Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:
NEbuffer 10X 2µl
DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)
dNTPs (33µmol) 1µl
DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750
C trong 20phút.
3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) blunt-end)
T4 DNA lygase không giống nhƣ E.coly DNA lygase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym lygase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10.
Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng lygation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ lygase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó
Phản ứng tạo đầu bằng
chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra.
Cơ sở để tính tỉ lệ về lƣợng vector và DNA insert theo số mol
Đổi từ số mol ra lượng (ng) của phân tử DNA
μg DNA = fmole DNA x x
Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn
(ng)DNA chèn =
Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng
Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau T4 reaction buffer 1µl
DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng)
DNA plasmid 1µl (50ng)
T4 lygase 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 10µl
Ủ phản ứng ở 220c trong 4 giờ, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.