Nghiên cứu tạo chế phẩm aminoethoxyvinylglycine từ streptomyces spp có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hỗn q trình chín giai đoạn cận sau thu hoạch Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 94 20 201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trịnh Khắc Quang PGS TS Phạm Anh Tuấn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp (ghi rõ nơi bảo vệ luận án cấp Viện) ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Thư viện Viện Nghiên cứu rau -1MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Việt Nam nước có nhiều lợi để phát triển ngành rau hoa với tổng diện tích 1,8 triệu Tuy vậy, kim ngạch xuất nước ta chiếm 1%, tỷ lệ tổn thất sau thu hoạch cao, khoảng 20-25%, cơng nghệ sau thu hoạch nhiều hạn chế, tiềm ẩn nhiều rủi ro an toàn thực phẩm Để giảm tổn thất sau thu hoạch, nhiều chế phẩm sinh học hóa học an toàn giới nghiên cứu ứng dụng cho đối tượng rau giai đoạn cận sau thu hoạch Trong đó, hoạt chất AVG chứng minh có hiệu cao để kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản sau thu hoạch số loại nhờ khả ức chế sinh tổng hợp ethylene AVG sản xuất đường sinh học tổng hợp hóa học Kỹ thuật tổng hợp hóa học phải sử dụng q nhiều dung mơi hóa chất độc hại, phương pháp sinh học hướng nghiên cứu sử dụng để sản xuất AVG Nhu cầu sản phẩm AVG không nhỏ Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, sở kế thừa phát triển hướng nghiên cứu sinh học, thực đề tài nghiên cứu sinh: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinyl glycine từ Streptomyces spp có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hỗn q trình chín giai đoạn cận sau thu hoạch” Mục đích đề tài Phân lập, tuyển chọn số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp có khả sinh tổng hợp AVG từ đất trồng ăn Việt Nam xây dựng quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao sử dụng cho trì hỗn chín quả, đạt tiêu an toàn thực phẩm Đánh giá khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish) -23 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Các chủng Streptomyces spp có khả sinh tổng hợp AVG đất trồng ăn Việt Nam Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men, thu hồi tạo chế phẩm AVG Đánh giá khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) Địa điểm thời gian nghiên cứu 4.1 Địa điểm nghiên cứu: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Nguyên 4.2 Thời gian nghiên cứu: từ 10/10/2013-10/10/2019 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp sở khoa học, liệu liên quan đến chủng xạ khuẩn Streptomyces spp sinh tổng hợp AVG phân lập từ đất số vùng trồng ăn Việt Nam, môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy, lên men, kỹ thuật tách chiết, thu hồi tạo chế phẩm AVG Kết luận án tài liệu tham khảo cho nghiên cứu hoạt chất AVG 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng quy trình tạo chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp Việt Nam góp phần bổ sung, hỗ trợ hiệu cho giải pháp có để tăng sản lượng, chất lượng loại tươi, tiến tới thay loại bỏ phần hợp chất bảo quản có nguồn gốc hóa học độc hại 5.3 Tính luận án Là cơng trình Việt Nam nghiên cứu sản xuất chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp phân lập từ đất Việt Nam ứng dụng kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản tươi; Xây dựng quy trình cơng nghệ lên men, sinh tổng hợp AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp S6, tinh hoạt chất AVG từ dịch lên men, tạo chế phẩm AVG đạt hàm lượng hoạt chất 10% tính theo khối lượng; Quy trình áp dụng quy mơ thích hợp để sản xuất -3chế phẩm AVG đáp ứng cho nhu cầu cấp bách sản xuất nông nghiệp nước ta; Xây dựng 02 quy trình sử dụng chế phẩm AVG tạo ra: (i) để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) trồng Hưng Yên, (ii) để kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng Thái Nguyên Chế phẩm AVG đảm bảo chất lượng ATTP Mặt khác, sử dụng chế phẩm AVG không ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển suất trồng, chất lượng Bố cục Luận án Luận án gồm 118 trang (không kể phụ lục tài liệu tham khảo), 29 bảng, 39 hình 185 tài liệu tham khảo, trình bày gồm chương, phần chính: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (30 trang); Vật liệu phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết thảo luận (62 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục cơng trình cơng bố luận án (1 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ tươi: gồm 02 tiểu mục 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam, trình bày thực trạng sản xuất, tiêu thụ, nhu cầu tươi tổn thất sau thu hoạch giới Việt Nam, đặc biệt cam (Citrus sinensis) chuối tiêu (Musa cavendish) 1.2 Đặc điểm q trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa trước sau thu hoạch: trình bày q trình đồng hóa, dị hóa biểu trình hình thành, tăng trưởng, phát triển suy thoái chất lượng 1.3 Tác động ethylene nội sinh đến trình sinh trưởng, phát triển lão hóa quả: trình bày tác động sinh học ethylene đến giai đoạn trình sinh trưởng phát triển thực vật bậc cao nảy mầm hạt, rụng lá, quả, chín già hóa quả, màu sắc trái cây, độ cứng, chất bay hơi, tinh bột, đường axit hữu -4cơ q trình chín quả; đường yếu tố tham gia sinh tổng hợp ethylene, chu trình sinh tổng hợp, nhân tố tham gia chế tác động ethylene, tác động ethylene có hơ hấp đột biến không đột biến 1.4 Các nghiên cứu ức chế hoạt động ethylene nội sinh trước sau thu hoạch: gồm 03 tiểu mục 1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp (kìm hãm enzyme ACS, ức chế enzyme ACO, cạnh tranh chất SAM), 1.4.2 Kìm hãm thụ thể nhận biết ethylene 1.4.3 Loại bỏ ethylene (hấp phụ, oxy hóa, xúc tác phân hủy, lọc sinh học) Phân tích ưu nhược điểm hợp chất, phương pháp nghiên cứu ứng dụng So sánh với phương pháp sử dụng AVG 1.5 Hoạt chất AVG: gồm 03 tiểu mục 1.5.1 Cấu tạo phân tử AVG, 1.5.2 Tính chất hóa lý AVG 1.5.3 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene AVG (ACS tác nhân kìm hãm ACS, chế ức chế ACS AVG) Trong trình bày đầy đủ thông tin công thức phân tử, phân tích cấu tạo tính chất lý, hóa sinh học phân tử AVG Phân tích cấu trúc phân nhóm enzyme ACS cơng trình, kết nghiên cứu sử dụng phương pháp, hoạt chất ức chế hoạt động enzyme ACS Qua cơng trình nghiên cứu, phân tích chế ức chế ACS AVG phân tích tính ưu việt AVG ức chế hoạt động ACS 1.6 Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG: gồm 03 tiểu mục: 1.6.1 Sản xuất AVG xạ khuẩn Streptomyces spp (đặc điểm xạ khuẩn Streptomyces spp., lên men xạ khuẩn Streptomyces spp để sản xuất AVG, tách tinh AVG, công nghệ tạo chế phẩm AVG), 1.6.2 Sản xuất AVG tổng hợp hóa học 1.6.3 Kỹ thuật tạo sản phẩm điều hòa sinh trưởng 1.7 Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG: gồm 02 tiểu mục: 1.7.1 Giai đoạn trước thu hoạch (trên giới, Việt Nam) 1.7.2 Giai đoạn sau thu hoạch (trên giới, Việt Nam) Trong trình bày phân tích cơng trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất -5AVG cho trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản tươi giới Việt Nam 1.8 Những ý kiến rút từ tổng quan: điểm qua kết nghiên cứu có trước từ xác định vấn đề cần nghiên cứu cụ thể cho luận án là: Phân lập tuyển chọn chủng Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp hoạt chất AVG; Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất AVG chủng Streptomyces sp lựa chọn; Nghiên cứu làm sạch, thu hồi tạo chế phẩm AVG có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hỗn q trình chín quả; Nghiên cứu khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo trì hỗn chín để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis), kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu: Các mẫu đất có độ mùn cao vùng trồng cam, chuối loại ăn khác địa bàn Hà Nội, Hòa Bình, Hưng n, Thái Nguyên; Các loại cây, quả: chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng Thái Nguyên, cam chanh (Citrus sinensis) trồng Hưng Yên năm tuổi; Chủng xạ khuẩn S cellolosae VTCC 41913; Sản phẩm Retain 15% AVG (Valent BioSciences Corporation, Úc) 2.1.2 Mơi trường, hóa chất: Gause I cải tiến; Gause II (cao thịt - 1, pepton - 5, NaCl - 5, glucose - 10, agar - 20); Môi trường SC nuôi cấy xạ khuẩn S cellulosae VTCC 41913; Mơi trường ISP2 cho ni cấy, phân tích hình ảnh bào tử xạ khuẩn; Môi trường ISP4 cho phân tích hình thái xạ khuẩn; Kit tách DNA tổng số; thang DNA chuẩn; cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA; Chuẩn AVG tinh khiết phục vụ phân tích (Sigma) hóa chất phục vụ nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, lên men, tách chiết, tinh tạo chế phẩm AVG khác -62.1.3 Thiết bị, dụng cụ: thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu vi sinh vật, nuôi cấy, lên men, tách chiết, làm sạch, thu hồi, tạo chế phẩm AVG, thử nghiệm đồng ruộng phân tích 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu chung Phân tích hàm lượng AVG HPLC; xác định pH dịch lỏng máy đo pH; xác định sinh khối chủng xạ khuẩn dịch lên men phương pháp khối lượng không đổi; xác định hàm lượng chất khô tổng số dịch lỏng khúc xạ kế cầm tay 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung 2.2.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp hoạt chất AVG: phân lập chủng có đặc điểm chi Streptomyces theo phương pháp Vinorgadski Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn xác định theo Shirling cộng (1966, 1968), có so sánh với khóa phân loại Waksman, Gause Bergey’s Manual Phân tích hình ảnh bào tử kính hiển vi điện tử quét JSM-5410 LV; Sàng lọc sơ chủng có khả sinh tổng hợp AVG qua khả ức chế xạ khuẩn S cellulosae VTCC 41913; Xác định chủng sinh tổng hợp AVG phân tích HPLC; Định tên dựng phân loại chủng có khả sinh tổng hợp AVG giải trình tự 16S rDNA 2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng điều kiện lên men đến sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất AVG chủng Streptomyces sp lựa chọn: Chủng sử dụng cho nghiên cứu chủng S6 có khả sinh tổng hợp AVG cao chủng phân lập môi trường nghiên cứu xuất phát Gause II Các thành phần khác môi trường dinh dưỡng khảo sát nguồn carbon, nguồn nitơ, nguyên tố vi lượng với nồng độ tương đương chất môi trường Gause II, đa lượng (1g/l); điều kiện lên men khảo sát tỉ lệ tiếp giống (2x106-1,6x107CFU/ml), nhiệt độ (2632oC), nồng độ oxy hòa tan (mg/l theo tốc độ lắc từ 220-300 vòng/phút), pH mơi trường lên men (6,2-7,4), thời gian lên men (11, hiệu suất thu hồi không cải thiện 3.3.2.5 Mức độ tinh AVG dịch thu hồi sau trao đổi ion: AVG xuất 100ml dịch đầu tiên, tăng dần đạt cực đại 172,40±1,86mg phân dịch 301-400ml dịch rửa giải kết thúc -16phân dịch 800ml Tổng lượng AVG chất khô tổng số dịch rửa giải xác định 612,10±11,30mg 764,53±10,07mg theo thứ tự, tương ứng với độ tinh trung bình dịch rửa giải 80,06% 3.3.2.6 Tăng cường tinh AVG nhiều cột trao đổi ion: trao đổi qua cột lần thứ 2, độ tinh tăng, đạt 82,82% Ở lần tinh thứ 3, độ tinh AVG khơng cải thiện Hình 3.13 Sắc ký đồ chuẩn AVG 100ppm, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.14 Sắc ký đồ dịch lên men sau li tâm, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.15 Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 1, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.16 Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 2, cột Amino_axit_Xbrige -173.3.3 Cô đặc dịch sau tinh trao đổi ion: nhiệt độ 70oC ảnh hưởng đến thay đổi hàm lượng AVG Ở nhiệt độ 75oC, màu sắc dịch biến động phần AVG bị tổn thất, 4,27% Ở nhiệt độ 80oC 85oC, dịch cô đặc bị chuyển màu, AVG bị tổn thất đáng kể, 17,60 vaf 36,31% theo thứ tự Lựa chọn nhiệt độ cô đặc dịch chứa AVG cho nghiên cứu 65oC 3.3.4 Thực nghiệm lên men, tinh cô đặc dịch chứa AVG quy mơ lên men 100 lít/mẻ: sử dụng thông số công nghệ nghiên cứu phần tối ưu môi trường dinh dưỡng điều kiện lên men nội dung 3.2, tốc độ khuấy 260 vòng/phút cho sinh khối lượng AVG tạo cao nhất, đạt 8,47±0,35g/l 655,33±2,72mg/l với pellet nhỏ mịn Tốc độ khuấy nhỏ lớn cho sinh khối thấp lượng AVG sinh tổng hợp thấp Độ tinh AVG sau cột trao đổi ion đạt 82,7±0,44%, nồng độ AVG dịch sau cô đặc đạt 29,67 g/l Bảng 3.1 Kết sản xuất, tinh đặc dịch chứa AVG quy mơ 100 lít/mẻ TT Thơng số dịch Đơn vị Kết tính Hàm lượng AVG dịch lên men mg/l 655,33±2,72 Lượng dịch lên men l 98,03±1,45 Lượng dịch sau trao đổi ion l 80,30±1,38 Lượng dịch sau cô đặc l 2,05±0,89 Tổng lượng chất khơ hòa tan (TSS) g 73,53±3,35 Hàm lượng AVG g 60,83±3,10 Tạp chất (6)-(7) g 12,70±0,24 Độ tinh dịch chứa AVG (7):(6) % 82,7±0,44 Nồng độ AVG dịch cô đặc (6): (4) 3.3.5 Tạo chế phẩm AVG: 12% dịch AVG đặc tính theo tổng lượng chất khô phối trộn với 87% maltodextrin, 1% polyvinyl pyrrolidone theo tỉ lệ khối lượng để dự kiến có chế phẩm dạng bột chứa 10% hoạt chất AVG phương pháp sấy phun -183.3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào khơng khí sấy đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG: nhiệt độ Tov 155oC cho chất lượng sản phẩm tốt nhất, bột khô ráo, độ ẩm thấp, 4,24%, hiệu suất thu hồi đạt 95,38% Nhiệt độ cao thấp cho cảm quan hiệu suất thu hồi thấp 3.3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu khơng khí sấy đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG: khoảng nhiệt độ 65oC-70oC cho sản phẩm có chất lượng bột tốt, hạt tơi, màu vàng sáng, hiệu suất thu hồi cao, đạt 95% Nhiệt độ cao thấp cho cảm quan hiệu suất thu hồi thấp Nhiệt độ đầu tác nhân sấy 65oC lựa chọn tạo chế phẩm AVG 3.3.5.3 Ảnh hưởng tốc độ bơm dịch nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG: tốc độ bơm dịch ≤30 vòng/phút cho bột thu hồi tốt, hiệu suất thu hồi đạt 95%, hàm lượng AVG đảm bảo Tốc độ bơm dịch thấp không cải thiện khả thu hồi, tốc độ bơm dịch cao làm sản phẩm bị bết dính, hiệu suất thu hồi giảm Tốc độ bơm dịch 30 vòng/phút lựa chọn để tạo chế phẩm AVG Hình 3.17 Chế phẩm AVG 3.3.6 Chất lượng chế phẩm AVG 3.3.6.1 Các tiêu vật lý chế phẩm AVG: tiêu vật lý chế phẩm AVG tương đồng với Retain, đáp ứng yêu cầu sản phẩm sinh học dạng bột ứng dụng nông nghiệp -19Bảng 3.2 Chỉ tiêu vật lý chế phẩm AVG TT Chỉ tiêu Thông tư số 12/2018/TTBNNPTNT Chế phẩm AVG Retain Trạng thái vật lý Dạng bột tơi Màu Hàm lượng AVG Mức sai lệch phân tích AVG (%) Tỷ suất lơ lửng 30±2oC 30 phút Độ thấm ướt nhiệt độ thường 54±2oC Độ mịn thử rây ướt 75µm nhiệt độ thường 54±2oC Độ bọt Độ bền bảo quản nhiệt độ 54±2oC 14 ngày Khối lượng riêng (g/cm3) pH nồng độ 1% pH nồng độ 10% Màu vàng nhạt 100,19±3,01 g/Kg 3% Dạng bột tơi Màu vàng nhạt 148,5±2,25 g/Kg 2% Hàm lượng AVG dịch ≥60% Hoàn toàn 99,4±0,5% 99,2±0,7% Hoàn toàn Hoàn toàn Lượng cặn rây ≤2% 0% 0% ≤60ml Hàm lượng AVG lại ≥ 95% 5,5±0,3ml 97,8±1,5% 5,4±0,4ml 98,1±2,3% 0,82±0,13 0,78 ± 0,15 6,9±0,2 5,6±0,1 6,9±0,4 5,6±0,2 10 11 12