạo thành hai phân tử liên kết với nhau.

EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá

DNA không đƣợc methyl hoá

DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính

DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính

2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA

Bản sao của chuỗi axit nucleic được tổng hợp nhờ enzym sao chép theo cách bổ sung và đối song, hướng 5’P 3’OH Các DNA polymerase, gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA, thực hiện việc tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA Tuy nhiên, DNA polymerase không thể tự khởi đầu chuỗi axit nucleic; để bắt đầu, cần có một mồi axit nucleic trong môi trường phản ứng.

DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’

Klenow DNA fragment is a modified form of DNA polymerase I, created by cleaving its small subunit using a protease, which removes the 5' to 3' exonuclease activity As a result, Klenow enzyme exhibits two primary functions: it facilitates DNA synthesis through its polymerase activity.

5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’

Enzym terminal transferase được chiết xuất từ tuyến ức của bê, có khả năng xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA Quá trình gắn này diễn ra một cách ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng.

Enzym này được sử dụng để thêm đuôi nucleotide, tạo đầu sole cho phân tử DNA và đánh dấu đầu 3’OH của DNA trong phương pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert.

DNase, thường được chiết xuất từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt DNA sợi đơn hoặc kép một cách ngẫu nhiên, tạo ra hỗn hợp các oligonucleotide Hoạt động của DNase có sự thay đổi tùy thuộc vào sự hiện diện của ion Mn2+.

Mg 2+ và Mn 2+ ảnh hưởng đến hoạt động của DNase trên DNA Khi có mặt Mn 2+, DNase tác động đồng thời lên hai sợi DNA gần nhau, tạo ra những đầu thẳng chỉ từ 1-2 nucleotide Ngược lại, với sự hiện diện của Mg 2+, DNase tác động riêng lẻ lên mỗi sợi DNA.

2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA Người ta thường khử phosphoril hoá vector vừa được mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector Enzym loại này thường được sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn 2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bang cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973)

Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội

Enzym hạn chế cắt vector tại vị trí hạn chế, tạo ra các DNA sợi kép (plasmid thẳng) với các đầu dính Đoạn DNA lạ được cắt từ một phân tử DNA lớn bằng cùng enzym cắt giới hạn hoặc thu nhận từ phản ứng PCR Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn diễn ra dưới sự xúc tác của DNA ligase, giúp tạo liên kết đồng hóa trị giữa các nucleotide kề nhau.

Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng vẫn có thể được sử dụng để tạo ngân hàng DNA thông qua phage làm vector Quá trình tạo DNA tái tổ hợp bao gồm việc phóng thích DNA phage khỏi vỏ, làm cho các đầu tận cùng của đoạn DNA chèn tương thích với đầu tận cùng của DNA phage, sau đó sử dụng ligase để nối các đoạn DNA lại với nhau Tiếp theo, vỏ phage được tái tạo nhờ chất trích protein từ vỏ phage, và phage này sẵn sàng để nhiễm vào vi khuẩn Để tăng bội DNA phage, các phage sẽ được cho nhiễm vào vi khuẩn, dẫn đến sự sinh sản mạnh mẽ của phage chứa DNA lạ và phá vỡ vi khuẩn Cuối cùng, các vi khuẩn được trải trên thạch trong hộp petri.

2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA

Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly bằng phương pháp Calcium chloride

Sambrook và cộng sự (1989) đã phát triển một phương pháp chuẩn bị tế bào E coli có khả năng nạp plasmid, sử dụng kỹ thuật hóa chất kết hợp với sốc nhiệt Ông cũng đã đề xuất công thức tính hệ số biến nạp để đánh giá hiệu quả của quá trình này.

N = A x10 n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tớnh bằng CFU/àg plasmid DNA

A: số khuẩn lạc đếm được trên môi trường chọn lọc n: hệ số pha loãng

OV: thể tớch ban đầu khi phục hồi (àl)

OP: thể tớch dịch vi khuẩn đƣợc trải trờn đĩa (àl)

Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:

10mM Pipes, 55mM MnCl 2 , 15mM CaCl 2 , 250mM KCl

Nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) tập trung vào việc cải thiện phương pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid bằng cách sử dụng các chủng E.coli khác nhau.

Nghiên cứu của ông cho thấy rằng việc sử dụng tế bào ở đầu phage log có ảnh hưởng lớn đến thành công trong việc chuẩn bị tế bào khả nạp Giá trị OD 600 tối ưu cho các chủng vi khuẩn như XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 từ 0.2-0.5, và DH5α từ 0.145-0.45 Nồng độ CaCl2 lý tưởng trong dung dịch TB là 75mM Ngoài ra, Zhiming Tu cũng chỉ ra rằng thời gian lưu trữ tế bào khả nạp ở -20°C là 7 ngày và ở -70°C là 15 ngày.

Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Khoá luận được thực hiện từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005 tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông lâm.

Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật lyệu và phương pháp dùng trong thí nghiệm

3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm

Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid pBluescirpt II SK ( + / - ), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR

Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid

The genetic strain supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1 exhibits a mutation in Ф80lacZ∆M15, which facilitates α-complementation with the amino-terminal fragment of β-galactosidase encoded by pUC plasmid vectors, as described by Hanahan.

3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn Bên ngoài vùng MSC là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phương pháp đọc trình tự pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại.

VẬT LYỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Khoá luận được thực hiện từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005 tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông lâm.

Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Vật lyệu và phương pháp dùng trong thí nghiệm

3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm

Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid pBluescirpt II SK ( + / - ), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR

Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid

The genetic strain described is supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1 The Ф80lacZ∆M15 mutation enables α-complementation with the amino-terminal fragment of β-galactosidase, which is encoded by pUC plasmid family vectors (Hanahan).

3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn Bên ngoài vùng MSC là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phương pháp đọc trình tự pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại

Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-)

The focus of this study is on two specific DNA segments: a 629 base pair (bp) segment encoding the gene for 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) found in the bacterium Pseudomonas fluorescens, and a 580 bp segment located in the internal transcribed spacer (ITS) region of the fungus Beauveria bassiana.

3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri, Ống nghiệm

Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất Thùng đựng nước đá Bình tam giác

3.2.3 Các thiết bị máy móc

Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di Máy chụp gel

3.2.4 Các loại môi trương nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )

Môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillyn)

Môi trường LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar )

Môi trường LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar Ampicillyn, X-gal, IPTG )

3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm

Hóa chất dùng cho PCR (đƣợc cung cấp bởi công ty Bio-rad) iTaq polymerase

Các loại hoá chất khác

EDTA Sodium dodecyl sulfat (SDS) Natri hydroxide

Glacial acetic Potassium acetat Glycerol 70%

3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm

BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC

EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC

(Roche, Cat.No 667 145) CTA TAG

Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT

DNA T4 lygase (usb, Product No 70005Y) do công ty Amersham cung cấp

DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do công ty Bio-rad cung cấp.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra

Màng tế bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép

Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid sốc nhiệt ổn định tế bào

3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

Vi khuẩn Ecoly DH5α + CaCl 2 Khả nạp

Vi khuẩn mang plasmid Bluescript

Cắt plasmid bằng EcoRV Blunt - end

Biến nạp vào khả nạp

Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh

Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng

Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7

3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD 600nm kết hợp với phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường LB agar

Khi một pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan, nó tạo thành một hệ huyền phù, làm môi trường trở nên đục do các phần tử cản ánh sáng Tế bào vi sinh vật cũng góp phần làm tăng độ đục của môi trường, và độ đục này tỷ lệ thuận với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định, có thể thiết lập mối quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do đó, mật độ tế bào có thể được định lượng gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bước sóng từ 550 – 610 nm, với điều kiện phải thiết lập đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào, kết hợp với phương pháp đếm trực tiếp.

Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trường LB agar Ủ ở 37 0 c từ 16-18 giờ

Sử dụng que cấy để lấy một khuẩn lạc có kích thước từ 0.5-1mm từ đĩa petri đã phân lập, sau đó cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 37 độ C với tốc độ 150 vòng/phút.

Sau 3 giờ nuôi cấy, tiến hành đo OD tại bước sóng 600nm, sử dụng môi trường LB lỏng để xây dựng đường chuẩn và lặp lại quá trình này mỗi giờ Đồng thời, tại mỗi thời điểm đo OD, cũng thực hiện việc đếm khuẩn lạc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc để thu thập dữ liệu chính xác.

Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn

Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ

Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nước

Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy vào eppendorf đầu tiên, ta tạo ra dung dịch có nồng độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thực hiện các bước pha loãng theo sơ đồ đã định để đạt được nồng độ mong muốn.

Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trường LB agar Lập lại 3 lần Ủ ở 37 0 c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy

Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100

A A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml)

3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Bước 1: Bắt một khuẩn lạc đường kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng

Bước 2: Nuôi cấy lắc ở 37 0 C đến khi đạt được mật độ khoảng 10 8 tế bào/ml

Bước 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong

Bước 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C

Bước 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dưới Lập lại bước này 3 lần

Bước 6: Cho 1 ml CaCl 2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa

Bước 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 4 0 C

Bước 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa Bước 9: Cho 150μl CaCl 2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên

Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -70 0 C

Khả năng nạp chuẩn bị vi khuẩn theo phương pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -70°C Việc thêm glycerol giúp giảm sốc khi rã đông, từ đó cải thiện khả năng bảo quản và số lượng khuẩn lạc có thể đếm được, với độ pha loãng đạt *1000.

3 * 10 khả nạp đƣợc lâu hơn Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng

3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Chúng tôi thực hiện thử nghiệm biến nạp với nhiều quy trình khác nhau, bao gồm thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid, để xác định quy trình hiệu quả nhất cho việc biến nạp plasmid tái tổ hợp.

Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây

Chuẩn bị 30µl tế bào competent cell bằng cách cho vào ống eppendorf 1.5µl, sau đó thêm 3µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ và giữ lạnh trong 20 phút.

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42 0 C, giữ trong 90 giây

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thờm 800àl mụi trương LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 c trong 1 giờ

Hút 150ml dịch vi khuẩn và nạp vào đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh Ampicillin nồng độ 50µg/ml, X-gal và IPTG Dùng que trang đều trên bề mặt môi trường và để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô.

Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37 0 C

Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng

Hãy chuẩn bị 10 µl dịch huyền phù tế bào competent và cho vào ống Eppendorf 1.5 ml Tiếp theo, thêm 1.5 µl DNA plasmid vào ống, đảo nhẹ và giữ lạnh trong khoảng 20 phút.

Thờm 500àl mụi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 C trong 1 giờ

Hỳt 150μl dịch vi khuẩn và chuyển vào đĩa mụi trương LB có chứa ampicillin với nồng độ 60μg/ml, X-gal và IPTG Sử dụng que để trải đều dung dịch trên bề mặt môi trường, sau đó để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi bề mặt khô.

Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

Huyết 3àl dịch huyền phực tế bào khả nạp được chuẩn bị trong ống eppendorf 1.5 ml Sau đó, thêm 0.5àl DNA plasmid vào, đảo nhẹ và giữ lạnh trong 20 phút.

Thờm 200àl mụi trương LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 C trong 1 giờ

Hỳt 150µl dịch vi khuẩn vào đĩa mụi trương LB chứa ampicillin nồng độ 60μg/ml, X-gal và IPTG Sử dụng que để trải đều dung dịch trên bề mặt môi trường Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi bề mặt khô.

Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp

Nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc mong muốn dựa vào phản ứng tạo màu với X-gal trong môi trường LB, kết hợp với kháng sinh Ampicillin và IPTG.

Sau khi ủ qua đêm trên đĩa petri, sẽ xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và trắng Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa để thu thập dữ liệu.

Dùng tăm vô trùng bắt ở mỗi đĩa 10 khuẩn lạc màu xanh cho vào 10 ống nghiệm có chứa 5 ml mụi trương LB lỏng cú khỏng sinh nồng độ 60 àg/àl

Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 37 0 c

Cách tính hệ số biến nạp theo Sambrook và cộng sự, 1989 :