Bài giảng vi sinh vật thực phẩm chương 5 những vấn đề kỹ thuật và phương pháp tạo giống vi sinh vật

Chƣơng NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG VI SINH VẬT I YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG GIỐNG - Sản lƣợng cao, khiết, dễ tách - Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm - Thuần chủng - Khỏe, phát triển nhanh - Có khả chống tạp nhiễm - Dễ bảo quản, ổn định - Có khả cải tạo I YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG GIỐNG Các trung tâm giữ giống vi sinh vật • ABBOTT: Abbott Laboratories, North Chicago, III.60064, USA • ATCC: American Type Cultur Collection, 12301, Parklawn Drive Rockvill Md 20852, USA • CANAD – 212: Division Obioscience, National Research Council, Ottawa, Canada • CC: CRISO Division of Plant Industry, Canberra City, A.C.T Australia • FERM: Fermentation Reseach institute, Agency of IndustrialScience and Technology, Ministry of Industrial Trade and industry, Chiba, Japan • HIR: Food and Fermentation Division, Hokkaido Profectural Industrial Research Institute, Sapporo, Japan • IMASP: Museum of Culture, Institute of Microbiology, Academy of Science of Republic of China Peking, China II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG  Phân lập  Đột biến nhân tạo  Lai tạo gen II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP Tính lượng VSV sau pha lõang Chọn hộp petri chứa: 45 colonies (thuộc ống nghiệm thứ 2) Tổng độ pha lõang ồng nghiệm thứ 1/102 (99+1) (ống nghiệm 1)x 1/10 (= 10/(10+90) (ống nghiệm 2) = 1/103 Lượng mẫu dùng để đổ đĩa = 0.1ml = 1/10 Vậy lượng VSV có mẫu là: 45colonies  45 103  4.5 105  450000 / ml 1  103 10 II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP Bài tập II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP Đổ đĩa II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP Cấy ria II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN Loại đột biến Không di động Bản chất thay đổi Dấu hiệu phát đột biến Mất tiên mao, tiên mao Các khuẩn lạc mọc dính vào không hoạt động Không tạo nha Mất thay đổi bề mặt Khuẩn lạc bé, xù xì thay lớn, bào Khuẩn lạc xù xì Dinh dưỡng Lên men đường màng nhầy tròn, bóng Mất thay đổi lớp bên Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, không lipopolysaccharide Mất nhiều enzym Không mọc môi trường tổng đường sinh tỏng hợp hợp tối thiểu Mất enzym phân giải loại đường Không tạo biến đổi màu môi trường đặc trưng với thị màu đặc trưng II PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN Loại đột biến Bản chất thay đổi Dấu hiệu phát đột biến Thay đổi khả thẩm thầu, ngăn Mọc môi trường có thuốc Kháng thuốc cản xâm nhập vào tế bào nồng độ mà bình thường gây loại thuốc, phá hủy thuốc Kháng virút Nhạy cảm với nhiệt độ bình thường Mất sắc tố Mất điểm tiếp nhân virút Thay đổi protein thiết yếu làm tăng nhạy cảm với nhiệt độ ức chế phát triển vi sinh vật Phát triển môi trường nuôi cấy có mặt virút nồng độ cao Có khả phát triển nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ bình thường không phát triển Mất enzym có khả tham Khuẩn lạc có màu khác gia tổng hợp sắc tố màu II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ môi trƣờng mới:  Sử dụng thạch nghiêng  Nấm mốc: cấy truyền sau – tháng  Nấm men, vi khuẩn: cấy truyền sau – tháng  Ưu điểm: đơn giản, dễ làm  Nhược điểm: tốn công sức, môi trường, thời gian Không ổn định Coccidioides immitis II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ môi trƣờng mới:  Phương pháp làm:  Thuần khiết lại chủng vi sinh vật thạch đĩa  Cấy vi sinh vật điển hình lên thạch nghiêng  Nuôi tủ ấm Actinomycetes  Lấy ống giống cho vào tủ lạnh bảo quản 40C  Định kỳ cấy truyền lại  Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào để tránh nước II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:  Sử dụng dầu khoáng vaselin, parafin  Ưu điểm:  Đơn giản, hiệu cao  Môi trường không bị nước  Vi sinh vật bảo quản lâu so với phương pháp 01 Campylobacter jejuni II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:  Cách bảo quản:  Khử trùng dầu khoáng (1210C, 2h)  Sấy khô (1700C, – 2h)  Để nguội Serratia  Đổ lên môi trường thạch nghiêng có VSV phát triển tốt khỏang 1cm Đậy nút lại  Trét parafin đặc lên miệng  Giữ điều kiện lạnh điều kiện thường II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống đất, cát:  Bảo quản vi sinh vật tạo bào tử  Thời gian bảo quản từ - nhiều năm  Trước dùng phải:  Cấy ria lên môi trường agar  Chọn khuẩn lạc điển hình Aspergillus II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống đất, cát: Cách làm:  Đất cát đem rây kỹ, lấy hạt cỡ  Ngâm HCl H2SO4 đậm đặc – 12h  Với đất chua trung hòa CaCO3 – 2%  Rửa đến pH trung tính Clostridium  Sấy khô, trùng giữ vô trùng  Đổ cát vào ống nghiệm chứa VSV thạch (nhiều bào tử), lắc  Rót cát lẫn vi sinh vật bào tử sang ống nghiệm vô trùng khác  Đậy nút giữ 400C – ngày  Hàn kín ống nghiệm paraffin  Để phòng mát 40C II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống hạt  Bảo quản vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử không  Thời gian bảo quản lên tới năm II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống hạt  Phương pháp làm:  Hạt ngũ cốc rửa nước nóng  Cho vào ống nghiệm  Phủ hạt lớp thấm nước  Nấu hạt ngũ cốc  Thanh trùng hạt 1210C 40 phút  Thanh trùng lần, lần cách 24h  Cấy giống vi sinh vật lớp cho mọc thật dầy  Hằng ngày lắc nhẹ  Sau – 10 ngày kiểm tra lại  Gắn paraffin  Giữ nhiệt độ 15 – 200C II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống giấy lọc:  Bảo quản vi sinh vật có bào tử Thời gian bảo quản nhiều năm Cách làm  Giấy lọc cắt miếng 1-3 cm Cho vào ống nghiệm Clostridium  Đậy nút bông, trùng 1210C,  Sấy 1000C,  Vi sinh vật nuôi – ngày để có bào tử  Cho vào miếng giấy lọc giọt vi khuẩn Nuôi thêm – ngày  Phủ paraffin đặc đun chảy lên nút  Để tủ lạnh nơi mát II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống miếng gelatin: • Môi trường gelatin:  nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit  nước thịt + 10% gelatin + 0,25% acid ascorbic Yersina • Cho vi sinh vật vào môi trường Nuôi thời gian • Nhỏ môi trường chứa vi sinh vật lên giấy nến hộp petri • Sấy khô tủ hút chân không, dùng P2O5 hấp thụ nước • Bỏ ống nghiệm • Giữ 50C • Khi sử dụng nuôi broth thích hợp Cấy vào agar, chọn khuẩn lạc II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp lạnh đông:  Phương pháp làm đơn giản  Vi sinh vật giữ lâu  Cách làm:  Trộn vi sinh vật chất bảo vệ vào lẫn với  Cho vào ống nghiệm, làm lạnh từ từ  Chất bảo vệ:  glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính  huyết ngựa + geletin 1% + pH trung tính  saccharose 10% + geletin 1% + pH trung tính  dung dịch glucose 10%,  dung dịch lactose 10%) Sarcina II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp lạnh đông:  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 150C – (-) 200C : tháng cấy truyền lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh (-) 300C : tháng cấy truyền lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh (-) 400C : năm cấy truyền lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 500C – (-) 600C : năm cấy truyền lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 700C – (-) 600C : 10 năm cấy truyền lần E coli II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp đông khô:  Làm cho tế bào nước theo phương pháp thăng hoa áp suất thấp  Làm giảm làm ngừng hẳn trình phân chia vi sinh vật  VSV không bị biến đổi đặc tính di truyền  Thời gian lưu giữ lâu lên tới vài chục năm  Đuợc dùng nhiều sản xuất Nấm men II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp đông khô:  Sau nuôi cấy, vi sinh vật trộn với chất bảo vệ,  Phân vào ống nghiệm  Cho vào chậu lạnh nhiệt độ (-)70 – (-)800C, – phút  Đưa vào thiết bị đông khô (p= 10-4Hg, – 14 )  Sau làm khô, độ ẩm – 4%  Kiểm tra lại hàm lượng ẩm giấy tẩm CoCl2 3%  Hàn kín ống nghiệm khô  Bảo quản nhiệt độ phòng Vibrio [...]... PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp đông khô:  Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp  Làm giảm hoặc làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật  VSV không bị biến đổi về các đặc tính di truyền  Thời gian lưu giữ lâu lên tới vài chục năm  Đuợc dùng nhiều trong sản xuất Nấm men II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp đông khô:  Sau khi nuôi cấy, vi. .. P2O5 hấp thụ nước • Bỏ trong ống nghiệm • Giữ ở 50 C • Khi sử dụng nuôi trong broth thích hợp Cấy vào agar, chọn khuẩn lạc II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp lạnh đông:  Phương pháp làm đơn giản  Vi sinh vật giữ được lâu  Cách làm:  Trộn vi sinh vật và các chất bảo vệ vào lẫn với nhau  Cho vào ống nghiệm, làm lạnh từ từ  Chất bảo vệ:  glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính  huyết... khô, thanh trùng và giữ vô trùng  Đổ cát vào ống nghiệm chứa VSV trên thạch (nhiều bào tử), lắc đều  Rót cát lẫn vi sinh vật và bào tử sang ống nghiệm vô trùng khác  Đậy nút bông giữ ở 400C trong 2 – 3 ngày  Hàn kín ống nghiệm bằng paraffin  Để trong phòng mát hoặc ở 40C II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên hạt  Bảo quản các vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc... II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống trên các miếng gelatin: • Môi trường gelatin:  nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit  nước thịt + 10% gelatin + 0, 25% acid ascorbic Yersina • Cho vi sinh vật vào môi trường Nuôi một thời gian • Nhỏ môi trường chứa vi sinh vật lên giấy nến trong hộp petri • Sấy khô trong tủ hút chân không, dùng P2O5 hấp thụ nước • Bỏ trong ống nghiệm • Giữ ở 50 C • Khi... ống giống ra và cho vào tủ lạnh bảo quản ở 40C  Định kỳ cấy truyền lại  Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào để tránh mất nước II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:  Sử dụng dầu khoáng như vaselin, parafin  Ưu điểm:  Đơn giản, hiệu quả cao  Môi trường không bị mất nước  Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với phương pháp 01 Campylobacter... paraffin  Giữ ở nhiệt độ 15 – 200C II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống trên giấy lọc:  Bảo quản các vi sinh vật có bào tử Thời gian bảo quản nhiều năm Cách làm  Giấy lọc cắt miếng 1-3 cm Cho vào ống nghiệm Clostridium  Đậy nút bông, thanh trùng ở 1210C, 1 giờ  Sấy ở 1000C, 3 giờ  Vi sinh vật nuôi trong 3 – 5 ngày để có bào tử  Cho vào mỗi miếng giấy lọc 1 giọt vi khuẩn Nuôi thêm 2 –... men, vi khuẩn: cấy truyền sau 1 – 2 tháng  Ưu điểm: đơn giản, dễ làm  Nhược điểm: tốn công sức, môi trường, thời gian Không ổn định Coccidioides immitis II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ trên môi trƣờng mới:  Phương pháp làm:  Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên thạch đĩa  Cấy vi sinh vật điển hình lên thạch nghiêng  Nuôi trong tủ ấm Actinomycetes  Lấy ống giống. .. PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:  Cách bảo quản:  Khử trùng dầu khoáng (1210C, 2h)  Sấy khô (1700C, 1 – 2h)  Để nguội Serratia  Đổ lên môi trường thạch nghiêng có VSV phát triển tốt khỏang 1cm Đậy nút bông lại  Trét parafin đặc lên miệng  Giữ ở điều kiện lạnh hoặc điều kiện thường II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống. .. gian bảo quản có thể lên tới 1 năm II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên hạt  Phương pháp làm:  Hạt ngũ cốc được rửa sạch bằng nước nóng  Cho vào các ống nghiệm  Phủ trên các hạt này một lớp bông thấm nước  Nấu hạt ngũ cốc  Thanh trùng hạt ở 1210C trong 40 phút  Thanh trùng 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h  Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy  Hằng ngày... GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên đất, cát:  Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử  Thời gian bảo quản từ 1 - nhiều năm  Trước khi dùng phải:  Cấy ria lên môi trường agar  Chọn các khuẩn lạc điển hình Aspergillus II PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phƣơng pháp giữ giống trên đất, cát: Cách làm:  Đất hoặc cát đem rây kỹ, lấy hạt cùng cỡ  Ngâm trong HCl hoặc H2SO4 đậm đặc 8 – 12h  Với