Cùi trái chanh dây có chứa hàm lượng cao pectin, có thể được tận dụng để cảm ứng sinh tổng hợp enzyme pectinase. Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Ba 79 sinh tổng hợp pectinase tốt nhất trên môi trường bán rắn chứa 1% bột cùi trái chanh dây, 19,5% bột bắp, 19,5% bã đậu nành trong thời gian nuôi 4 ngày, đạt 4,3 UI/g. Enzyme pectinase được tinh sạch sơ bộ khi kết tủa với 80% ethanol trong 30 phút.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.000101 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PECTINASE TỪ Bacillus subtilis NUÔI TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỨA CÙI CHANH DÂY ĐỂ THỦY PHÂN LỚP NHỚT CÀ PHÊ Nguyễn Uyên Mẫn, Trần Ngọc Hùng* Tóm tắt: Cùi trái chanh dây có chứa hàm lượng cao pectin, tận dụng để cảm ứng sinh tổng hợp enzyme pectinase Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Ba 79 sinh tổng hợp pectinase tốt môi trường bán rắn chứa 1% bột cùi trái chanh dây, 19,5% bột bắp, 19,5% bã đậu nành thời gian nuôi ngày, đạt 4,3 UI/g Enzyme pectinase tinh sơ kết tủa với 80% ethanol 30 phút Chế phẩm có khả thủy phân lớp nhớt trái cà phê nồng độ sử dụng 0,5% (w/w) 24 giờ, đạt hiệu suất 22,9% Kết nghiên cứu giúp tăng hiệu xử lý lớp nhớt tận dụng nguồn phế liệu cùi trái chanh dây để tạo chế phẩm có giá trị kinh tế cao Từ khóa: Bacillus subtilis Ba 79, cùi trái chanh dây, lớp nhớt trái cà phê, pectinase MỞ ĐẦU Pectinase xúc tác trình thủy phân liên kết este để tách nhóm methoxyl phân tử pectin, giải phóng methanol axit pectic Pectinase đóng vai trị quan trọng trình chiết xuất, giảm độ nhớt, loại bỏ vỏ tăng sản lượng sản xuất rượu vang, nước trái thức uống khơng cồn (Kashyap et al., 2001) Ngồi ra, pectinase cịn áp dụng số lĩnh vực khác công nghệ sản xuất giấy, ngành dệt, chiết xuất tinh dầu, xử lí nước thải có pectin, ni cấy tế bào, xử lý vỏ cà phê,… (Trần thị Thanh Thuần & Nguyễn Đức Lượng, 2009) Mặc dù enzyme pectinase có mặt nhiều thực vật vi sinh vật, sản xuất công nghiệp, vi khuẩn Bacillus quan tâm nghiên cứu với khả phát triển nhanh nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt phế liệu nông nghiệp giàu pectin So với nguồn khai thác enzyme từ nguồn động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền sản xuất hồn tồn theo quy mô công nghiệp (Trần thị Thanh Thuần & Nguyễn Đức Lượng, 2009; Ashfaq K et al., 2012) Hàng năm, ngành công nghệ chế biến thực phẩm thải lượng lớn loại phế phụ liệu giàu pectin như: cùi vỏ loại trái có múi, bã táo, vỏ cà rốt, cùi mít, vỏ chanh dây,… với hàm lượng pectin dao động khoảng 1,2 đến 4,5% (Trần Thanh Trúc, 2013) Tận dụng nguồn phế phụ liệu để bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn để cảm ứng q trình sinh tổng hợp pectinase khơng giúp giảm bớt chi phí sản xuất mà cịn làm giảm thiểu lượng xác bã thực vật thải môi trường Trong nghiên cứu này, Trường Đại học Thủ Dầu Một *Email: hungtngoc@tdmu.edu.vn BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 814 tận dụng nguồn thải vỏ chanh dây để nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm thu nhận chế phẩm giàu pectinase; đánh giá tác động yếu tố thành phần môi trường bán rắn, tỷ lệ cùi chanh dây thời gian nuôi cấy đến khả sinh pectinase chủng Bacillus Enzyme nghiên cứu điều kiện bán tinh thử nghiệm khả thủy phân lớp nhớt trái cà phê VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Bột cùi trái chanh dây: Vỏ trái chanh dây thu nhận cửa hàng nước trái cây, gọt lớp vỏ phía ngồi Phần cùi trắng sấy khơ xay nhuyễn thành bột mịn Trái cà phê Arabica: trái chín đỏ, từ trang trại Cầu Đất, tỉnh Lâm Đồng Chủng Bacillus subtilis Ba 79: phân lập từ đất, kết từ nghiên cứu Trần Ngọc Hùng (Trần Ngọc Hùng, 2010) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy bán rắn vi khuẩn thu nhận chế phẩm giàu pectinase Chủng Bacillus subtilis tăng sinh môi trường cao thịt pepton Sau 24 giờ, hút 3% (w/w) dịch tăng sinh cho vào bình tam giác có chứa 45 g mơi trường bán rắn có thành phần bao gồm bột bắp, bã đậu nành, bột cùi chanh dây với tỷ lệ 4% Dịch khoáng bổ sung vào mơi trường chiếm 60% Ủ nhiệt độ phịng ( 30 oC), sau 72 giờ, thu nhận môi trường nuôi sấy khô 45 oC độ ẩm khoảng 10% (Trần Ngọc Hùng, 2010) Xác định hoạt tính enzyme pectinase Hoạt độ enzyme pectinase thơ xác định cách sử dụng 3,5-dinitrosalisylic axit (DNS) Hỗn hợp phản ứng bao gồm mL pectin dung dịch 0,5%, 0,5 mL dung dịch đệm sodium acetate (0,1 M; pH 5,0) 0,5 mL enzyme Hỗn hợp phản ứng ủ 30 oC Sau giờ, mL thuốc thử DNS thêm vào đun sôi phút So màu dung dịch bước sóng 575 nm Mẫu đối chứng thực điều kiện với dung dịch enzyme bị bất hoạt cách đun sôi cách thủy thời gian phút Đường cong chuẩn xây dựng với axit galacturonic Một đơn vị hoạt độ pectinase định nghĩa lượng enzyme cần thiết để xúc tác phản ứng, giải phóng µmol axit galacturonic điều kiện phản ứng, thời gian phút (Miller, 1959) Định lượng đường khử theo phương pháp Miller Trộn 0,5 mL dịch lọc với 0,5 mL thuốc thử DNS, đun sôi cách thủy phút, thêm nước cất cho đủ mL so màu bước sóng 540 nm Hàm lượng đường khử dung dịch xác định thông qua đường chuẩn đường glucose (Nguyễn Văn Mùi, 2007) Phương pháp xử lý thống kê Các thử nghiệm phịng thí nghiệm tiến hành lặp lại lần phân tích ANOVA phần mềm Stagraphic Centurion XV PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 815 2.3 Bố trí thí nghiệm Ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp pectinase: Ảnh hưởng tỷ lệ chất cảm ứng; thành phần môi trường thời gian nuôi cấy Cùi trái chanh dây tươi bổ sung vào môi trường khảo sát mức 10; 20 40% Đối với bột khô, hàm lượng cùi 1; 4% Tỷ lệ bột bắp bã đậu nành 5:5 Đánh giá hoạt độ pectinase nghiệm thức để xác định tỷ lệ cùi chanh dây tốt Hàm lượng bột bắp bã đậu nành thay đổi theo tỷ lệ 3:7; 4:6; 5:5; 6:4 7:3 Tỷ lệ cùi chanh dây cảm ứng chọn từ thí nghiệm trước Sau ngày, xác định hoạt độ enzyme pectinase chọn tỷ lệ bột bắp, bã đậu nành thích hợp Thời gian nuôi cấy khảo sát mức 3; 4; ngày Chọn thời gian thu nhận chế phẩm có hoạt độ enzyme pectinase tốt Ảnh hưởng số yếu tố đến khả thu nhận hoạt động xúc tác pectinase: tỷ lệ ethanol thời gian kết tủa; ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính Chế phẩm bột ly trích enzyme nước cất độ pha lỗng 20 lần; lắc tốc độ 120 vòng/phút thời gian 45 phút; ly tâm thu dịch; hút 20 mL dịch ly tâm, bổ sung ethanol tinh khiết với tỉ lệ 50; 60; 70 80%, giữ nhiệt độ oC khoảng thời gian 30 phút, 60 phút 90 phút Kết tủa hòa tan lại 20 mL nước cất xác định hoạt độ enzyme pectinase Kết tủa pectinase hòa tan 20 mL dung dịch đệm phosphate có giá trị pH khác nhau: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 8,0 Giữ nhiệt độ oC đo hoạt độ pectinase dung dịch sau 1; ngày Hoạt độ pectinase lại (%) xác định hoạt độ pectinase sau thời điểm bảo quản chia cho hoạt độ ban đầu Đánh giá hiệu thủy phân chế phẩm lớp nhớt trái cà phê Trái cà phê Arabica chín rửa sạch, để khơ nước bóc tách lớp vỏ ngồi Phần hạt có chứa lớp nhớt ngâm nước cất với tỷ lệ 1:1 (w/w) Chế phẩm bột ly trích enzyme nước cất độ pha loãng 20 lần bổ sung vào hỗn hợp ngâm với tỷ lệ 0; 0,5; 1,0 1,5% Sau 24 giờ, lọc thu dịch xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Miller Các nghiệm thức đối chứng thực điều kiện dịch enzyme pectinase bất hoạt cách đun sôi cách thủy 10 phút Hiệu suất thủy phân (%) = (a/b) x 100 Với a hàm lượng đường khử nghiệm thức; b hàm lượng đường khử nghiệm thức 0% enzyme KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp pectinase Ảnh hưởng tỷ lệ chất cảm ứng Cùi trái chanh dây tươi bổ sung vào thành phần chất bán rắn mức 10; 20 40% Đối với bột khô, hàm lượng cùi 1; 4% Tỷ lệ bột bắp bã đậu nành 5:5 Hàm lượng nước chiếm 60% BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 816 Bảng Ảnh hưởng hàm lượng chất cảm ứng đến khả sinh pectinase Cùi chanh dây tươi Bột cùi chanh dây khô Hoạt độ pectinase (UI/g) 1% 2% 4% 3,6b ± 0,4 2,8a ± 0,4 2,7a ± 0,3 10% - 20% - 40% - (-): Không phát với phương pháp kiểm tra độ pha loãng tối thiểu; Ký tự sau giá trị biểu thị mức độ khác độ tin cậy 95% (P ≤0,05) Hàm lượng pectin tính chất ngun liệu có ảnh hưởng lớn đến khả cảm ứng sinh enzyme pectinase Trên nguyên liệu tươi, phát triển chủng Bacillus subtilis bình thường khơng ghi nhận hoạt độ enzyme pectinase tất nghiệm thức Có thể cấu trúc nguyên liệu tươi cản trở giải phóng phân tử pectin vào mơi trường Trong đó, bột cùi trái chanh dây khơ cảm ứng sinh pectinase tốt Hoạt độ pectinase nghiệm thức dao động khoảng 2,7 đến 3,6 UI/g (Bảng 1) Hàm lượng bột cùi trái môi trường bán rắn cao, hiệu cảm ứng sinh pectinase giảm Ở tỷ lệ 1% bột cùi chanh dây, hoạt độ pectinase cao nhất, đạt 3,6 UI/g, khác biệt với nghiệm thức khác độ tin cậy 95% Ảnh hưởng thành phần môi trường bán rắn Nuôi cấy bán rắn chủng Bacillus subtilis môi trường có hàm lượng bột bắp bã đậu nành thay đổi theo tỷ lệ 3:7; 4:6; 5:5; 6:4 7:3 Tỷ lệ bột cùi chanh dây khô chiếm 1% Kết thí nghiệm thể Hình Hình Biểu đồ thể ảnh hưởng tỷ lệ chất đến khả sinh tổng hợp enzyme pectinase Ký tự cột biểu thị mức độ khác độ tin cậy 95% (P≤0,05) Tỷ lệ chất mơi trường bán rắn có ảnh hưởng lớn đến khả tổng hợp pectinase chủng Bacillus subtilis Hàm lượng bột bắp bã đậu nành mơi trường cao q thấp q khơng có lợi cho q trình sinh tổng hợp pectinase Mơi trường bán rắn chứa bột bắp bã đậu nành với tỷ lệ 5:5 cho hoạt độ pectinase cao nhất, đạt 3,2 UI/g mơi trường (Hình 1), khác biệt độ tin cậy 95% Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Nuôi cấy chủng Bacillus subtilis môi trường bán rắn có chứa 1% bột cùi chanh dây khơ, 19,5% bột bắp 19,5% bã đậu nành Thí nghiệm khảo sát khoảng PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 817 thời gian 2; 3; 4; ngày Hoạt độ enzyme pectinase nghiệm thức thể Hình Hình Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme pectinase Ký tự cột biểu thị mức độ khác độ tin cậy 95% (P≤0,05) Thời gian ni cấy khơng có ảnh hưởng nhiều đến trình sinh tổng hợp pectinase chủng nghiên cứu Thời gian đầu, chủng sử dụng chất dinh dưỡng đơn giản, sẵn có mơi trường để sinh trưởng phát triển Khi mật độ chủng tăng mạnh lúc chất dinh dưỡng sẵn có cạn kiệt, chủng sinh tổng hợp enzyme pectinase để thủy phân pectin lấy chất dinh dưỡng Thời gian thích hợp để thu nhận chế phẩm giàu pectinase ngày, hoạt độ đạt 4,3 UI/g Ở thời gian nuôi cấy lâu hơn, chủng không sinh tổng hợp thêm pectinase hoạt độ enzyme môi trường giảm dần So với nhiều nghiên cứu công bố trước đây, hoạt độ pectinase chế phẩm không cao đề tài cho thấy giải pháp khả thi để tận dụng nguồn rác thải vỏ chanh dây Ảnh hưởng số yếu tố đến khả thu nhận hoạt động xúc tác enzyme pectinase Ảnh hưởng tỷ lệ ethanol thời gian kết tủa Hình Biểu đồ ảnh hưởng tỷ lệ ethanol thời gian tủa đến khả thu nhận pectinase Ký tự cột biểu thị mức độ khác độ tin cậy 95% (P ≤0,05) 818 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Tỷ lệ ethanol thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến khả thu nhận enzyme pectinase Ở tỷ lệ 80% ethanol, thời gian kết tủa từ 30 phút 60 phút cho hoạt độ pectinase đạt 1,49 1,55 UI/mL, khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức khác độ tin cậy 95% Tỷ lệ sử dụng ethanol thấp không làm gia tăng hiệu thu nhận enzyme pectinase kết tủa thời gian lâu Ảnh hưởng pH bảo quản đến độ bền hoạt tính enzyme pectinase Hình Biểu đồ thể ảnh hưởng pH dung dịch bảo quản đến hoạt độ enzyme pectinase Trong dung dịch, hoạt độ enzyme pectinase giảm nhanh chóng pH bảo quản khác Sau ngày, pH 5,5, hoạt độ pectinase lại 78% so với ban đầu Sau ngày, hoạt độ enzyme bảo quản pH lại 50% Tại pH 8,0 hoạt độ pectinase giữ 48% sau ngày bảo quản Kết cho thấy cần nghiên cứu tạo chế phẩm dạng bột khô bổ sung chất ổn định cấu trúc để chế phẩm pectinase giữ hoạt độ lâu Đánh giá hiệu thủy phân chế phẩm lớp nhớt trái cà phê Hàm lượng đường khử dịch xử lý số gián tiếp cho thấy mức độ lớp nhớt trái cà phê bị thủy phân Sau 24 giờ, hiệu xử lý pectinase đánh giá Kết thí nghiệm thể Hình Hình Biểu đồ thể khả thủy phân lớp nhớt trái cà phê dịch enzyme pectinase Ký tự cột biểu thị mức độ khác độ tin cậy 95% (P≤0,05) PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 819 Enzyme pectinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Ba 79 có khả thủy phân lớp nhớt trái cà phê Sau xử lý, hiệu enzyme không cao tất nồng độ enzyme thử nghiệm (Hình 5) Hiệu thủy phân rõ rệt sau 24 xử lý Nghiệm thức bổ sung 0,5% dịch enzyme có hiệu suất thủy phân đạt 24,5%, cao 22,9% so với đối chứng tương ứng Nghiệm thức bổ sung 1,5% dịch enzyme cho hiệu suất thủy phân lên đến 34,1% cao 10,9% so với đối chứng Enzyme pectinase thủy phân pectin, thành phần lớp nhớt trái cà phê việc gia tăng hàm lượng đường khử dịch ngâm chứng gián tiếp cho việc lớp nhớt trái bị phân hủy Với phương pháp đếm số hạt nhớt, Dương Văn Tuân cộng cho thấy hiệu xứ lý cao ngâm cà phê với hỗn hợp chủng vi sinh vật : Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Phanerochaete chrysosporium Aspergillus niger (Dương Văn Tuân nnk., 2012) Trong nghiên cứu tiếp theo, kỳ vọng nâng cao hiệu xử lý lớp nhớt cách điều chỉnh nhiệt độ pH hỗn hợp, qua gia tăng giá trị kinh tế hạt cà phê KẾT LUẬN Chủng Bacillus subtilis Ba 79 sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nuôi môi trường bán rắn chứa 1% bột cùi trái chanh dây khô, 19,5% bột bắp 19,5% bã đậu nành, hoạt độ enzyme đạt 4,3 UI/g môi trường khô sau ngày nuôi cấy Enzyme pectinase tinh sơ hiệu với tỷ lệ 80% cồn 30 phút Chế phẩm pectinase bán tinh giữ 50% hoạt độ sau ngày pH 5,5 Bổ sung chế phẩm vào hỗn hợp ngâm hạt cà phê với tỷ lệ 0,5% (5 UI/kg) giúp gia tăng hiệu thủy phân lớp nhớt 22,9% sau 24 xử lý Lời cảm ơn: Chúng xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí Chương trình Sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Thủ Dầu Một giúp đỡ Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Trường Đại học Thủ Dầu Một TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashfaq K., Saniay S., Neha R., 2012 Production and optimization of pectinase enzyme using Aspergillus niger strains in solid state fermentation Research in Biotechnology, 3(3): 19-25 Trần Ngọc Hùng, 2010 Nghiên cứu tạo chế phẩm giàu protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis để bổ sung vào thức ăn cho gia cầm Luận văn Thạc sĩ ngành Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Kashyap D R.; Vohra P K., Chopra S., Tewari, 2001 Application of pectinase in the commercial sector: a review Bioresource Technology, 77: 512-227 Miller L G., 1959 Use of dinitrosalicylic axit reagent for determination of reducing sugar Anal Chem, 31: 426-473 Nguyễn Văn Mùi, 2007 Thực hành Hóa Sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, 60 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 820 Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng, 2009 Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, 12(3): 50-56 Trần Thanh Trúc, 2013 Phân lập tuyển chọn số dịng Aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, 21 Dương Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh, Trần Thị Xô, 2012 Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme pectinase cellulose chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, P lantarum nấm mốc A niger, Ph rhysosporium để xử lý lớp nhớt vỏ cà phê, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 8, Đại học Đà Nẵng STUDY ON RECEIVING PECTINASE PRODUCT FROM Bacillus subtilis CULTIVATED ON THE PASSION FRUIT PULP MEDIUM FOR HYDROLYSE THE MUCILAGE COAT OF COFFEE BEANS Nguyen Uyen Man, Tran Ngoc Hung* Abstract: The pulp of passion fruit has a high content of pectin, could be reused to induce pectinase synthesis Bacillus subtilis Ba 79 strain produced the highest pectinase on the medium that contained 1% passion fruit pulp powder, 19.5% corn powder, and 19.5% soya residue After days, it yielded 4.3 UI/g Pectinase was purified by precipitation with 80% ethanol for 30 minutes The preparation has the ability to hydrolyse the mucilage coat of coffee beans at the ratio of 0.5% (w/w) for 24 hours, gets productivity of 22.9% The results help improve the process of taking off the mucilage coat and reuse the pulp of pasion fruit to produce useful and valued products Keywords: Bacillus subtilis Ba 79, mucilage coat of coffee beans, pectinase, pulp of passion fruit Thu Dau Mot University *Email: hungtngoc@tdmu.edu.vn ... thành phần môi trường bán rắn, tỷ lệ cùi chanh dây thời gian nuôi cấy đến khả sinh pectinase chủng Bacillus Enzyme nghiên cứu điều kiện bán tinh thử nghiệm khả thủy phân lớp nhớt trái cà phê VẬT... độ pectinase giữ 48% sau ngày bảo quản Kết cho thấy cần nghiên cứu tạo chế phẩm dạng bột khô bổ sung chất ổn định cấu trúc để chế phẩm pectinase giữ hoạt độ lâu Đánh giá hiệu thủy phân chế phẩm. .. Hoạt độ pectinase lại (%) xác định hoạt độ pectinase sau thời điểm bảo quản chia cho hoạt độ ban đầu Đánh giá hiệu thủy phân chế phẩm lớp nhớt trái cà phê Trái cà phê Arabica chín rửa sạch, để khơ