4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA
Trong đề tài này, chúng tôi thực hiiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng (blunt end) cho đoạn DNA
EcoRV DC1 DC2 DC3
DNA plasmid
sau đó tinh sạch. kết quả tinh sạch đoạn DNA bằng 2 phƣơng pháp đƣợc thể hiện ở Hình 4.13 và Hình 4.14
Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX.
Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.
.
Kết quả điện di (hình 4.13) cho thấy quá trình tinh sạch đã loại đƣợc hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzym Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể đƣợc kiểm tra khi đã chèn vào plasmid (đã đƣợc cắt tạo đầu bằng) và biến nạp vào vi khuẩn.
Kết quả diện di (hình 4.14) cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch không còn band phụ, tuy nhiên trong lúc kiểm tra kết quả tinh sạch cần chú ý chạy thêm đối chứng để
1
(DC) đoạn DNA đối chứng kích thước 629bp từ sản phẩm PCR chưa tinh sạch, (TS) đoạn DNA kích thước 629bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
(1) đoạn DNA kích thước 580bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX
đối chiếu, ở thí nghiệm này chúng tôi đã không chú ý đến điều này, đây là một thiếu sót của chúng tôi.
Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar).
Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch:máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer.
4.5.2 Tinh sạch plasmid
Plasmid sau khi dùng enzym cắt mở vòng mới tinh sạch.
Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX.
Kết quả điện di cho thấy sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm của phản ứng cắt. Từ sản phẩm tinh sạch này chúng tôi tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối.
4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp
Thực hiện phản ứng blunt-end sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm của phản ứng blunt-end, và nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid ta đƣợc plasmid tái tổ hợp. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp, thu đƣợc kết quả
nhƣ sau
DC1 DC2 TS
(DC1) mẫu plasmid cắt bằng enzym EcoRV chưa tinh sạch, (DC2) mẫu plasmid cắt bằng enzym HindIII chưa tinh sạch, (TS) mẫu plasmid cắt bằng EcoRV được tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG.
(a) Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(b) một phần của hình ( a) được phóng to.
Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG.
(a)Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợpvới đoạn DNA 580bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(b) một phần của hình a được phóng to.
a b
Với đoạn DNA có kých thƣớc 629bp, chỉ có 6 khuẩn lạc trắng trong tổng số 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc xanh là do sự tái đóng vòng của plasmid, các khuẩn lạc trắng có thể là do các tế bào mang plasmid tái tổ hợp. để khẳng định, chúng tôi tiến hành cấy chuyền, chiết tách plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thựic hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers T3, T7.
Với đoạn DNA có kých thƣớc 580bp, kết quả cho 4 khuẩn lạc trắng trong tổng số 108 khuẩn lạc, để kiểm tra các khuẩn lạc trắng này chúng tôi thực hiện cấy chuyền, tách chiết plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thực hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers ITS4, ITS5.
4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Chọn lọc những khuẩn lạc trắng từ hình 4.15 cấy sang môi trƣờng LB lỏng/Amp nhân sinh khối qua đêm và tiến hành tách chiết theo quy trình 3.3.7
Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp.
(1.1), (1.2), (1.3), (1.4), (1.5), (1.6) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút.
Theo kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết mẫu số 1.5 nằm cao hơn các mẩu plasmid khác nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III các mẫu số 1.2, 1.4, 1.5.
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 Kích thƣớc dự đoán 3.0kb Kích thƣớc dự đoán 3.629kb
Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp.
(2.1) ,(2.2),( 2.3),( 2.4) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút.
Kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết chỉ thu đƣợc hai mẫu có mang plasmid, mẫu số 2.1 nằm cao hơn mẫu 2.3 nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III mẫu số 2.1 và chạy kiểm tra với plasmid đối chứng.
4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm tách chiết plasmid các mẫu biến nạp đƣợc cắt với hai enzym là BamHI và
HindIII. Hai enzym này có trình tự nhận biết nằm ngoài trình tự nhận biết của enzym EcoRV, do đó khi cắt mẫu plasmid tái tổ hợp sẽ tạo dạng thẳng mang cả đoạn DNA
đƣợc chèn vào theo đúng sơ đồ cắt trong vùng MCS.
Kích thƣớc dự đoán 3.58kb Kích thƣớc dự đoán 3.0kb
Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp và mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp.
(DCB) plasmid đối chứng cắt với enzym BamHI, (DCH) plasmid đối chứng cắt với enzym HindIII, (2.1B-1.4B) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym BamHI, (2.1H-1.4H) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym HindIII.
Cắt bằng BamHI mẫu số 1.5, 2.1 khi chạy điện di các band cao hơn band mẫu đối chứng, mẫu số 1.2, 1.4 có band bằng với band của mẫu đối chứng. Cắt bằng HindIII mẫu số 2.1 khi chạy điện di band cao hơn band mẫu đối chứng, các mẫu còn lại có các band bằng với band của mẫu đối chứng. Nhƣng mẫu số 1.5 còn có thêm 1 band mờ nằm ở dƣới, có thể đoạn DNA đƣợc chèn ở mẫu số 1.5 có chứa site cắt của HindIII. Qua kết quả kiểm tra bằng men cắt chúng tôi có thể khẳng định đã chọn lọc đƣợc thể tái tổ hợp.
4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR
Tiến hành chạy PCR kiểm tra mẫu số 7 với primer của đoạn DNA đó, kiểm tra mẫu số 9 với cặp primer T3, T7.
Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp.
(1) đối chứng mẫu số 2.1 (sản phẩm PCR từ genome, đoạn DNA insert), (2) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 2.1 với cặp primer của chính đoạn gen đó (ITS4, ITS5), (3) leader 100bp, (4) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 1.5 với cặp primer T3, T7, (5)đối chứng mẫu số 1.5 (đoạn DNA insert).
Mẫu số 2.1 : Sản phẩm PCR trên genome và trên plasmid có trọng lƣong phân tử băng nhau, chứng tỏ đã chèn đƣơc đoạn DNA kých thƣớc 580bp vào plasmid và biến nạp thành công vào vi khuẩn DH5α.
Mẫu số 1.5 : Sản phẩm PCR trên plasmid có kých thƣớc lớn hơn sản phẩm PCR trên genome, kết quả trên band diện di cho thấy sản phẩm này có kých thƣớc tƣơng đƣơng với tổng kých thƣớc của đoạn DNA chèn và kých thƣớc của vùng poly cloning site trên plasmid. Điều này cho thấy phản ứng nối đã không gây ảnh hƣởng khả năng hoạt động của T3, T7 RNA polymerase promoter. Tuy nhiên, mức độ khuyếch đại của phản ứng này thấp, nguyên nhân có thể do bởi phản ứng PCR chƣa hoàn chỉnh
1 2 3 4 5
580bp
857bp
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng áp dụng trực tiếp tại phòng thí nghiêm. Các bƣớc chính trong quy trình là
Chuẩn bị khả nạp
Dịch tế bào chuẩn bị để làm khả nạp phải có mật độ tế bào từ 5 x 107 đến 108 và tiến hành theo quy trình sau :
Bƣớc 1: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút.
Bƣớc 2: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40
C.
Bƣớc 3: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần.
Bƣớc 4: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa.
Bƣớc 5: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40c
Bƣớc 6: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 7: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên.
Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700 C.
Biến nạp plasmid vào khả nạp
Bƣớc 1: Hút 3µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
Bƣớc 2: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ. Bƣớc 5: Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa
kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Bƣớc 6: Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
Quy trình tách chiết plasmid
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C.
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong 1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm.
Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách.
5.2 Đề nghị
Tiếp tục hoàn thiện quy trình theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, chuyển đoạn DNA từ sản phẩm cắt vào tế bào, chuyển một gen hoàn chỉnh vào tế bào chủ và kiểm soát sự biểu hiện của của gen đó.
Nếu trong trƣờng hợp không đủ hoá chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm thì nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm các bƣớc sau :
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200c
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200c, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Hoà tan kết tủa trong 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa.
Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa. Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa trong 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh .
Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan đều. Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi trong 1- 2 phút.
Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf mới.
Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M và thêm 550μl dung dịch isopropanol. Trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C, thu lấy kết tủa.
Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C
Bƣớc 13: Loại bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 14: Hoà tan kết tủa trong TE với lƣợng thích hợp.
TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt
1. Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM.
2. Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning và chỉ thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội bộ trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục.
4. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật 5. Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo
trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM.
Tài lyệu tiếng nƣớc ngoài.
1. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall.
2. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan.
3. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH.
4. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH.
5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques.
Các website 1. http://faculty.plattsbuggh.edu/donald-slysh/transformation.html 2. 12.http://www.mun.ca/Biochem/course/4103/topic/transrormation.html 3. 13.http://cc.suny.edu/faculty/ 4. 14.http://www.fermentas.com/catalog/kits/kittransformaid.html 5. 15.http://www.kings.edu/Biology/lux/bacterial.html 6. 16.http://fruitfly4.aecom.edu/labmanual/27.html