Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel.
Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di
Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV.
Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc).
Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl capture buffer.
Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).
Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.
Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40 C.
Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40
C, lấy cột ra, đậy nắp lại.
Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch.
Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản
phẩm PCR là 5:1.
Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C
Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi.
Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút ở 40c, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại. Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose
0.8% để kiểm tra kết quả tinh sạch