Nghiên cứu tạo chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử và xylooligosaccharide

PHẠM THỊ THU PHƯƠNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI =======***======= PHẠM THỊ THU PHƯƠNG CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SYNBIOTIC TỪ VI KHUẨN SINH BÀO TỬ VÀ XYLOOLIGOSACCHARIDE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC KHÓA: 2010 - 2012 HÀ NOI - 2012 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn này, em nhận nhiều giúp đỡ, khích lệ, động viên Thầy, Cô giáo, cán nghiên cứu, bạn bè người thân gia đình Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học (CNSH), Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (KH&CN), người hết lòng hướng dẫn, bảo em bước đề tài, người ủng hộ, tạo điều kiện tốt cho em thời gian, kinh phí nghiên cứu tinh thần để em hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể phòng Sinh hóa Thực vật, TS Hoàng Phương Hà tập thể phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam; TS Nguyễn Thị Vân Anh thầy giáo, anh chị, bạn phòng thí nghiệm Enzyme-Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; TS Hồ Anh Sơn tập thể môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y tạo điều kiện giúp đỡ thời gian em đến học tập thực tập nơi Và cuối cùng, em muốn nói lời cảm ơn chân thành với người bạn thân thiết thành viên gia đình, đặc biệt người mẹ người chồng em, bên động viên khuyến khích chia sẻ khó khăn em Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2012 Phạm Thị Thu Phương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2012 Phạm Thị Thu Phương MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực phẩm chức (Functional foods) 1.2 Prebiotic 1.2.1 Khái niệm prebiotic 1.2.2 Oligosaccharide - chất xơ thực phẩm có hoạt tính prebiotic 1.2.3 Xylooligosaccharide 1.3 Probiotic 10 1.3.1 Giới thiệu probiotic 10 1.3.3 Vi khuẩn sinh bào tử Bacilllus 14 1.4 Synbiotic 18 1.4.1 Giới thiệu synbiotic 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng synbiotic 19 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu 23 2.1.1 Chủng vi sinh vật 23 2.1.2 Mẫu động vật 23 2.1.3 Hóa chất 23 2.1.4 Thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Đo mức độ tăng trưởng tế bào 24 2.2.2 Định lượng xylose XOS 24 2.2.3 Sắc ký lớp mỏng định tính đường XOS 25 2.2.4 Định lượng axit béo sắc ký khí 25 2.2.5 Đánh giá độc tính cấp 26 2.2.6 Đếm quần thể vi khuẩn 26 2.2.7 Nhận dạng vi khuẩn B subtilis HU58 phân chuột đọc trình tự gen đoạn mã hoá ARNr 16S 27 2.2.8 Đánh giá thể trạng chuột số thông số hóa sinh, miễn dịch máu chuột 28 2.2.9 Đánh giá tác dụng chế phẩm synbiotic lên hội chứng rối loạn đại tiện 31 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tuyển chọn chủng probiotic có khả đồng hóa XOS 35 3.1.1 Khả sinh trưởng Bacillus môi trường có chứa XOS 36 3.1.2 Khả đồng hóa XOS Bacillus subtilis HU58 37 3.1.3 Khả hình thành butyrate Bacillus subtilis HU58 đồng hóa XOS 39 3.2 Tìm điều kiện thích hợp cho nuôi cấy sinh khối B subtilis HU58 41 3.2.1 Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng B subtilis HU58 41 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng B subtilis HU58 42 3.2.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng B subtilis HU58 43 3.2.4 Ảnh hưởng thông khí đến sinh trưởng B subtilis HU58 44 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng B subtilis HU58 44 3.2.6 Quy trình lên men B subtilis HU58 dạng bào tử quy mô lít/mẻ 46 3.3 Tạo chế phẩm synbiotic P&P 47 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm synbiotic 47 3.4.1 Đánh giá độc tính cấp 48 3.4.2 Đánh giá thể trạng chuột sau uống chế phẩm 51 3.4.3 Đánh giá khả tăng số lượng quần thể vi khuẩn ruột 52 3.4.4 Tác dụng chế phẩm synbiotic lên số thông số hóa sinh, miễn dịch máu chuột 56 3.4.5 Tác dụng chế phẩm synbiotic lên hội chứng rối loạn đại tiện 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony forming unit FOS: Fructooligosaccharide GOS: Galactooligosaccharide NIH: Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) OS: Oligosaccharide PBS: Phosphate-buffered saline SD: Standard deviation TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TPCN: Thực phẩm chức XOS: Xylooligosaccharide WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số sản phẩm probiotic thương mại chứa bào tử Bacillus Bảng 3.1: Hàm lượng axit butyric môi trường nuôi B subtilis HU58 thời điểm ban đầu (0 giờ) Bảng 3.2: Hàm lượng axit butyric môi trường nuôi B subtilis HU58 sau 24 Bảng 3.3: Tỉ lệ hình thành bào tử B subtilis HU58 thời điểm nuôi cấy khác Bảng 3.4: Số lượng chuột sống sau uống liều chế phẩm synbiotic P&P Bảng 3.5: Số lượng tế bào máu ngoại vi máu chuột Bảng 3.6: Nồng độ ure, creatinin, SGOT SGPT máu chuột Bảng 3.7: Thể trạng chuột sau tháng uống chế phẩm nghiên cứu Bảng 3.8: Số lượng bào tử vi khuẩn B subtilis HU58 phân chuột sau cho uống chế phẩm probiotics B subtilis HU58 Bảng 3.9: Ảnh hưởng chế phẩm nghiên cứu lên số lượng tế bào Bảng 3.10: Ảnh hưởng chế phẩm nghiên cứu lên hàm lượng IgA Bảng 3.11: Số lượng phân bình thường nhóm chuột Bảng 3.13: Tỉ lệ nước phân nát nhóm chuột Bảng 3.12: Số lượng phân nát nhóm chuột Bảng 3.14: Trọng lượng ruột non, già có chứa phân nhóm chuột Bảng 3.15: Trọng lượng ruột non, già không chứa phân nhóm chuột Bảng 3.16: Thể tích ruột non, già nhóm chuột DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc hóa học XOS Hình 1.2: Chu kỳ sống trình tạo bào tử Hình 1.3: Cấu trúc bào tử Bacillus kính hiển vi, kính hiển vi TEM kính hiển vi AFM Hình 1.4: Tác động probiotic prebiotic lên hệ thống miễn dịch Hình 2.1: Ruột non, già chứa phân không chứa phân Hình 2.2: Theo dõi số lượng chất lượng phân chuột sau uống dầu castor Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus Hình 3.2: Khả phát triển vi khuẩn Bacillus môi trường LB có chứa 0,25% XOS Hình 3.3: Hàm lượng đường XOS lại môi trường nuôi cấy vi khuẩn B subtilis HU58 Hình 3.4: Sắc ký đồ TLC môi trường nuôi cấy B subtilis HU58 có chứa XOS Hình 3.5: Hàm lượng butyrate môi trường nuôi cấy B subtilis HU58 có chứa XOS Hình 3.6: Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng B subtilis HU58 Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng B subtilis HU58 Hình 3.8: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng B subtilis HU58 Hình 3.9: Ảnh hưởng thông khí đến sinh trưởng B subtilis HU58 Hình 3.10: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng B subtilis HU58 Hình 3.11: Khả hình thành bào tử B subtilis HU58 thời điểm nuôi cấy khác Hình 3.12: Quy trình lên men B subtilis HU58 quy mô phòng thí nghiệm Hình 3.13: Hình ảnh khuẩn lạc B subtilis HU58 môi trường LB Hình 3.14: Hình ảnh bào tử B subtilis HU58 môi trường LB Hình 3.15: Chế phẩm prebiotic XOS; probiotic B subtilis HU58; synbiotic P&P Hình 3.16: Hình ảnh vi thể cấu trúc thận Hình 3.17: Hình ảnh vi thể cấu trúc gan Hình 3.18: Điện di kiểm tra gel agarose sản phẩm ADN tổng số chủng vi khuẩn B subtilis HU58 Hình 3.19: Điện di gel agarose sản phẩm nhân đoạn gen ARNr 16S chủng vi khuẩn B subtilis HU58 Hình 3.20: Sự thay đổi số lượng bào tử vi khuẩn B subtilis HU58 Hình 3.21: Ảnh hưởng chế phẩm chức nghiên cứu lên khả thực bào macrophage chuột Hình 3.22: Ảnh hưởng chế phẩm nghiên cứu lên hàm lượng INF-  Hình 3.23 Mô hình rối loạn đại tiện cho nghiên cứu thử nghiệm tác dụng probiotic, prebiotic synbiotic Hình 3.24: Số lượng phân nát nhóm chuột nghiên cứu Hình 3.25: Tỉ lệ nước phân nát nhóm chuột nghiên cứu 63 12 10 Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Hình 3.24: Số lượng phân nát nhóm chuột nghiên cứu Nhóm 1: uống nước; Nhóm 2: uống P&P; Nhóm 3: uống Phillip; Nhóm 4: uống Loperamid 3.3.5.2 Tỷ lệ nước phân Khi so sánh tỷ lệ nước phân nát nhóm chuột (hình 3.25, bảng 3.13), không tìm thấy có khác biệt đáng kể Có thể thấy mức nước phân nát nhóm dao động quanh khoảng 40% Tuy nhiên, nhận thấy lượng nước nhóm (uống chế phẩm Phillips) có xu hướng nhóm nhóm lại, kết dường tương đồng với số lượng phân nát nhóm tương ứng Bảng 3.13: Tỉ lệ nước phân nát nhóm chuột Nhóm (n=8) Tỉ lệ nước phân nát P Các số Nhóm (Uống nước) Nhóm (Uống P&P) Nhóm (Uống Phillips) Nhóm (Uống Loperamid) (%,  ± SD) 43,89 ± 8,10 40,4 ± 14,3 P1,2,3,4>0,05 (One way 36,33 ± 7,52 43,85 ± 14,9 ANOVA) 64 50 40 30 20 10 Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Hình 3.25: Tỉ lệ nước phân nát nhóm chuột nghiên cứu Nhóm 1: uống nước; Nhóm 2: uống P&P; Nhóm 3: uống Phillips; Nhóm 4: uống Loperamid 3.3.5.3 Trọng lượng ruột Trọng lượng ruột non nhóm chuột (bảng 3.14) có khác biệt ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, nhận thấy ruột non nhóm uống Phillips uống P&P có xu hướng thấp nhóm lại Ruột già có khối lượng gần tương đương nhóm chuột nhóm uống Loperamid có xu hướng thấp nhóm lại Bảng 3.14: Trọng lượng ruột non, già có chứa phân nhóm chuột Nhóm (n=8) Các số Nhóm (Uống nước) Nhóm (Uống P&P) Nhóm (Uống Phillips) Nhóm (Uống Loperamid) P Trọng lượng ruột non Trọng lượng ruột già (g,  ± SD) (g,  ± SD) 1,97 ± 0,26 1,03 ± 0,21 1,79 ± 0,25 0,9 ± 0,21 1,53 ± 0,24 1,08 ± 0,22 1,82 ± 0,56 0,85 ± 0,27 p1,2,3,4>0,05 (One way ANOVA) p1,2,3,4>0,05 (One way ANOVA) 65 Sau loại bỏ phân khỏi lòng ruột, kết cho thấy khác biệt đáng kể trọng lượng ruột non ruột già nhóm chuột (bảng 3.15) Bảng 3.15: Trọng lượng ruột non, già không chứa phân nhóm chuột Nhóm (n=8) Các số Nhóm (Uống nước) Nhóm (Uống P&P) Nhóm (Uống Phillips) Nhóm (Uống Loperamid) P Trọng lượng ruột non Trọng lượng ruột già (g,  ± SD) (g,  ± SD) 1,66 ± 0,14 0,61 ± 0,1 1,49 ± 0,29 0,61 ± 0,22 1,27 ± 0,25 0,68 ± 0,15 1,43 ± 0,35 0,5 ± 0,11 P1,2,3,4>0,05 p1,2,3.4>0,05 (One way ANOVA) (One way ANOVA) 3.4.5.4 Thể tích ruột So sánh thể tích ruột non nhóm chuột, nhận thấy chuột uống chế phẩm P&P tích nhỏ nhất, nhỏ đáng kể so với nhóm uống nước (p0,05 P1,3,4>0,05 (One way ANOVA) (One way ANOVA) 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: Đã phát chứng minh Bacillus subtilis HU58 chủng vi khuẩn có khả tiêu thụ đường xylooligosaccharides Điều kiện tối ưu để nuôi cấy Bacillus subtilis HU58 thu sản phẩm probiotic dạng bào tử với tỉ lệ bào tử đạt > 80% là: pH 7,0; nhiệt độ 370C, môi trường LB, tốc độ khuấy 200 vòng/phút thời gian 19 Không phát độc tính cấp liều tối đa 15 g/kg thể trọng sau chuột uống liều chế phẩm synbiotic Chuột uống chế phẩm synbiotic P&P với liều không làm thay đổi tình trạng toàn thân, số lượng tế bào máu, chức hình ảnh vi thể gan thận Chế phẩm synbiotic P&P có tác dụng kích thích miễn dịch chuột thông qua khả làm tăng số lượng tế bào macrophage, tăng khả thực bào tế bào tăng, hàm lượng INF-  máu chuột Sản phẩm synbiotic P&P có tác dụng giảm hội chứng rối loạn đại tiện thông qua việc giảm số lượng phân nát, giảm thể tích ruột non chuột thực nghiệm bị rối loạn đại tiện kết hợp sử dụng kháng sinh đường tiêu hóa kết hợp với uống dầu castor KIẾN NGHỊ Đánh giá chất lượng sản phẩm probiotic synbiotic thu theo qui định Bộ Y tế dành cho thực phẩm thực phẩm chức Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis HU58 qui mô lớn hơn, sở để sản xuất probiotic Bacillus subtilis HU58 dạng bào tử qui mô công nghiệp Tiếp tục đánh giá độc tính bán trường diễn chế phẩm synbiotic P&P tiến hành thử nghiệm tác dụng chế phẩm người 68 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Hoàng Phương Hà, Phạm Thị Thu Phương, Trần Thị Nhung, Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Hòa Anh, Nguyễn Thị Mai Phương (2012) “Nghiên cứu khả sử dụng xylooligosaccharides (XOS) vi khuẩn Bacillus”, Tạp chí Khoa học Công nghệ (đang in) Trần Thị Nhung, Nguyễn Thúy Hường, Phạm Thị Thu Phương, Nguyễn Thị Mai Phương (2012) “Nghiên cứu thu nhận xylooligosaccharide (XOS) từ cám gạo công nghệ enzyme”, Tạp chí Sinh học (đang in) 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Minh Hà, Nguyễn Công Thực, Nguyễn Trung Quân, Hồ Anh Sơn (2011), “Xây dựng mô hình hội chứng ruột kích thích chuột nhắt”, Tạp chí Y học thực hành, 11 (741), 38-38 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ sinh học, tập 5, Công nghệ vi sinh môi trường, nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Tiếng Anh Aachary A A., Prapulla S G (2011), “Xylooligosaccharide (XOS) as an emerging prebiotic: microbial synthesis, utilization, structural characterization, bioactive properties, and applications”, Food Science and Food Safety, 10, 2-16 Andersson H B., Ellegard L H., Bosaeus I G (1999), “Nondigestibility characteristics of inulin and oligofructose in humans” The Journal of Nutrition, 129(7), 1428-1430 Ando H., Ohba H., Sakaki T., Takamine K., Kamino Y., Moriwaki S., Bakalova R., Uemura Y., Hatate Y (2004), “Hot-compressed-water decomposed products from bamboo manifest a selective cytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia cells”, Toxicology, 18, 765-771 Barbosa T M., Serra C R., La Ragione R M., Woodward M J and Henriques A O (2005), “Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract”, Applied and Environmental Microbiology, 71, 968-978 Boehm G., Jelinek J., Stahl B., Laerevan K., Knol J., Fanaro S., Moro G and Vigi V (2004), “Prebiotics in infant formulas”, Gastroenterology, 38, 76-79 Cebra J J (1999), “Influences of microbiota on intestinal immune system development”, American Journal of Clinical Nutrition, 69, 1046-1051 70 Chakraborti C K (2011), “The status of synbiotics in colorectal cancer”, Life Sciences and Medicine Research, LSMR, 20 10 Collins M D., Gibson G R (1999), “Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut”, American Journal of Clinical Nutrition, 69(5), 1052-1057 11 Conway P L (1996), “Development of the intestinal microbiota”, Gastrointestinal microbes and host interaction, Gastrointestinal Microbiology, 2, 3-39 12 Czerucka D., and Rampal P (2002), “Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens”, Microbes and infection, 4, 733-739 13 Errington J (2003), “Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis”, Nature Reviews Microbiology, 1, 117-126 14 Fooks L J., Gibson G R (2002), “In vitro investigations of the effect of probiotics and prebiotics on selected human intestinal pathogens” FEMS Microbiol Ecol, 39(1), 67-75 15 Fotiadis C I., Stoidis C N., Spyropoulos B G., Zografos E D (2008), “Role of probiotics, prebiotics and synbiotics in chemoprevention for colorectal cancer”, World Journal of Gastroenterology, 14(42), 64536457 16 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals”, Journal of Applied Microbiology, 66, 131-139 17 Gibson G R., Roberfroid M B (1995), “Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics”, The Journal of Nutrition, 125, 401-412 18 Gmeiner M., Kneifel W et al (2000), “Influence of a synbiotic mixture consisting of Lactobacillus acidophilus 74-2 and a fructo-oligosaccharide preparation on the microbial ecology sustained in a simulation of the 71 human intestinal microbial ecosystem (SHIME reactor)”, Applied Microbial Biotechnology, 53, 219-223 19 Graham H., Apajalahti J., Peuranen S (2004), “Xylooligosaccharides alter metabolism of gut microbes and blood xylose levels in chicks” In: Dietary fiber: bioactive carbohydrates for food and feed, ed Van der Kamp J W., Asp N G., Miller Jones J., Schaafsma G., Wageningen Academic Publishers, Netherlands, 329-332 20 Granum P E (2002), “Bacillus cereus and food poisoning”, In: Applications and Systematics of Bacillus and Relatives, ed Berkeley R., Heyndrickx M., Logan N A and De Vos P., Blackwell Science, Oxford, 37-46 21 Granum P E and Lund T (1997), “Bacillus cereus and its food poisoning toxins”, FEMS Microbiology Letter, 157, 223-228 22 Harmid Abdul A., and Luan Y S (2000), “Functional properties of dietary fibre prepared from dedatted rice bran”, Food Chemistry, 68 (1), 15-19 23 Hashim M A (1994), “Bioproducts: Processing technologies for the tropics”, Institution of Chemical Engineers (Great Britain) 24 Henriques A O and Moran C P (2007), “Structure, assembly, and function of the spore surface layers”, Annual Review & Microbiology, 61, 555-588 25 Hong H A., Duc L H., Cutting S M (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, 813-835 26 Hong H A., Huang J M., Khaneja R., Hiep L V., Urdaci M.C and Cutting S M (2008), “The safety of Bacillus indicus as food probiotics”, Journal of Applied Microbiology, 105, 510-520 27 Hsu C K., Liao J W., Chung Y C., Hsieh C., Chan Y C (2004), 72 “Xylooligosaccharides and fructooligosaccharide affect the intestinal microbiota and precancerous colonic lesion development in rats” The Journal of Nutrition, 134 (6), 1523-1528 28 Istvan S., Emese K., Beata K., Andrea L (2008), “Functional food: Product development, marketing and consumer acceptance”, Review Appetite, 51, 456-467 29 Jensen G B., Larsen P., Jacobsen B L., Madsen B., Smidt L and Andrup L (2002), “Bacillus thuringiensis from greenhouse workers after exposure to B thuringiensis-based pesticides”, Applied and Environmental Microbiology, 68 (10), 4900-4905 30 Jensen G B., Larsen P., Jacobsen B L., Madsen B., Wilcks A., Smidt L and Andrup L (2002), “Isolation and characterization of Bacillus cereuslike bacteria from faecal samples from greenhouse workers who are using Bacillus thuringiensis-based insecticides”, International Archives Occupational Environment Health, 75, 191-196 31 Julien Grimoud, Henri Durand et al (2010), “In vitro screening of probiotic lactic acid bacteria and prebiotic glucooligosaccharides to select effective synbiotics”, Clinical Microbiology, 16 (5), 493-500 32 Kamgang R., Pouokam K E., Fonkoua M C., Penlap N B., Biwolé S M (2005), “Shigella dysenteriae type 1-induced diarrhea in rats”, Japanese journal of infectious diseases, 58 (6), 335-337 33 Katharina E., Scholz Ahrens, Peter Ade, Berit Marten, Petra Weber, Wolfram Timm, Yahya Asil, Claus C Gluer, and Jurgen Schrezenmeir (2007), “Prebiotics, Probiotics, and Synbiotics affect mineral absorption, bone mineral content, and bone structure”, The Journal of Nutrition, 137, 838-846 34 Marlett J A., Burney M I., Slavin J I (2002), “Position of the American 73 Dietetic Association: health implocations of dietary fiber”, Journal of the American Dietetic Association, 102(7), 993-1000 35 Maria Bielecka Elz, Bieta Biedrzycka Nna Majkowska (2002), “Selection of probiotics and prebiotics for synbiotics and confirmation of their in vivo effectiveness”, Food Research International, 35, 125-131 36 Marseglia G L., Tosca M., Cirillo I., Licari A., Leone M., Marseglia A (2007), “Efficacy of Bacillus clausii spores in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a pilot study”, Therapeutocs and Clinical Risk Managenentf, (1), 13-17 37 Mazza P (1994), “The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism”, Bollettino Chimico Farmaceutico, 133, 3-18 38 Menrad K (2003), “Market and marketing of functional food in Europe” Journal of Food Engineering, 56, 181–188 39 Moir A (2006), “How spores germinate?”, Journal of Applied Microbiology, 101, 526-530 40 Moura P., Barata R., Carvalheiro F., Gírio F., Loureiro-Dias M and Esteves P (2007), “In vitro fermentation of xylooligosaccharide from corn cobs autohydrolysis by Bifidobacterium and Lactobacillus strains”, LWT-Food Science and Technology, 40 (6), 963-972 41 Nicholson W L (2002), “Roles of Bacillus endospores in the environment”, Cellular and Molecular Life Sciences, 59, 410-416 42 Nicholson W J., Munakata N., Horneck G., Melosh H J and Setlow P (2000), “Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestial and extraterrestrial environments”, Microbiology and Molecular Biology, 64, 548-572 43 Otimenyin O S., Uguru O M., Akanbi B (2008), “Anti-diarrhea effect of aqueous extracts of Momordica balsamina and Stachytarpheta indica in 74 rats”, Journal of Natural Products, 1, 36-45 44 Parker R B (1974), “Probiotics, the other half of the antibiotics story”, Animal Nutrition and Health, 29, 4-8 45 Pascal Gourbeyre, Sandra Denery and Marie Bodinier (2011), “Probiotics, prebiotics, and synbiotics: impact on the gut immune system and allergic reactions”, Journal of Leukocyte Biology, 89, 685- 695 46 Passeron T., Lacour J P., Fontas E., Ortonne J P (2006), “Prebiotics and synbiotics: two promising approaches for the treatment of atopic dermatitis in children above years”, Allergy, 61, 431–437 47 Peng L H., Wang W F., Yang Y S., Gang Sun (2005), “Change of substance P containing neural pathway in rat model of irritable bowel syndrome”, World Chinese Journal of Digestology, 15, 13 (2), 214-218 48 Phelps R J and Killip M C (2002), “Enterotoxin production in natural isolates of Bacillaceae outside the Bacillus cereus group”, Applied and Environmental Microbiology, 68, 3147-3151 49 Patterson J A and Burkholder K M (2003), “Application of prebiotics and probiotics in poultry production”, Poultry Science, 82, 627-631 50 Rafter J., Bennett M., Caderni G., Clune Y., Hughes R., Karlsson P C., Klinder A., O’Riordan M., O’Sullivan G C., Pool-Zobel B., Rechkemmer G., Roller M., Rowland I., Salvadori M., Thijs H., Loo J V., Watzl B., Collins J K (2007), “Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients”, American Journal of Clinical Nutrition, 85 (2), 488-496 51 Roberfroid M B (2000), “Concepts and strategy of functional food science: The European perspective”, American Journal of Clinical Nutrition, 71, 1660-1664 52 Roberfroid M B (2001), “Functional Food: A challenger for the future of 75 the 21st century”, 17th international congress of Nutrition, Vienna, Austria, 27-31 53 Roller M., Rechkemmer G., Watzl B (2004), “Prebiotic inulin enriched with oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis modulates intestinal immune functions in rats”, The Journal of Nutrition, 134, 153-156 54 Sako T., Matsumoto K and Tanaka R (1999), “Recent progress on research and application of non-digestible galacto- ligosaccharides”, International Dairy Journal, (1), 69-80 55 Sanders M E., Morelli L and Tompkins T A (2003), “Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus”, Food Science and Food Safety, 2, 101-110 56 Sanders M E and Klaenhammers T R (2001), ‘The scientific basis of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic”, Journal of Dairy Science, 84, 319-321 57 Santivarangkna C., Higl B., Foerst P (2008), “Protection mechanisms of sugars during different stages of preparation process of dried lactic acid starter cultures”, Food Microbiology, 25 (3), 429-441 58 Schouten B., Esch B C., Hofman G A., Doorn S A., Knol J., Nauta A J., Garssen J., Willemsen L E., Knippels L M (2009), “Cow milk allergy symptoms are reduced in mice fed dietary synbiotics during oral sensitization with whey”, The Journal of Nutrition, 139, 1398-1403 59 Servin A L (2004), “Antagonistic activities of Lactobacilli and Bifidobacteria against microbial pathogens”, FEMS Microbiology 60 Sheu T Y and Marshall R T (1991), “Improving culture viability in frozen dairy desserts by microencapsulation”, Journal of Dairy Science, 74 (1), 107-111 76 61 Silvia Turroni, Beatrice Vitali, Marco Candela, Paolo Gionchetti, Fernando Rizzello, Massimo Campieri, Patrizia Brigidi (2010), “Antibiotics and probiotics in chronic pouchitis: A comparative proteomic approach”, World Journal of Gastroenterology, 7, 16 (1), 30-41 62 Sorokulova I B., Iryna V Pinchuk I V., Denayrolles M., Osipova I G., Huang J M., Cutting S M., Urdaci M C (2008), “The safety of two Bacillus probiotic strains for human use”, Dig Dis Sci, 53, 954-963 63 Speigel J E., Rose R., Karabell P., Frankos V H and Schmitt D F (1994), “Safety and benefits of fructooligosaccharides as food ingredients”, Food Technol, 48, 85-89 64 Spinosa M R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G., and Oggioni M R (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Research in Microbiology, 151, 361-368 65 Steiner T (2006), Managing Gut Health, First published, Nottingham University Press, Nottingham, UK 66 Ten Bruggencate S J., Bovee-Oudenhoven I M., Lettink-Wissink M L., Vander Meer R (2005), “Dietary fructooligosaccharides increase intestinal permeability in rats”, The Journal of Nutrition, 135, 837-842 67 Tuohy K M., Kolida S., Lustenberger A M., Gibson G R (2001), “The prebiotic effects of biscuits containing partially hydrolysed guar gum and fructo-oligosaccharides- a human volunteer study”, British Journal of Nutrition, 86, 341-348 68 Tuohy K M., Pinart-Gilberga M., Jones M., Hoyles L., McCartney A L and Gibson G R (2007), “Survivability of a probiotic Lactobacillus casei in the gastrointestinal tract of healthy human volunteers and its impact on the faecal microflora”, Journal of Applied Microbiology, 102, 1026-1032 77 69 Wen-Chian Lian, Hung-Chi Hsiao, Cheng-Chun Chou (2002), “Survival of Bifidobacteria after spray-drying”, International Journal of Food Microbiology, 74 (1, 2), 79-86 70 WHO (2001), Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nuthitional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid Bacteria