1. Tủ sấy ( vacuum oven ) : điều chỉnh nhiệt độ từ 60ºC 200ºC , dùng để sấy khô , khử trùng các loại dụng cụ chịu đựng được sức nóng khô , chủ yếu là dụng cụ thủy tinh , kim loại . Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thới gian khác nhau , thường sấy ở 160ºC trong 2 giờ hoặc 180ºC trong 30 phút. 2.Tủ ấm ( incubator or etuve ) : Nhiệt độ từ 20ºC 60ºC , có chế độ ổn định nhiệt độ , được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng . Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác nhau để sinh vật có thể phát triển tốt . Ví dụ coliform 30ºC trong 24 48 giờ , E . coli thích hợp ở 44ºC trong 24 – 48 giờ . 3.Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ) : dùng bảo quản môi trường đã pha chế , giống vi khuẩn , các chế phẩm sinh học ( vaccin , huyết thanh , đĩa giấy kháng sinh….) hóa chất , thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường . 4. Nồi hấp ướt ( autoclave ) : Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao ) , được sử dụng để hấp khử trùng môi trường , một số nguyên liệu và dụng cụ thì nghiệm . Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp , thường dùng 121ºC0.8 atm trong 15 phút ; 127ºC1.5 atm trong 30 phút với môi trường đất ; hay 117ºC0.8 atm trong 15 phút với mội trường chứa nhiều đường , mội trường sữa …..
Bài 1: THIẾT BỊ , DỤNG CỤ PHỊNG THÌ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT I.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHỊNG THÌ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Tủ sấy ( vacuum oven ) : điều chỉnh nhiệt độ từ 60ºC - 200ºC , dùng để sấy khô , khử trùng loại dụng cụ chịu đựng sức nóng khơ , chủ yếu dụng cụ thủy tinh , kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy chế độ nhiệt thới gian khác , thường sấy 160ºC 180ºC 30 phút 2.Tủ ấm ( incubator or etuve ) : Nhiệt độ từ 20ºC - 60ºC , có chế độ ổn định nhiệt độ , sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ nhiệt độ khác để sinh vật phát triển tốt Ví dụ coliform 30ºC 24 - 48 , E coli thích hợp 44ºC 24 – 48 3.Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ) : dùng bảo quản môi trường pha chế , giống vi khuẩn , chế phẩm sinh học ( vaccin , huyết , đĩa giấy kháng sinh….) hóa chất , thuốc thử dễ phân hủy nhiệt độ thường Nồi hấp ướt ( autoclave ) : Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao (hơi nước bão hòa áp suất cao ) , sử dụng để hấp khử trùng môi trường , số nguyên liệu dụng cụ nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng chế độ nhiệt độ áp suất thích hợp , thường dùng 121ºC/0.8 atm 15 phút ; 127ºC/1.5 atm 30 phút với môi trường đất ; hay 117ºC/0.8 atm 15 phút với mội trường chứa nhiều đường , mội trường sữa … Bảng 1.1.Tương quan thể tích mơi trường thời gian hấp tiệt trùng 121ºC Thể tích mơi trường ni cấy Thời gian hấp tiệt trùng (ml) tối thiểu ( phút ) 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63 Bảng 1.2.Tương quan áp suất ( số áp kế nồi hấp ) nhiệt độ Chỉ số áp kế nồi0,0 0,2 0,4 0.5 0,6 0,7 0,8 0.9 1,0 1,5 2,0 áp suất (atm) Nhiệt độ sôi 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 nước (ºC) Nhiệt độ sôi nước 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 (ºF) 5.Cân phân tích điện tử (analytical balance ):cận trọng trường từ 100µg200g độ xác 10-4 Cân kỹ thuật ( technical balance ): độ sác 10 -2 g Dùng cân hóa chất , mơi trường Trong q trình sử dụng , khơng đặt trọng lượng khoảng lên cân 6.Tủ sấy vô khuẩn có đèn cực tím (flux laminar ) : có khơng gian vô trùng để sử dụng để thao tác với sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại phận thổi khí vơ trùng 7.Máy ly tâm (centrifuge) :dùng tách chất pha rắn – lỏng khỏi tách sinh khổi tế bào khỏi môi trường nuôi cấy , tách hồng cầu , enzyme… Khi sử dụng , ống ly tâm cần đặt đối xứng thiết phải có khổi lượng 8.Máy lác ( shaker ) : Thiết bị dùng để nuôi cấy , nhân giống sinh vật cách lắc bình ni cấy theo kiểu khác ( lác vòng lác ngang ) cách đểu đặn để tăng lượng oxi hóa mội trường 9.Kính hiển vi ( microsope ) :Có vai trị quan trọng nghiên cứu vi sinh vật Dùng nghiên cứu , quan sát tế bào sinh vật đặc điểm hình thái , sinh lí nhờ vào khả phóng đại kính ( giới thiệu chi tiết sử dụng kính hiển vi) 10 Máy đo pH ( pH meter ) : Đo pH dung dịch , môi trường nuôi cấy sinh vật 11 Máy cất nước (single/double water stills ): Dùng để cất nước 12 Bể ổn nhiệt (water bath ): chứa nước cài đặt nhiệt độ định để ổn định nhiệt độ cho thí nghiệm cần ổn định nhiệt độ 13 Nồi lên men (fermenter/bioreactor) :thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật điều kiện tối ưu hóa điểu chỉnh thông số môi trường nuôi cấy 14 Các thiết bị khác :máy đếm vi sinh vật , máy quang phổ , sấy đông khô… 15 Dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác hình tam giác,ống nghiệm ,đĩa petri , lam kính , đũa thủy tinh , qua trang , ống đong , cốc đong , bình định mức … Yêu cầu phải , ,trung tính Trước dùng đựng mơi trường phải sấy khô , làm nút khử trùng tủ sấy khơ -Phiến kính ( lame ) : dùng làm tiêu quan sát hình thái , sinh lý tế bào vi sinh vật -Lá kính ( lamelle ) : dùng để đậy lên vết bôi tiêu cố định vi sinh vật trình nghiện cứu -Hộp lồng ( đĩa petri ): dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái , đặc điểm nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật -Que gạt ( que trải ) : dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa -Que cấy : Gồm có ba loại : que cấy đầu trịn :dùng để thao tác vi sinh đối tượng đơn bào vi khuẩn , nấm men Que cấy nhọn : dùng cấy sau môi O -micro pipette : sử dụng cần hút lượng xác mơi trường sử dụng định lượng vi sinh vật -Pipette Pasteur : dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy Các dụng cụ cần ngâm nước dung dịch H 2SO4 lỗng giờ.Sau rửa lại nước xà phòng nhiều lân pH trung tính Các dụng cụ qua sử dụng cịn chứa mơi trường vi sinh vật , cần khử trùng rửa xà phòng , phơi sấy khô Các dụng cụ bị bám bẩn cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài , sau rửa lại nước Thành phần dung dịch sulfocromic K2CrO7 : 60g H2SO4 : 66ml Nước cất đến : 1000ml Cách pha + Hòa tan 60g K2CrO7 vào 700ml nước cất , đặt bình vào chậu nước để tránh bị bỏng bồ sung axit +Bổ sung từ từ 66ml dung dịch H 2SO4 vào dung dịch K2CrO7 đến tan hết + Bổ sung nước cất vừa đủ 1000ml Bảo quản bình tối màu , tránh ánh sáng để dùng dân -Dụng cụ đưa lên ánh sáng khơng có vết mờ vết bợm - Các dụng cụ khác : đẻn cồn , giá ống nghiệm , que cấy , kẹp , kéo , bơm tiêm nhựa , đầu tuýt , bếp điện … II CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH VẬT 1.Nguyên tắc Diệt trùng hay khử trùng phương pháp nhằm ức chế loại bỏ , cuối giết chết vi sinh vật không mong muốn Người ta thường khử trùng hai phương pháp 2.Phương pháp a) Phương pháp lý học Nhiệt khô -Đối với dụng cụ cấy kim loại , thủy tinh , phương pháp thường dunglà đốt ,: đốt trực tiếp lựa nhúng cồn đốt - Đối với dụng cụ thủy tinh gói giấy cà sấy 160ºC – 180ºC 30 phút Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu nhiệt độ cao không buộc giây nhựa thung Nhiệt ẩm -Phương pháp luộc : cho vật khử trùng vào nước sôi , nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết , dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên , diệt tế bào sinh dưỡng , bào tử -Phương pháp Pasteur : diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ) , không diệt bào tử , vi khuẩn hoại sinh Phương pháp khơng giệt hồn tồn mầm bệnh mà chọn số vi sinh vật đối kháng mạnh Vì , phải biết nhiệt độ thời gian diệt trùng cho loại vi sinh vật Phương pháp thường dùng nhiệt độ 70ºC – 75ºC thới gian 10 – 15 phút -Phương pháp tyndall : đun cách thủy nhiều lần nhiệt độ 70-80ºC , lần 30 – 60 phút liên tiếp ba ngày liền -Phương pháp nước bão hòa áp suất cao : dùng autoclave Nhiệt độ thời gian hấp tùy thuộc vào nguyên liệu cần hấp Thường dùng nhiệt độ 121ºC thời gian 15 – 30 phút Diệt trùng xạ -Tia tử ngoại hay UV : sát trùng bề mặt , không xuyên sâu vào mẫu vật -Tia âm cực : dùng diệt trùng dụng cụ giải phẫu , thuốc thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kín Sóng ngẳn tác động với cường độ thời gian thích hợp phá vỡ tế bào vi sinh vật , làm chết tế bào sông Diệt trùng cách lọc -Dụng cụ lọc thường màng xốp sứ , aminate , cellulose… có kích thước lỗ lọc từ 0,2- 0,45µm thường để lọc vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt -Đối với khử trùng khơng khí thiết bị khử trùng mốt máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn b) Phương pháp hóa học -Chất sát khuẩn ngồi da: xà phịng, cồn, iode, phẩm màu -Chất diệt khuẩn tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor III.THỰC HÀNH CHUẨN BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 1.Chuẩn bị ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với dung tích nhỏ , ni cấy vi sinh vật môi trường lỏng mội trường thạch , thử tính chất sinh hóa vi sinh vật … Đối với nghiệm khơng sẵn nắp ( nắp nhựa , nắp cao su , nắp inox….) , sinh viên tiến hành làm nút đậy khơng thấm nước bao gói bên ngồi giấy , yêu cầu nút đạy bao ngồi giấy sau -Nút bơng có độ chặt vừa phải đảm bảo độ kín thuận tiện cho q trình thao tác mở đậy Kích thước phần bên ống nghiệm nút khoản , 1,5-2 cm , phần bên khoảng 0,5cm Đầu nút nhẵn , không gấp nếp xù tơ lơng - Bao giấy phải trùm kín nút ống nghiệm với độ chặt vừa phải Mép giấy bên phải gấp chéo để thuận tiện cho trình tháo đậy lại 2.Chuẩn bị đĩa petri Đĩa petri chủ yếu dùng để nuôi cấy , phân lập chung vi sinh vật làm test chuẩn đoán , kháng sinh đồ khoanh giấy , thử nghiệm tính cạnh tranh chủng vi sinh … Trên môi trường thạch dinh dưỡng , mà qua ta quan sát hình thái , tính chất khuẩn lạc quần thể vi sinh vật Trước sử dụng đĩa petri rửa , sấy khô sau bao gói sấy hấp tiệt trùng Chuẩn bị pipette Dùng để đong , hút dung dịch cần có độ xác cao Có nhiều loạipipette thủy tih khác nhau pipette Pasteur , pipette có chia vạch thơng thường ….được thiết kế cho phù hợp với mục đích nghiện cứu Hiện , phịng nghiệm nghiện cứu sinh vật gây bệnh nghiêm cấm việc hút pipet mồm, thay người ta dùng boa cao su , bóp hút an tồn ba van , dùng piprtte hút tự động (popette aid ) micropipette 4.Chuẩn bị bình tam giác Thường sử dụng để chuẩn độ , chứa đựng môi trường , dung dịch , nuôi cấy sinh vật , thực phản ứng … Bình tam giác , thường có thể tích từ 50ml đến 10 lit tùy theo dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp Trước sử dụng , bình tam giác cần rửa , sấy khơ bao gói , nút đậy bính làm bơng khơng thấm nước Yêu cầu nút đậy phải tới phần cổ bình đảm bảo độ kín tránh tạp nhiểm tối đa IV.NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý -Không làm vụn không thấm làm nút đậy cho dụng cụ ơng nghiệm , bình tam giác -Khi nút bơng gịn vào pipette , độ chặt phải vừa đủ phải kiểm tra khả hút dung dịch pipette sau hút xong -Kích thước nút đậy ống nghiệm , bình tam giác phải phù hợp , tiện dụng V.BÁO CÁO THỰC TẬP 1.Trình bày yêu cầu việc bao gói dụng cụ ni cấy vi sinh vật -Phần giấy bao bên ngồi phải kín chặt -Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt -Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy báo bao kín tồn Có thể dùng hộp nhôm để đựng dụng cụ để khử trùng 2.Công dụng cách sử dụng dụng cụ , thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh vật (Mục I: Thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm vi sinh vật học) 3.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật Có phương pháp: a) Phương pháp lý học Nhiệt khô -Đối với dụng cụ cấy kim loại , thủy tinh , phương pháp thường dunglà đốt , đốt trực tiếp lựa nhúng cồn đốt - Đối với dụng cụ thủy tinh gói giấy cà sấy 160ºC – 180ºC 30 phút Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu nhiệt độ cao không buộc giây nhựa thung Nhiệt ẩm -Phương pháp luộc : cho vật khử trùng vào nước sôi , nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết , dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên , diệt tế bào sinh dưỡng , bào tử -Phương pháp Pasteur : diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ) , không diệt bào tử , vi khuẩn hoại sinh Phương pháp khơng giệt hồn toàn mầm bệnh mà chọn số vi sinh vật đối kháng mạnh Vì , phải biết nhiệt độ thời gian diệt trùng cho loại vi sinh vật Phương pháp thường dùng nhiệt độ 70ºC – 75ºC thới gian 10 – 15 phút -Phương pháp tyndall : đun cách thủy nhiều lần nhiệt độ 70-80ºC , lần 30 – 60 phút liên tiếp ba ngày liền -Phương pháp nước bão hòa áp suất cao : dùng autoclave Nhiệt độ thời gian hấp tùy thuộc vào nguyên liệu cần hấp Thường dùng nhiệt độ 121ºC thời gian 15 – 30 phút Diệt trùng xạ -Tia tử ngoại hay UV : sát trùng bề mặt , không xuyên sâu vào mẫu vật -Tia âm cực : dùng diệt trùng dụng cụ giải phẫu , thuốc thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kín Sóng ngẳn tác động với cường độ thời gian thích hợp phá vỡ tế bào vi sinh vật , làm chết tế bào sông Diệt trùng cách lọc -Dụng cụ lọc thường màng xốp sứ , aminate , cellulose… có kích thước lỗ lọc từ 0,2- 0,45µm thường để lọc vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt -Đối với khử trùng khơng khí thiết bị khử trùng mốt máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn b) Phương pháp hóa học -Chất sát khuẩn ngồi da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu -Chất diệt khuẩn tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor Bài : PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I.Nguyên tắc Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng hôn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hóa – khử , áp xuất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường Yêu cầu môi trường dinh dưỡng : có đủ chất dinh dưỡng cần thiết ; có độ pH thích hợp ; có độ nhớt định ; khơng chứa yếu tố độc hại ; hồn tồn vô trùng đảm bảo phát triển vi sinh vật Phân loại môi trường dinh dưởng ; người ta dựa sở khác để phân loại môi trường a)Phân loại theo nguồn gốc -Môi trường tự nhiên : dịch nước chiết thịt , nước chiết khoai tây , máu động vật -Môi trường nhân tạo: Czapeck , hansen , EMB … -Môi trường bán tự nhiên : Potato glucose agar (PGA) , giá đậu đường … b)Phân loại theo trạng thái vật lý -Môi trường lỏng : dạng lỏng , khơng có agar hay chất làm giá thể khác thành phần môi trường -Môi trường rắn : 1000ml mơi trường có 15-20g agar hay chất làm giá thể -Môi trường bán lỏng ( bán rắn ) : 1000ml mơi trường có 3-5g agar hay chất làm giá thề khác c)Phân loại theo công dụng -Môi trường phân lập -Môi trường tăng sinh -Môi trường lưu giữ giống -Môi trường thử nghiệm sinh hóa Mơi trường ni cấy vi sinh vật pha chế theo nguyên tắc : -Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hóa chất dinh dưỡng loại sinh vật -Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ chất thành phân môi trường -Đảm bảo điều kiện hóa lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật II DỤNG CỤ , MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT 1.Dụng cụ STT Tên dụng cụ , thiết bị nhóm Đơn vị tính Số ( sinh viên) lượng Gía ống nghiệm Cái Ơng nghiệm Φ18 Cái Bình tam giác Cái 10 11 12 13 14 15 Phễu thủy tinh Đũa khuấy thủy tinh Cốc 100ml Cốc 500ml Đĩa cân nhựa Bình tia Bếp điện Dụng cụ dùng chung Máy đo pH Cân kỹ thuật Cân Phân tích Nồi hấp cao áp Tủ sấy Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 1 3 1 Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 2.Mơi trường hóa chất a)Mơi trường ni cấy vi khuẩn Môi trường cao thịt-peptone -Cao thịt : 3g -Peptone : 10g -NaCl : 5g -Agar : 20g -Thêm nước cất cho đủ 1000ml Lắc , điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2 Nấu sơi nhẹ để agar tan hồn tồn , phân phối mơi trường vào dụng cụ để khử trùng 121ºC 30 phút b)Môi trường nuôi cấy nấm men Môi trường Hansen -Glucose , maltose ( đường kính ):50g -Peptone : 10g -K2HPO4 :3g -MgSO4.7H2O : 2-5g -Agar : 20g -Thêm nước cất đủ ; 1000ml Lắc điểu chỉnh pH 6,0±0,2 Nấu sơi nhẹ để agar tan hồn tồn , phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng 121ºC 30 phút c)Môi trường cấy nấm mốc Môi trường Czapek -Saccarose : 30g -NaNO3 : 3g -K2HPO4 : 1g -MgSO4 :0.5g -FeSO4 :0,01g -Thạch ( agar ) : 20g -Thêm nước cất đầy đủ : 1000ml pH 6,0±0,2 khử trùng atm/30 phút d)Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Môi trường Gauze -Tinh bột tan : 20g -K2HPO4 : 0.5 g -MgSO4.7H2O : 0.5g -KNO3 : 1,0g -NaCl :0.5g -FeSO4 : 0,1g -Agar : 20g -Nước cất đủ : 1000ml pH 7,2 ÷7,4 khử trùng atm thời gian 30 phút e)Môi trường nuôi cấy tảo Môi trường Tamiya -KNO3 : 5,000 -MgSO4 : 2,500 -KH2PO4 : 1,250 -FeSO4.7H2O : 0,003 – EDTA ; 0,037 -Vi lượng Ạ5 : ml -Agar : 20g -Nước cất đủ 1000ml Thành phần vi lượng A5 -H3BO3 : 2,860 -MnCl2.4H2O : 0.222 -MoO3 :176,4 -NH4VO3 : 229,6 -Nước cất đủ 1000ml 3.Nguyên liệu khác -Giấy lọc -Bông không thấm nước -Bơng thấm nước III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Làm môi trường để thực việc phân lập , nhân giống giữ giống vi sinh vật , đồng thời để nuôi cấy cà nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng Các bước để tạo môi trường dinh dưỡng 1.Chuẩn bị dụng cụ Tất dụng cụ cần sử dụng suốt q trình pha chế mơi trường phải chuẩn bị đầy đủ Các dụng cụ rửa , tráng nước cất ,sấy khô trước sử dụng 2.Cân đong hóa chất pha chế mơi trường Cân , đong thật xác thành phân mơi trường cà pha chế trình tự hướng dẫn tài liệu Dùng đĩa cân nhựa hoạc cốc thủy tinh để cân đong loại hóa chất dễ hút ẩm 3.Phối chế tạo môi trường nuôi cấy -Các thành phần mơi trường hịa tan riêng rẽ nước cất trước phôi trộn -Phối trộn thành phần theo trình tự định tránh tương tác trực tiếp thành phần phản ứng tạo kết tủa với Phối trộn dựa nguyên tắc thể tích tăng dần -Sau phối chế thành phần , cần tiến hành học môi trường qua giấy lọc , thấm nước ( môi trường lỏng ) vải ( môi trường đặc ) để làm môi trường , đảm bảo việc quan sát vi sinh vật dễ dàng -Đối với môi trường rắn , sau phối trộn thành phần , phải tiến hành nấu sôi môi trường để làm tan hồn tồn agar trước phần phơi vào dụng cụ chứa 4.Điều chỉnh độ pH mội trường -Muốn điều chỉnh độ pH mơi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10% Ngồi dùng số hóa chất khác : H3PO4 , KOH, H2SO4 … -Muốn kiển tra độ pH môi trường nên dùng máy đo pH (pH – metre ) Phương pháp nhanh nhạy cho độ xác cao Trong thí nghiệm dùng thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH Phương pháp tiện lợi , nhanh cho độ xác cao 5.Phần phối mơi trường vào dụng cụ chứa -Môi trường sau pha chế xong thường phân phối môi trường vào ống nghiệm , bình tam giác Trình tự phân phối gồm bước sau : +Mơi trường cần đun hóa chất lỏng đổ qua phễu thủy tinh vào dụng cụ +Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường , tay phải kẹp nút kéo +Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ đạy nút bơng lại -Đối với ống nghiệm : Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng lượng mơi trường cần phân phối chiếm ¼ tích ống nghiệm Nếu làm thạch đứng lượng mơi trường cần phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm -Đối với bình cấu hay bình tam giác , lượn mơi trường phân phơi chiếm ½-1/3 thể tích bình -Đối với đĩa petri , môi trường phân phối vào đĩa sau tiệt trùng Thể tích mơi trường khoảng 12 – 15 ml đĩa , lớp môi trường thạch dảy khoảng 2mm -Viết nhãn môi trường lên dụng cụ chưa bao gồm thông tin : +Tên môi trường 10 11 12 13 14 Que cấy Cái Bình Tia Tấm Lame ( phiến kính ) Tấm Lamella ( kính ) Tấm Phiến kính lõm Cái Chậu thủy tinh Cái Que thủy tính hình chữ U Cái Kính hiển vi Cái Phiến kính Tấm Lá kính Tấm Dụng cụ dùng chung 15 Nồi hấp cao áp Cái 16 Tủ cấy vơ trùng Cái 17 Bếp điện Cái 2.Hóa chất - Cồn 960 - Dịch xà phịng lỗng - Dung dịch xylen -Thuốc nhuộm xylen -Thuốc nhuộm Fuchsin Zaihl loãng đậm đặc -Thuốc nhuộm Safranin O -Thuốc nhuộm Crystal violet ( tím kết tinh ) - Dung dịch lugol -Dung dịch xanh methy len -Dầu soi kính ( dầu bách dương – dầu cede ) * Dung dịch tím kết tinh ( crystal violet – C 25H30N3Cl.9H2O = 570,11 ):2 g tím kết tinh hịa tan 20 ml ethanol 95% ; 0,8g ammon axalat hòa tan 80ml nước cất Trộn hai dịch nói lại với , giữ 48h lọc Bảo quản lọ tối , sử dụng vài tháng *Dung dịch lugol : hòa tan g lugol 3-5 ml nước cất , thêm 2g KI ( potassium iodide ) , khuấy cho tan hết thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản lọ tối * Dung dịch tẩy màu : ethanol 96% trộn hổn hợp 70 ml ethanol 96% với 30 ml aceton trộn 100ml ethanol 96% với 4ml I2 10% *Dung dịch nhuộm bổ sung : Chuẩn bị sẳn sàng dung dịch safranin O ( C20H19N4Cl = 350.08 ) 2,5% , trước dùng pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 ( vol/vol) để có dung dịch 0,5% Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin Ziehl : Fuchsin kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ) g , pphenol 5g , ethanol 90% 10ml , nước cất 200 ml ( hòa tan fuchsin với ethanol ; hòa tan phenol với nước cất sau trộn lại ) * Dung dịch xanh methylen : hòa 1g xanh methylen vào 10 ml ethanol 96% Bổ sung nước cất đủ 100 ml * Dung dịch lục malachite 50% : Hòa 5h lục malachite vào 100ml nước cất *Thuốc nhuộm Nishikawa Kangen -Dung dịch A : Hỏa tan 5g acid tanic vào 100 ml nước cất , vừa khuấy vừa bồ sung thêm theo thứ tự 1,5g FeCl3 , ml formalin , ml NaOH 4% Giữ trai màu -Dung dịch B : Hòa tan 2g AgNO3 vào 100 ml nước cất Lấy 10 ml cho vào cố , thêm giọt NH 4OH lác dung dihc5 trở lên suốt dừng lại ( khoảng – giọt ) Đổ dung dịch vào phân lại dung dịch B , lác Giữ chai màu * Dung dịch Carbon Fuchsin : - Dung dịch Fuchsin kiềm bão hòa nước cất ( 10% ) : 10 ml - Dung dịch acid carbolic 5% nước cất : 100 ml Trộn hai dung dịch cới 3.Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát -Nấm mốc : Aspergillus niger , Aspergillus oryea -Nấm men : Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces vini -Vi khuẩn : Escherichia coli , Bacillus subtilis 4.Nguyên liệu khác - Giấy lọc -Bơng khơng thấm -Bơng thấm nước -Giấy lau kính III.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1.Làm tiêu nhuộm màu vi sinh vật không cố định -Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính -Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật hịa sinh khối vi sinh vật vào giọt thuốc nhuộm -Đậy kính lên giọt dịch -Quan sát tiêu vật kính (x10) (x40) 2.Làm tiêu nhuộm màu vi sinh vật cố định Có cách nhuộm : -Nhuộm đơn : dùng loại thuốc nhuộm tiêu -Nhuộm kép : Dùng đồng thời hai tay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu ( nhuộm Gram , nhuộm bào tử , nhuộm ziehl – Neelsen …) Quy trình nhuộm thực sau a)Tạo vết bôi cố định vi sinh vật -Lau nhẹ tiêu giấy mềm , hơ qua đèn cồn -Dùng bút chì mỡ bút lơng ghi tên mẫu , vẽ vịng trịng đường kính xấp sỉ 15 mm , mặt lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía lame -Đốt nóng đỏ que cấy ( trước sau thao tác ) , mở nút , hơ nhanh miệng ống nghiệm Trường hợp : Mẫu nuôi cấy canh dinh dưỡng , đưa đấu que cấy vào miệng ống nghiệm ( giữ gần lửa ) , nhúng vào dung dịch canh cấy , lấy vòng que cấy Lấy que cấy , hơ nhanh miệng ống nghiệm hút , đậy nút lại Phết canh khuẩn vòng que cấy vào mặt lam , vòng tròn , dàn xung quanh Trường hợp : mẫu nuôi cấy thạch dinh dưỡng , nhỏ dọt dung dịch NaCl %0 lên vòng tròn ( mặt trền lam ) Thao tác trường hợp , dùng cạnh vòng tròn đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn , đặt vào giọt NaCl 9% lam , dàn mỏng -Cố định mẫu : Mục đích giết chết vi khuẩn , làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame làm vết bơi bắt màu tốt tế bào chết bắt màu tốt tế bào sống Cố định mẫu cách để khô tự nhiên hơ nhanh lửa đẻn cồn b)Nhuộm đơn -Đặt tiêu vi sinh vật cố định lên que thủy tinh hình chữ U ( đặt nằm ngang miệng trậu thủy tinh ) - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl , để yên từ đến phút -Rửa vết bơi cách nghiêng phiến kính , dùng bình sịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bơi nước chảy khơng cịn màu -Dùng giấy thấm khô tiêu hơ nhẹ tiêu lên đèn cồn -Quan sát tiêu vật kính x40 chuyển sang vật kính x100 dùng dầu soi c) Phương pháp nhuộm Gram Nhuộm gram phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt lồi vi khuẩn thành hai nhóm gram dương ( gram posivive ) gram âm ( gram negative ) dựa đặc tính hóa lý thành tế bào Phương pháp đặt tên theo tên người phát minh nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram ( 1853-1938) Ông phát triển kỹ thuật vào năm 1884 , sau Hucker nhiều người khác cải tiến Quy trình nhuộm gram sau : -Đặt tiêu vi sinh vật cố định que thủy tinh hình chữ U ( đặt nằm ngang miệng trậu thủy tinh ) Đặt lên bề mặt vết bôi giấy thấm -Nhuộm dung dịch tím kết tinh 30 giây ( vừa thấy màu ) , rửa nước -Cẩn màu tím kết tinh lên tế bào vi sinh vật cách thêm dung dịch lugol phút , rửa nước -Nhỏ dịch tẩy màu , giữ khoảng 30 giây ( vừa thấy màu ) , rửa nước - Nhuộm bổ sung màu dung dịch safranin O Fushin Ziehl phút , rửa nước , làm khô Lần nhuộm hai nhóm vi khuẩn đểu bắt thuốc nhuộm, vi khuẩn gram dương không bị thay đổi nhiều , vi khuẩn gram âm thay đổi màu đỏ vàng ( nhuộm Safranin O ) hay đỏ tía ( Fuchsin Ziehl ) -Quan sát tiêu vật kính đầu x90 hay x100 Nếu nhuộm vi khuẩn gram dương bắt màu xanh đen hay tím , gram âm bắt màu đỏ vàng ( nhuộm safreanin) hay đỏ tía ( fuchsin) Xem tiêu vật kính x90, x100 -Nâng tụ quang kính lên sát tiêu , mở cường độ sáng tối đa ( thị trường sáng ) -Xoay vật kính x100 vào khớp trụ đỡ vật kính ( hướng vật kính vào tụ quang ) -Nhỏ giọt đầu soi vào tiêu -Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu ( khơng nhìn vào thị kính ) , hay tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu , vừa chạm vào tiêu dừng lại -Đặt mắt hướng vào thị kính , hao tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng xa tiêu mắt thấy rõ dần tiêu mẫu vật dừng lại -Mắt hướng vào thị kính , điều chỉnh lần khoảng cách tụ quang kính với tiêu chỉnh chắn sáng cho ảnh rõ d)Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen ( Nhuộm khác acid –Dùng phân biệt vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với vi khuẩn khác ) Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ bao sát bao bọc nên nhuộm phức hợp màu carbolfuchsin , phức hợp không bị tẩy màu dung dịch tẩy màu mạnh ( acid , alcol acid ) Tuy nhiên để phức hợp màu thấm xuyên qua lớp vỏ sáp vi khuẩn , có hai cách : (1) đung nóng phết nhuộn với dung dịch màu carbon fuchsin , nhờ cà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn : phương pháp nhuộm nóng Ziehl – Neelsen (2) Phương pháp thứ nhuộm lạnh gọi phương pháp Kinyoun Trong phương pháp , người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc , phủ dung dịch màu đậm đặc lên phết nhuộm với thời gian lâu , carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn Quy trình nhuộm sau : -Đặt tiêu phết kính cố định mẫu lên thủy tinh chữ U , đặt chậu nhộm , bếp điện -Đặt miếng giấy lọc lên vịng phết kính -Nhỏ dung dịch Fuchsin đậm đặc thấm ướt hết giấy lọc luộn thấm ướt -Rửa nước , thấm khô -Tẩy cồn – acid đến cồn khơng cịn màu hồng fuchsin đậm đặc ( khoảng 30 giây ) , rửa nước -Nhuộm bổ sung xanh methylen thời gian phút -Rửa nước , thầm khơ -Quan sát vật kính đầu x90 hay x100 -Vi khuẩn lao ( vi khuẩn kháng acid ) bắt màu hồng đỏ cánh sex fuchsin , vi khuẩn khác bắt màu xanh methylen e)Nhuộm bào tử Một số vi khuẩn Bacillus hay Clostridium có khả tạo thành bào tử Bào tử tồn môi trường thiếu chất dinh dưỡng , chịu nhiệt số hóa chất mà thể sinh dưỡng không thê Bào tử khó nhuộm đa số thuốc nhuộm màng bào tử dày , , khó bắt màu chưa nhiều lipid Vì , cần thiết phải có phương pháp nhuộm đặc biệt bào tử Tuy nhiên phương pháp tế bào trước hết sử lý nhiệt hay / acid để tế bào chất bào tử dể bắt màu Sau đó, nhuộm tế bào cửa chất bào tử tế bào có thuốc nhuộm có tính hoạt nhuộm mạnh tẩy màu tế bào chất Cuối nhuộm với chất nhuộm phân biệt khác Khi , tế bào chất mang màu , bào tử mang màu khác Đôi bào tử nhìn thấy bên tế bào Hình thái bào tử cịn giúp nhận diện vi khuẩn Hình dáng kích thước bào tử phụ thuộc vào vị trí sinh dưỡng ba vị trí khác : Nếu nắm tâm tế bào gọi bào tử kiểu Bacillus , Nếu nắm lệch tâm – kiểu Clostridium nằm cực tế bào gọi bào tử kiểu Plectidium.Ở số giống vi khuẩn khác , bào tử tồn tế bào xung quanh tan rã Có thể dùng ba hỗn hợp thuốc nhuộm sau để nhuộm bào tử : -Lục malachite thuốc nhuộm safranin -Fuchsin , HCl 0,5% , H2SO4 1% xanh methylene ( Loeffler ) -Xanh methylene đỏ trung tính Quy trình nhuộm sau : *Với thuốc nhuộm lục malachite thuốc nhuộm safranin -Chuẩn bị vết bơi phiến kính hơ nóng nhẹ - Thêm nước vào chậu nhôm đun sôi - Đặt giá nhuộm lên chậu nhơm đặt phiến kính lên - Đặt nhẹ mẫu thấm giấy ( nhỏ phiến kính chút ) lên phiến kính Mẫu giấy giúp giữ thuốc nhuộm lại phiến kính - Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite nước vòng phút -Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khơ phiến kính - Khử màu với nước 30 giây cách cho nước chảy lên phiến kính Các tế bào sinh dưỡng bị màu , bào tử giữ màu lại - Nhuộm lại với safranin 30 giây rửa lại với nước 30 giây Thấm khô cẩn thận Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu x100 Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưởng có màu hồng Ghi lại kết *Với thuốc nhuộm Fuchsin , HCl 0,5 , H2SO4 1% xanh methylene -Làm vết bơi trơn phiến kính để khơ tự nhiên -Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bơi , hơ nóng lửa đẻn cồn cho bốc khoảng phút rửa với nước -Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin , qua miếng giấy lọc , hơ nóng bốc vịn phút - Rửa vết bơi nước -Tẩy màu dung dịch H2SO4 1% Trong phút -Rửa vết bôi nước -Nhuộm vết bôi xanh methylene 5- 15 phút -Rửa lại với nước đề khơ tự nhiên -Quan sát kính hiển vi với vật kính đầu ( x100) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu đỏ Ghi lại kết f)Phương pháp nhuộm tiêu mao Tiên mao quan di động vi khuẩn Tiê mao có kích thước mỏng , chiều rộng khoảng 0,01 – 0,05 µm , chiều dài thay đổi tùy lồi Một số lồi có tiên mao ( đơn mao ) , số lồi đầu có sợi ( song mao ) số có trùm đậu đầu ( chùm mao ) số khác có tiên mao mọc khắp xung quanh tế bào ( chu mao )… Vì tiên mao mảnh nên phải nhuộm phương pháp đặc biệt với nguyên tắc tăng đường kính tiên mao cách trầm hóa chất thuốc nhuộm tiên mao Thao tác phải nhẹ nhàng , thận trọng Thường sử dụng hỗn hợp thước nhuộm Nishizawa Kangen Quy trình nhuộm sau : -Chuẩn bị giống vi khuẩn nuôi môi trường thạch 16 – 18 -Chuẩn bị vết bơi sinh vật lame kính -Để vết bơi khơ tự nhiên khơng khí , khơng đốt -Nhuộm dung dịch A 15 phút -Rửa lame kính để làm thuốc nhuộm : Đặt nghiêng lame kính vào cốc nước đầy Nghiêng cốc nước phía kính để vịng thuốc nhuộm tách xa lame kính rút từ từ lame kính lên -Nhuộm dung dịch B 10 – 15 phút Theo dõi đến vết bôi bắt đầu nâu rõ dừng lại -Nhúng từ từ lame kính vào cốc nước , giữ 30 giây lấy lame kính -Để khơ tự nhiên -Quan sát với vật kính x100 Tiên mao vi khuẩn có màu hồng nâu IV.NHỮNG ĐIỀU CẦN LƯU Ý -Tuổi giống phải thích hợp : cần chuẩn bị giống trước nhuộm từ 16 đến 24 ni nhiệt độ thích hợp , tế bào già thường thường khả giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh tẩy ethanol -Vỏ nhầy số vi khuẩn có ảnh hưởng đến kết nhuộm Gram Để nhuộm Gram cần nuôi chúng môi trường chứa đường để hạn chế việc hình thành vỏ nhầy -Khử màu bước quan trọng cần kĩ định , khả nẳng bắt màu Gram dương “ tất không” -Không hơ lam có vết bơi vi sinh vật nóng lên lửa ,có thể làm cháy làm thay đổi hình dạng tế bào vi sinh vật V.BÁO CÁO THỰC TẬP 1.Sau nhuộm , vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím , Gram đen có màu đỏ vàng hay đỏ tía Giải thích ngun nhân ? Q trình nhuộm trải qua loại thuốc nhuộm: -Nhuộm dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím -Nhuộm tiếp dung dịch lugol để màu tím dung dịch tím kết tinh gắm chặt vi khuẩn -Khi phủ lên dung mơi hữu Etanol, Axetol vi khuẩn Gram âm bị tẩy, lipit lớp màng bị tan làm tăng tính thấm màng dẫn đến rửa trơi phức chất tím tinh thể- Iot làm cho vi khuẩn màu Khi nhuộm bổ sung chúng bắt màu với thuốc nhuộm( màu đỏ vàng safranin, đỏ tía fuchsin) Đối với Giam dương, dung môi hữu làm cho lỗ peptidoglican co lại phức tím tinh thể Iot bị giữ lại tế bào 2.Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm safranin fuchsin , vi khuẩn Gram âm có màu ? Tại ? Nếu khơng nhuộm bổ sung vi khuẩn Gram âm khơng có màu, vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trị chất làm tan màng ngồi thành tế bào, có chất lipide Lớp peptidoglycan mỏng khơng thể giữ lại phức hợp tím tinh thể - iot tế bào Gram âm bị khử màu 3.Vẽ hình thị trường kính hiển vi có sinh vật trường hợp nhuộm vi sinh vật không cố định nhuộm vi sinh vật cố định BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I.NGUYÊN TẮC Phân lập vi khuẩn trình tách rời loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật sau gieo chúng lên bề mặt mơi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc Sau ủ điều kiện thích hợp , vi sinh vật phân chia nhiều lần tạo thành quần thể mọc riêng biệt gọi vi khuẩn lạc Một tế bào bào tử khuẩn lạc cấy truyền vào ống môi trường giữ giống ủ điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể Quần thể vi sinh vật ống nghiệm gọi chủng vi sinh vật ông giống Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Chủng vi sinh vật khiết ( hay gọi chủng ) hiểu hệ , cháu , dịng có nguồn gốc từ tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa khiết khuẩn lạc có thề hình thành nhiều tế bào , bào tử , phải làm nhiều lần thu chủng vi sinh vật thuẩn khiết Qúa trình phân lập vi sinh vật dạng khiết : với hầu hết loại mẫu nghiên cứu ,quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau : -Lựa chọn vùng phân lập vi sinh vật -Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu : -Phân lập vi sinh vật khiết ; -Kiểm tra độ khiết khuẩn lạc II.DỤNG CỤ , MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT 1.Dụng cụ STT Tên dụng cụ thiết bị nhóm Đơn vị tính Số lượng ( thành viên ) Gía ống nghiệm Cái Ống nghiệm Φ18 Cái Bình tam giác Cái Phễu thủy tinh Cái Đũa khuấy thủy tinh Cái Cốc 100 ml Cái Đĩa cân nhựa Cái 10 11 12 13 14 15 16 Bình tia Cái Bếp điện Cái Pipette ml Cái Pipette 10 ml Cái Qủa bóp cao su Cái Micropipelle 100 - 1000µl Cái Đầu tuýp 1000mm Cái 10 Đĩa petri 90mm Cái Que trải vi sinh vật Cái Dụng cụ dùng chung 17 Máy đo pH Cái 18 Cân kỹ thuật Cái 19 Cân phân tích Cái 20 Nồi hấp cao áp Cái 21 Tủ sấy Cái 22 Tủ ấm Cái 2.Mội trường hóa chất - Mơi trường cao thịt – pepton : dùng để nuôi cấy phan lập vi khuẩn - Môi trường hansen : dùng để nuôi cấy phân lập nấm mem - Môi trường Czapeck : dủng để nuôi cấy phân lập nấm mốc 3.Nguyên liệu khác - Đất vườn : 100g - Qủa nho chín : 100g - Thịt tươi : 50g - Bông không thấm - Bơng thấm nước III.TIẾN HÀNH THÌ NGHIỆM a)Nguồn phân lập nấm mốc -Một số chủng nấm mốc Aspergillus oryzae , Aspergillus niger Mucor… phân lập loài nấm mốc cơm nguội , xơi làm mốc tương , bánh mì để khơ ngày -Thông qua màu sắc mốc để nhận diện + Mốc có màu trắng : Có thể Mucor hay Rhizopus + Mốc có màu đen Aspergillus niger +Mốc có màu xanh lục Penicillium italicum Loại mốc thường có vỏ cam , chanh để lâu ngày b)Nguồn phân lập nấm mem - Có thể phân lập nấm men dể dàng từ môi trường : Bề mặt trái dịch ép số loại trái táo ,lê , nho ,dâu ,trong rượu nết , bánh men rượu , bia , nước mía , kefia - Nấm mem sau quan sát kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào kích thước lớn , có khả nảy chồi Khuẩn lạc có màu trắng sữa c) Nguồn phân lập vi khuẩn -Có thể phân lập vi khuẩn tử đất , nước giải khát ( nước mía ) , nước thải , thực phẩm tươi ( thịt , sữa tươi , rau tươi …) thực phẩm vị ôi thiu 2.Kỹ thuật nuôi cấy tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật môi trường phân lập a)Yêu cầu -Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đưa dạng lỏng cách : +Nghiền mẫu +Hòa tan mẫu nước cất vô trùng , sau thực mẫu dạng lỏng +Thực pha loãng theo phương pháp pha loãng thập phân đạt nồng độ cần thiết +Cấy mẫu môi trường đặc trưng -Nếu nguồn mẫu thập phân dạng lỏng cấy trực tiếp pha loãng để làm giảm mật độ b)Các phương pháp tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí - Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng : kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc , kỹ thuật ria tia , kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn thực sau : Kỹ thuật hộp ria -Dùng que vịng thao tác vơ trùng thu giống -Ria đường đĩa petri chứa mơi trường thích hợp ( ria chữ T ria bốn góc Saumỗi đường ria , đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria -Bao gói đĩa petri , ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp trải - Dùng micropipette đầu tuýt vô trùng , thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa petri -Nhúng đầu gạt ( que trải ) thủy tinh vào cồn 70º , hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa -Mở đĩa petri , đặt nhẹ gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay , trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải thực xoay đĩa vài lần , lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường -Rút gạt khỏi đĩa , đậy đĩa , gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp đổ -Dùng micropipette đầu tuýt vô trùng , thao tác vô trùng chuyển m dịch chứa giống lên bề mặt môi trường trọng đĩa petri -Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trường đun chảy nguội đến 45 – 55 ºC vào đĩa petri cấy mẫu -Xoay nhẹ đĩa petri chiều ngược chiểu kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy -Đậy nắp đĩa petri , để đông tự nhiên c) Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn từ vi sinh kị khí -Dùng mơi trường đặc ống nghiệm đem chúng trưng cách thủy để loại bỏ khơng khí mơi trường -Để nguội mội trường cịn 45 – 50 ºC -Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường , đậy nút lại , lác trịn quanh trục ống nghiệm -Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa petri đậy thật nhanh nắp lại , cho mặt lắp mơi trường khơng cịn khơng khí -Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc hai nắp đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp -Ni bình yểm khí : sau cấy vi khuẩn xong , cho vào bình yểm khí Thoa lớp parafin lỏng lên miệng bình , đốt đèn cồn hay đèn cầy lên đặt vào bình, đậy nắp lại , dùng máy hút chân không túi kị khí Cho vào tủ ấm, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp -Sau vi sinh vật phát triển , chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường dùng que cấy cắt khối mơi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 3.Phân lập khiết -Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời đĩa petri vào ống môi trường thạch nghiêng -Nuôi vi sinh vật nhiệt độ thời gian thích hợp -Loại bỏ ống bị nhiễm , chọn ống có chủng thuẩn khiết 4.Kiểm tra độ khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra a)Kiểm tra cách quan sát vết cấy -Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy môi trường đặc -Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng , chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại -Nếu vết cấy khơng loại bỏ b)Kiểm tra độ chủng loại khuẩn lạc -Trọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng -Tách khuẩn lạc hóa tan , pha loãng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng -Nhỏ giọt dịch vào đĩa petri có mơi trường -Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp thạch đĩa petri thứ , đĩa thứ , thứ -Đặt đĩa petri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật -Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ , khiết khuẩn lạc khiết giống c)Kiểm tra kính hiển vi -Lấy sinh khối sinh vật từ ống nghiệm phân lập , làm tiêu sống , tiêu nhuộm màu quan sát kính hiển vi -Sự đống hình dạng , kích thước , màu sắc tế bào vi sinh vật biểu khiết giống vi sinh vật vừa phân lập IV.NHỮNG ĐIỀU CẦN CHÚ Ý -Các hộp thạch môi trường phải vô trùng có bề mặt kho nước có độ răn chắc, không gồ ghề , giúp khuẩn lạc vi khuẩn mọc rời -Đề phòng nhiễm tạp khơng khí bẩn , thao tác phải tuyệt đối vô trùng -Các chủng sau làm cần kiểm tra lại cách quan sát hình dạng tế bào kính hiển vi xác định lại hoạt tính biết -Việc tao chủng vi khuẩn khiết bảo quản khỏi bị tạp nhiễm việc làm có ý nghĩa lớn học tập , nghiên cứu sản xuất V.BÁO CÁO THỰC TẬP 1.Trình bày nguyên tắc phương pháp phân lập vi khuẩn khiết Nguyên tắc: -Gieo cấy vi sinh vật pha loãng môi trường dinh dưỡng đặc trưng -Nuôi dưỡng điều kiện thích hợp cho mọc khuẩn lạc tách biệt -Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn khiết Phương pháp: Qúa trình phân lập vi sinh vật dạng khiết : với hầu hết loại mẫu nghiên cứu ,quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau : -Lựa chọn vùng phân lập vi sinh vật -Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu : -Phân lập vi sinh vật khiết ; -Kiểm tra độ khiết khuẩn lạc Các phương pháp tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí - Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng : kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc , kỹ thuật ria tia , kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn thực sau : Kỹ thuật hộp ria -Dùng que vòng thao tác vô trùng thu giống -Ria đường đĩa petri chứa mơi trường thích hợp ( ria chữ T ria bốn góc Saumỗi đường ria , đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria -Bao gói đĩa petri , ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp trải - Dùng micropipette đầu tuýt vô trùng , thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa petri -Nhúng đầu gạt ( que trải ) thủy tinh vào cồn 70º , hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa -Mở đĩa petri , đặt nhẹ gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay , trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải thực xoay đĩa vài lần , lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường -Rút gạt khỏi đĩa , đậy đĩa , gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp đổ -Dùng micropipette đầu tuýt vô trùng , thao tác vô trùng chuyển m dịch chứa giống lên bề mặt môi trường trọng đĩa petri -Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trường đun chảy nguội đến 45 – 55 ºC vào đĩa petri cấy mẫu -Xoay nhẹ đĩa petri chiều ngược chiểu kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy -Đậy nắp đĩa petri , để đông tự nhiên c) Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn từ vi sinh kị khí -Dùng mơi trường đặc ống nghiệm đem chúng trưng cách thủy để loại bỏ khơng khí mơi trường -Để nguội mội trường cịn 45 – 50 ºC -Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường , đậy nút lại , lác trịn quanh trục ống nghiệm -Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa petri đậy thật nhanh nắp lại , cho mặt lắp mơi trường khơng cịn khơng khí -Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc hai nắp đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp -Ni bình yểm khí : sau cấy vi khuẩn xong , cho vào bình yểm khí Thoa lớp parafin lỏng lên miệng bình , đốt đèn cồn hay đèn cầy lên đặt vào bình, đậy nắp lại , dùng máy hút chân không túi kị khí Cho vào tủ ấm, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp -Sau vi sinh vật phát triển , chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường dùng que cấy cắt khối mơi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 3.Phân lập khiết -Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời đĩa petri vào ống môi trường thạch nghiêng -Nuôi vi sinh vật nhiệt độ thời gian thích hợp -Loại bỏ ống bị nhiễm , chọn ống có chủng thuẩn khiết 4.Kiểm tra độ khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra a)Kiểm tra cách quan sát vết cấy -Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy môi trường đặc -Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng , chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại -Nếu vết cấy khơng loại bỏ b)Kiểm tra độ chủng loại khuẩn lạc -Trọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng -Tách khuẩn lạc hóa tan , pha loãng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng -Nhỏ giọt dịch vào đĩa petri có mơi trường -Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp thạch đĩa petri thứ , đĩa thứ , thứ -Đặt đĩa petri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật -Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ , khiết khuẩn lạc khiết giống 2.Ngun tắc việc ni tích lũy Trường hợp số vi khuẩn mẫu phải ni tích lũy cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng điều kiện hóa lý cần thiết bổ sung chất ức chế sinh trưởng vi sinh vật kèm 3.Thế chủng vi khuẩn khiết ( chủng ) ? Chủng vi sinh vật khiết ( hay gọi chủng ) hiểu hệ , cháu , dịng có nguồn gốc từ tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa khiết khuẩn lạc có thề hình thành nhiều tế bào , bào tử , phải làm nhiều lần thu chủng vi sinh vật khiết ... hiển vi có sinh vật trường hợp nhuộm vi sinh vật không cố định nhuộm vi sinh vật cố định BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I.NGUYÊN TẮC Phân lập vi khuẩn trình tách rời loại vi sinh vật từ... ứng dụng vi sinh vật 1.Mục đích ni cấy -Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu -Tiến hành vi? ??c nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng -Bảo tồn giống vi sinh vật cần thiết... triển thành quần thể Quần thể vi sinh vật ống nghiệm gọi chủng vi sinh vật ơng giống Đây khâu có ý nghĩa quan trọng vi? ??c nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Chủng vi sinh vật khiết ( hay gọi chủng