Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Ủ ở 370c từ 16-18 giờ
Dùng que cấy bắt một khuẩn lạc (0.5-1mm) từ đĩa petri đã phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút.
Sau 3giờ nuôi cấy bắt đầu tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600nm, sử dụng môi trƣờng LB lỏng để xây dựng đƣờng chuẩn, lặp lại sau mỗi giờ nuôi cấy.
Ở mỗi thời điểm lấy dịch nuôi cấy để đo OD ta cũng tiến hành đếm khuẩn lạc tại thời điểm đó bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc.
Đếm khuẩn lạc
Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn
Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ
Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nƣớc 100μl dịch nuôi cấy
Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy cho vào eppendorf thứ nhất ta đƣợc nồng đô pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng theo sơ đồ đến nồng độ cần thiết.
Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp. Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Lập lại 3 lần.
Ủ ở 370c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy.
Cách tính
Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100
A =
A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml)
3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) sửa đổi)
Bƣớc 1: Bắt một khuẩn lạc đƣờng kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng.
Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc ở 370C đến khi đạt đƣợc mật độ khoảng 108tế bào/ml
Bƣớc 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút.
Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần.
Bƣớc 6: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa.
Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40 C.
Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên
Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700 C.
Khả nạp chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -70oC. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản
số khuẩn lạc đếm đƣợc * độ pha loãng *1000
khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng.