Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.Coly DH5α

Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.Coly DH5α

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt Vấn Đề

Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp như là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng lương thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy được một nền nông nghiệp bền vững Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá trong nghiên cứu khoa học về các phương pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và bảo tồn những gen quý

Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thường gặp khó khăn lớn về số lượng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, người ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lượng lớn để tiến hành nghiên cứu Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thường chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phương pháp sinh hoá thông thường để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen

Những vấn đề trên có thể được giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phương tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ Tế bào chủ thường được chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp Dòng tái tổ hợp được phân lập để lưu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning Mục đích của tạo dòng nhằm thu được số lượng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu

Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền được tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly

DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình 1.2 Mục tiêu của đề tài

Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển

được plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α

1.3 Nội dung thực hiện 1.3.1 Phần 1

Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi khuẩn dựa trên sự tương quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tương quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy

Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất

Thiết lập phương pháp biến nạp plasmid DNA chưa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn

E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt

Phương pháp tách chiết plasmid chưa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra

Kiểm tra thể biến nạp trên môi trường có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG

Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên plasmid tách chiết từ thể biến nạp

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LYỆU

2.1 Hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Hiện tượng biến nạp

Biến nạp là hiện tượng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn Hiện

tượng biến nạp được chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó được kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm 1944 (viện Rocketfeller) Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trường sống Nguồn DNA này có được từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy Kết quả thu được là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền

Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp” Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dưỡng và oxy trong môi trường sống của chúng giảm xuống thấp Trong thực tế nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp thu DNA

2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò

Hiện tượng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trường sống

Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật

2.1.2.2 Ứng dụng

Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bước đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp Từ rất lâu, vi sinh vật đã được xem và sử dụng như nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con người, ví dụ kháng sinh Penicillyn được

chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces griseus Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi

khuẩn và ở đó một lượng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ được tạo ra, sau đó kết hợp với các phương pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con

người Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen kháng bệnh đã được tạo ra thay thế cho những phương pháp cổ điển

Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác như đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen được dễ dàng

2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tượng biến nạp

Hiện tượng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ được hấp thụ

Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dưỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng như đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận được sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào

Hệ thống vận chuyển này được hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng được hoạt hoá Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998)

ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đưa sợi DNA mạch đơn vào tế bào Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và được phân ra thành những đoạn dưới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới được cắt ra này được đưa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào

Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng như các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã

ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã ComK được điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó Sự biểu hiện của ComK được quy định bởi một mạng lưới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự

ngắn giàu A/T, được sắp xếp trong một khung đọc đặc trưng và lynh động dọc theo sợi xoắn DNA Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT

ComK được điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, được hoạt hoá dương bởi AbrB, sinR, DegU CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào như là một chỉ thị về dinh dưỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dưỡng DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp

2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly

2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo

Biến nạp nhân tạo là việc đưa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lượng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác

Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cường khả năng biến nạp, người ta thường xử lý tế bào chủ bằng các phương pháp hóa học hay vật lý Tế bào chủ sau khi

được xử lý bằng các phương pháp trên gọi là tế bào khả nạp Tế bào E.coly là một tế

bào chủ được sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tương đối đơn giản, thông tin di truyền đã được biết tường tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ

E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và

bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen Giống như tất cả các loài

vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử

sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép

Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA

plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal

2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly

Trong trường hợp có glucose, E.coly tăng trưởng nhanh chóng Nếu thay glucose bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trưởng và hồi phục sau đó nhờ

tổng hợp được 3 enzym

Permerase kých thích sự thấm lactose Acetylase (vai trò chưa rõ)

Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose

Ba enzym này chỉ được tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng được cảm ứng bởi lactose Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô hình hoạt động của operon Lac (lactose operon) Operon Lac là đoạn DNA chứa:

Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA (mã hoá acetylase) Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym Operator quyết địmh RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002)

Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly

Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002

Người ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và operator là operon Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trường), vì chúng được kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator) Trước operon lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự biểu hiện gen Hoạt động của operon Lac được chứng minh như sau:

Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết

gen điều hoà Gen điều hoà

Vùng cấu trúc gen

của lac operon

cấu trúc

gen của cấu trúc gen của cấu trúc

gen của

của RNA polynerase và promoter Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trượt dài theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) được tạo thành và được

dịch mả thành các polypeptide riêng biệt Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng

glucose trước, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá” Khi glucose giảm, người ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein) phức hợp cAMP-CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với promoter

Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông

thường E.coly dùng để biến nạp được cải tiến thành các chủng chủ theo các hướng cơ

bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lượng plasmid tích luỹ trong tế bào Thông thường

người ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA-) là gen mã hóa cho endonuclease I Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lượng plasmid và cải thiện chất lượng DNA chiết tách bằng các phương pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002)

2.3.3.2 Phương pháp hoá học

Là phương pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ) Phương pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhưng đơn giản và dễ thực hiện

Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phương pháp hóa học, người ta có

thể tiến hành theo 3 cách khác nhau

Thứ nhất, phương pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu

quả biến nạp cao (5x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA)

Thứ hai, phương pháp Inoue dễ lặp lại hơn phương pháp Hanahan và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x108 đến 3x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA

Thứ ba, phương pháp Calcium chloride, phương pháp này được phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x106

đến 2x107 khuẩn lạc/µg plasmid DNA Thông thường, người ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II như CaCl2, MgCl2, RbCl2

Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện

của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0-4oC) Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng

tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp

để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trường dưỡng chất được thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tương ứng

2.3.4 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp

Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trưởng trên môi trường có kháng sinh

Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trường chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu

nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trưởng Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trưởng được

Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã được mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh nhưng không mang gen mục tiêu Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu được tiến hành theo nhiều phương pháp Phổ biến là các phương pháp sau:

Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation

Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp lai (lai khuẩn lạc) Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc) Thông thường, để phân tích một dòng người ta dung hai phương pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích

Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn

gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự

điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin) Việc chèn vào đoạn

này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hưởng tới chức năng của lacZ Các vector loại này sẽ được sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase Hiện tượng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-

galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức

năng Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng được phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trường có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside) Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl Dẫn xuất này, đến lượt nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò như là chất kých hoạt của gen lacZ

Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin Do đó, hiện tượng α-complementation không thể xảy ra Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng

2.3.5 Chiết tách DNA plasmid

Với mong muốn thu nhận một số lượng lớn các bản sao plasmid, người ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ Thông qua đó, plasmid được sao chép với số lượng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trưởng của tế bào chủ Trước hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trường chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dưới dạng tinh Các quy trình tách chiết đều có các bước chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA Tuỳ theo từng phương pháp cụ thể người ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết

Có nhiều phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn như: Phương pháp nhiệt độ cao

Phương pháp Lythium Phương pháp SDS-kiềm

2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR

Là phản ứng nhân nhanh số lượng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro Quá trình này được tiến hành nhờ enzym DNA polymerase

Phản ứng PCR gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95oC

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của Primer, thông thường khoảng 40 – 50o

Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA

Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện

cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới Taq polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng thermus aquaticus Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao,

nó chịu được nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động

của Taq polymerase khoảng 70 – 72o

C Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này quá thấp không đủ lượng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn

2 4 6 8 1 0 Biến tính

Ủ bắt cặp

Kéo dài

Lặp lại n lần 94–95o C 72o C

45-56o C

Các nucleotid tự do

dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao

chép của Taq polymerase

Primer (mồi)

Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Chiều dài của mồi thường từ 10 – 35 nucleotide Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới Khi

mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA

Dung dịch đệm

Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2+ Nó rất cần thiết cho

quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ

nóng chảy của các DNA mạch kép Nồng độ MgCl2 tối ưu là 1.5mM

Môi trường đệm KCl đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR Tuy nhiên trong nhiều trường hợp môi trường này không hiệu quả nên người ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2+ Với những đoạn DNA giàu G, C người ta thường dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những

sản phẩm được tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq Phương pháp này

dùng phát hiện những đoạn gen có kých thước nhỏ chạy trên gel acrylamide

DNA khuôn

Phản ứng PCR tối ưu trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lượng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn

Số chu kỳ phản ứng

Số lượng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vượt qúa 40 chu kỳ Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lượng DNA mẫu ban đầu Nếu ít chu kỳ thì

sản phẩm PCR thu được ít Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong phản ứng

Nhiệt độ và pH

Những enzym được sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ Theo Trần Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp

nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase Để kéo dài chuỗi

người ta sử dụng nhiệt độ 72o C, đây là nhiệt độ tối ưu cho Taq polymerase hoạt động

Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này được xác định tùy từng loại primer Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao Thông thường nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C

Hầu hết các enzym, mẫu DNA được đệm trong môi trường tối ưu có pH = 8 Ở pH này DNA rất ổn định Trong môi trường axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8

Các vấn đề thường gặp trong PCR và phương pháp khắc phục

Bảng 2.1 Các vấn đề thường gặp trong PCR và phương pháp khắc phục

1 Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trưng

Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi

Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C

Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM

Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP

Giảm lượng mồi

Giảm lượng DNA khuôn

Giảm lượng tap polymerase

2 Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trƣng

Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài

Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C

Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM

Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP

Giảm lƣợng mồi

Giảm lƣợng DNA khuôn

Giảm lƣợng Taq polymerase

3 Không có sản phẩm nào cả

Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng

Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông Gia tăng hàm lƣợng mồi

Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o

C 4 Sản phẩm

PCR ít

Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể Gia tăng lƣợng mồi

Gia tăng lƣợng DNA khuôn

Gia tăng lƣợng Taq polymerase

Ứng dụng của PCR

PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực:

Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus

Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin

Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn hoặc vi rút có trong mẫu thực phẩm Sử dụng để xác nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen

2.3.7 Điện di DNA

Phương pháp điện di là phương pháp cho phép xác định kých thước của các đoạn DNA DNA được cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trường Do DNA tích điện âm nên trong môi trường điện trường nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Agarose là một trong các dạng của polysacharide Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gellyng) Giữa những hạt như vậy có những lổ rất nhỏ Tùy theo nồng độ của gel mà kých thước của các lỗ nhỏ này khác nhau Nồng độ gel càng cao thì kých thước của các lổ càng nhỏ và ngược lại Khi DNA đi qua các lổ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này DNA có kých thước càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngược lại Các DNA cùng kých thước sẽ di chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát được sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và chiếu dưới tia tử ngoại

2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA Khái niệm về vector

Vector là vật lyệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA, thí nghiệm gen cloning Vector được chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn như sau:

Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép bộ gen tế bào chủ Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng Các đặc tính này thường được mã hoá bởi các gen chọn lọc Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn Các vị trí cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu Có kých thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng DNA tối đa Hơn nữa, kých thước vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng được sao chép nhanh và hiểu quả Tồn tại được trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu hiện gen trong sinh vật chủ

Các dạng vector thường sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút)

2.4.1 Plasmid

Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A Brown, 1997)

Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kých thước phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn và vi sinh vật khác, plasmid có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào ký chủ Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thường là gen mã hóa các chất có ích cho vi khuẩn Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillyn hoặc Chloramphenocol sẽ giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trường có kháng sinh này Tính kháng với loại kháng sinh nào đó được xem như là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để nhận điện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai

Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replycation) giúp quá trình nhân nhanh về số lượng nhưng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào ký chủ cho việc nhân bản của nó, nhưng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lượng plasmid được nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn Những plasmid hợp nhất gọi là episome thường ổn định qua nhiều chu kì phân chia tế bào, nhưng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do

Phân loại plasmid được dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó Có 5 loại plasmid được định tính như sau:

Loại 1: F plasmid (Fertilyty) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp Ví dụ F plasmid của E.coly Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp

Vùng chèn DNA

chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào ký chủ tồn tại trong môi trường sống Ví

dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas Loại 3: Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi khuẩn khác Ví dụ ColE1 trong E.coly Loại 4: Degradative plasmid giúp ký chủ tạo

các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, như toluen, salycylyc

axit Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida Loại 5: Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bướu trên cây hai lá mầm

Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thường sử dụng plasmid có nhiều tới rất nhiều gen giúp cho plasmid tồn tại và họat động trong những ký chủ thích hợp Gen cần thiết gồm gen kháng kháng sinh, giúp cho việc chọn đúng những tế bào mang plasmid, gen ori giúp cho quá trình lập lại, gen chỉ thị nhằm nhận biết sự tái tổ hợp, vùng MSC (multiple cloning site, vùng đa vị trí gắn kết) chứa nhiều vị trí được nhận biết bởi nhiều loại men cắt khác nhau giúp cho sự chèn nhiều đoạn DNA có cấu trúc khác nhau, và các gen khác như promoter (p), gen chỉ thị như lacZ’, vùng có cấu trúc bổ sung của primer cho phép thực hiện PCR kiểm tra kết quả

2.4.2 Phage

Là vật lyệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn Khi tấn công DNA của phage được truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số lượng, người ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào

Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage được biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid Các vector lai giữa plasmid và phage được hoàn thiện cho tới nay và được sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng như giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thước tới 10kb (pEMBL9, pBluescript)

2.5 Các enzym được sử dụng cho biến nạp DNA

Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector

2.5.1 Các enzym cắt giới hạn

Khái niệm hiện tượng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi

khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn Khi số lượng phage tăng lên

đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn Nhưng trong một số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi Hiện tượng này có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dưới dạng không hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn Đây chính là hiện tượng giới hạn

Khi nghiên cứu DNA phage bằng phương pháp Southern blot, người ta thấy rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thước nguyên vẹn trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých thước đã xác định Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi khuẩn bị phân hủy Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trước kia còn kháng phage

Tất cả những hiện tượng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành những đọan có kých thước nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn Khi A hay C được methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết được vị trí cắt DNA vi khuẩn không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này

Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chưa có hệ thống nào tương đương được phát hiện ở eucaryote

Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy

giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định Dựa vào khả năng này người ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết được trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide Trong các thí nghiệm người ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại 2

Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự

nocleotide đặc trưng Các trình tự này thường bao gồm từ 4-8 nucleotide (thường là 4 hay 6) Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers Đối với một

số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác

Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào

Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’ Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch

Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn

(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2:

Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 lygase

HaeIII

5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’

đƣợc methyl hoá Enzym cắt

giới hạn

EcoRI

Enzym cắt giới hạn

EcoRI

DNA không đƣợc methyl hoá DNA không

đƣợc methyl hoá

Phân cắt Đầu dính

DNA có nguồn gốc khác nhau khi được cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết

hợp thành một thông qua các đầu dính EcoRI

5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’

2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA

2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)

Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn được tổng hợp, nhờ một enzym sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hướng 5’P 3’OH Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA được gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trường phản ứng một mồi axit nucleic

DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động

enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’

Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’ Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase

5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’

2.5.2.2 Terminal transferase

Enzym này được ly trích từ tuyến ức của bê Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng

Enzym này được sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert

2.5.2.3 Các DNase

Các DNase thường được cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các olygonucleotide Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay Mg2+ Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần như ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide) Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ

2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá

Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA Người ta thường khử phosphoril hoá vector vừa được mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector Enzym loại này thường được sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ như là yếu tố hoạt hoá Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bang cách thêm vào một lượng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril được tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973)

2.5.4 Các enzym nối DNA

Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề Sự hình thành lyên kết này có thể

được xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase

2.5.3.1 E.coly DNA lygase

Enzym được ly trích từ E.coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole

E.coly DNA lygase

5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’

2.5.3.2 T4 DNA lygase

Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coly Enzym này có cùng chức năng với lygase trích từ E.coly nhưng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng

nên là lygase được chuộng nhất trong sinh học phân tử

2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội 2.6.1 Với plasmid

Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC Các DNA sợi kép (plasmid thẳng) với các đầu dính hay bằng được tạo thành Đoạn DNA lạ được cắt ra từ một phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trường hợp đầu dính) hoặc thu nhận từ phản ứng PCR Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn được tiến hành dưới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các nucleotide cạnh nhau

2.6.2 Với DNA phage

Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhưng ta cũng có thể tạo các ngân hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng plasmid Các bước tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tương hợp với các đầu tận cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi khuẩn Để tăng bội DNA phage người ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn Các phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn Các vi khuẩn sau đó được trải trên thạch trong hộp petri

2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA

Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào

vi khuẩn E.coly bằng phương pháp Calcium chloride

Sambrook và cộng sự (1989), đưa ra phương pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp,

biến nạp plasmid vào tế bào theo phương pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đưa ra công thức tính hệ số biến nạp

N = A x10n x OV/PV

N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm được trên môi trường chọn lọc n: hệ số pha loãng

OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)

OP: thể tích dịch vi khuẩn được trải trên đĩa (µl)

Inoue và cộng sự(1990), đưa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp như sau:

10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl

Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phương pháp chuẩn bị tế bào

khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E.coly khác nhau

Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn như sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45 Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dich TB tối ưu là 75mM Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lưu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày

PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Thời gian : Khoá luận được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15

tháng 08 năm 2005

Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trường Đại học Nông lâm

Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật lyệu và phương pháp dùng trong thí nghiệm 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm

Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid

pBluescirpt II SK (+/-), đoạn DNA thu được từ phản ứng PCR

3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α

Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lượng bản sao plasmid hoặc cosmid

Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)

hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1

Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tượng α-complementation với tiểu

phần mang đầu amino của β-galactosidase được mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)

3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-)

pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, được thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn Bên ngoài vùng MSC là T7, T3

RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro Trình tự của T7,

T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phương pháp đọc trình tự

pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngược lại

Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-)

3.2.1.3 Đoạn DNA

Hai đoạn DNA được chọn nghiên cứu trong khoá luận này là

Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong

vi khuẩn Psedomonas fluorescens

Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana

3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

Đĩa petri, Ống nghiệm Eppendorf các loại Pipet và đầu tip

Lọ thủy tinh đưng hóa chất

Đầu lọc hóa chất Thùng đựng nước đá Bình tam giác

3.2.3 Các thiết bị máy móc

Tủ cấy vô trùng Bồn ổn nhiệt Máy ly tâm Tủ định ôn

Máy lắc vi khuẩn Tủ lạnh

Máy đo OD Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di Máy chụp gel Lò vi sóng

3.2.4 Các loại môi trương nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )

Môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillyn)

Môi trường LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar )

Môi trường LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar Ampicillyn, X-gal, IPTG )

3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm

Hóa chất dùng cho PCR (được cung cấp bởi công ty Bio-rad)

iTaq polymerase MgCl2

dNTPsPCR buffer

Các loại hoá chất khác

Tryptone

Bacto yeast extract Natri chlorua Canxi chlorua X-gal

IPTG

Kháng sinh Ampicillyn Glucose

3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm

BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC

(Roche, Cat.No 220 612) CCTAG G

EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC

(Roche, Cat.No 667 145) CTA TAG

Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT

(Roche, Cat.No 656 313) TTCGA A

DNA T4 lygase (usb, Product No 70005Y) do công ty Amersham cung cấp

DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do công ty Bio-rad cung cấp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra

Màng tế bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép Nhiễm sắc thể

+ CaCl2

Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid

sốc nhiệt

ổn định tế bào

3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl

3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường LB agar

3.3.3.1 Nguyên tắc

Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan, thì sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bước sóng từ 550 – 610 nm Trong trường hợp này, phải thiết lập đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào kết hợp với phương pháp đếm trực tiếp

Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn

Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ

Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nước 100μl dịch nuôi cấy

900μl nước

Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy cho vào eppendorf thứ nhất ta được nồng đô pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng theo sơ đồ đến nồng độ cần thiết

Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trường LB agar Lập lại 3 lần

Ủ ở 370c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy

Cách tính

Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm được chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100

A =

A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml)

3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Bước 1: Bắt một khuẩn lạc đường kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng

Bước 2: Nuôi cấy lắc ở 370C đến khi đạt được mật độ khoảng 108tế bào/ml

Bước 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong 10 phút

Bước 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C

Bước 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dưới Lập lại bước này 3 lần

Bước 6: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa

Bước 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40C

Bước 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa Bước 9: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên

Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700C

Khả nạp chuẩn bị theo phương pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó được bảo quản ở -70oC Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản

số khuẩn lạc đếm được * độ pha loãng *1000 3 * 10

khả nạp được lâu hơn Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng

3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng

phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Chúng tôi tiến hành biến nạp thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid Nhằm xác định quy trình nào có hiệu quả nhất để phục vụ cho biến nạp plasmid tái tổ hợp

Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây

Hút 150ml dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh Ampicilyn nồng độ 50µg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370

Thêm 500µl môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ

Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370C

Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

Quy trình 3

Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420

C, giữ trong 90 giây Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thêm 200µl môi trương LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ

Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370C

Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp

Nguyên tắc của chọn lọc khuẩn lạc mong muốn là dựa vào phản ứng tạo màu với

X-gal trong môi trường LB có sự hiện diện của kháng sinh Ampicillyn và IPTG

Sau khi ủ qua đêm trên đĩa petri sẽ xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và các khuẩn lạc màu trắng Tiến hành đếm các khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa

Dùng tăm vô trùng bắt ở mỗi đĩa 10 khuẩn lạc màu xanh cho vào 10 ống nghiệm có chứa 5 ml môi trương LB lỏng có kháng sinh nồng độ 60 µg/µl

Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 370c

Cách tính hệ số biến nạp theo Sambrook và cộng sự, 1989 : N = A x10n x OV/PV

N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm được trên môi trường chọn lọc n: hệ số pha loãng

OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)

OP: thể tích dịch vi khuẩn được trải trên đĩa (µl)

3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.3.7.1 Chiết tách plasmid

Có nhiều phương pháp chiết tách DNA plasmid như: Phương pháp sử dụng nhiệt độ cao, phương pháp SDS – kiềm Nhưng chúng tôi chọn phương pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này

Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng Sau khi màng tế bào bị vỡ , dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của DNAse Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ được phục hồi nhanh chóng DNA của bộ gen có kých thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống Như vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen DNA của plasmid được tủa dưới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng

Phương pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau

Bước 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200

C

Bước 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm

Bước3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết

Bước 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf

Bước 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng

Bước 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng

Bước 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa

Bước 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40

C Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngược trên giấy thấm

Bước 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa

Bước 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách

Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng

Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA

plasmid chiết tách được có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không

3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lượng enzym xúc

tác phản ứng cắt hết một lượng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần như sau

Thêm nước cho tới 25µl

Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút

Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 0.8%, với hiệu điện thế 100V, trong 30 phút để kiểm tra

3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose

Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lược vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W

Để nguội đến 40-500

C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lược ra khỏi miếng gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TAE 0.5X

Chuẩn bị một miếng parafilm (kých thước tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng

Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút

Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận)

3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR

Phương pháp tinh sạch được thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phương pháp cắt gel

Quy trình tinh sạch DNA từ gel

Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di

Bước 1: Gel sau khi chạy điện di, được đưa lên hệ thống UV

Bước 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần được tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lượng trước)

Bước 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl capture buffer

Bước 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút)

Bước 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tương ứng với số mẩu cần tinh sạch Bước 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf

Bước 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Bước 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C

Bước 9: Cho thêm vào cột lượng wash buffer tương ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C

Bước 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới Bước 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX Bước 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Bước 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40

C, lấy cột ra, đậy nắp lại

Bước 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chưa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch.

Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX

Bước 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tương ứng với số mẫu cần tinh sạch Bước 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản

phẩm PCR là 5:1

Bước 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Bước 4: Đem ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C

Bước 5: Cho thêm vào cột một lượng wash buffer bằng với lượng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C

Bước 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới

Bước 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lượng elution buffer có thể thay đổi

Bước 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Bước 9: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút ở 40c, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại Bước 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chưa tinh sạch trên gel agarose

0.8% để kiểm tra kết quả tinh sạch

3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR

Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu được sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính.Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi

tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow)

Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA

Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:

DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)

Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750

C trong 20phút

3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end)

T4 DNA lygase không giống nhƣ E.coly DNA lygase, nó có thể xúc tác phản ứng

nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978) Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym lygase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10

Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng lygation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ lygase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó

Phản ứng tạo đầu bằng

chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra

Cơ sở để tính tỉ lệ về lượng vector và DNA insert theo số mol

Đổi từ số mol ra lượng (ng) của phân tử DNA

Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn

Ủ phản ứng ở 220c trong 4 giờ, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer

3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp (theo quy

trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa)

Thực hiện biến nạp theo quy trình sau

Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đươc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thêm 200µl môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ 1 μg

3000 fmol

Kích thước DNA (bp)

1000 bp

Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb)

X Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector