Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (kaempferia parviflora wall)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội-2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khoá : QH.2016.Y Người hướng dẫn: TS Lê Hồng Luyến ThS Nguyễn Xuân Tùng Hà Nội- 2021 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Bào chế công nghệ dược phẩm, thầy cô tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập suốt năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS Lê Hồng Luyến, trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học Cây Gừng đen Kaempferia parviflora” tài trợ kinh phí để em thực nội dung nghiên cứu Em xin cảm ơn Khoa Khám bệnh Điều trị ngoại trú, Khoa Đông máu, Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương giúp đỡ em thực thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân ln quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm tâm hồn thành khóa luận Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó tránh khỏi sai sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy giúp em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Dung DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphat APTT Thời gian Thromboplastin phần hoạt hoá ( Activated partial Thromboplastin Time) ATP Adenosin triphosphat AUC Diện tích đường cong (Area Under the aggregation curve) COX-2 Cyclooxygenase cGMP guanosine monophosphat GP Glycoprotein HMWK Kininogen trọng lượng phân tử cao IC 50 Liều ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) TT Thời gian Thrombin ( Thrombin Time) vWF Von- Willerbrand DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương 10 Bảng 3.1 Diện tích đường cong (AUC) dịch chiết Gừng đen nồng độ 0,2 mg/mL 28 Bảng 3.2 Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu dịch chiết Gừng đen nồng độ 0,2 mg/mL 29 Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu dịch chiết Gừng đen nồng độ 0,2 mg/mL 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết Gừng đen đường đông máu ngoại sinh 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng dịch chiết Gừng đen đường đông máu nội sinh 31 Bảng 3.6 Ảnh hưởng dịch chiết Gừng đen đường đông máu chung 32 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo tiểu cầu Hình 1.3 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu ADP Hình 1.4 Sơ đồ q trình đơng máu huyết tương 12 Hình 1.5 Vai trị thrombin q trình đơng cầm máu 14 Hình 1.6 Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) 15 Hình 2.1 Sơ đồ chiết tách dược liệu Gừng đen 22 Hình 2.2 Máy ACL TOP500 hãng IL 23 Hình 2.3 Máy CHRONO –LOG 530 VS 23 Hình 2.4 Mẫu máu sau ly tâm 500 vòng/ phút 10 phút 25 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Giới thiệu chung tiểu cầu 1.1.2 Chức tiểu cầu 1.2 Sinh lý trình đơng máu huyết tương 1.2.1 Các yếu tố tham gia đơng máu huyết tương 1.2.2 Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương 11 1.2.3 Giai đoạn đông máu huyết tương 11 1.3 Tổng quan Gừng đen 14 1.3.1 Đặc điểm thực vật 14 1.3.2 Thực trạng phân bố 16 1.3.3 Thành phần hố học 16 1.3.4 Cơng dụng tác dụng dược lý 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Nguyên liệu, dụng cụ nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Đánh giá hoạt tính chống đơng máu phân đoạn dịch 25 chiết Gừng đen 2.2.2.Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu phân 26 đoạn dịch chiết Gừng đen CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Kết 28 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch 28 chiết Gừng đen 3.1.2 Tác dụng chống đông máu phân đoạn dịch chiết 30 Gừng đen 3.2 Bàn luận 32 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu 32 3.2.2 Kết nghiên cứu 34 3.2.3 Hạn chế nghiên cứu 36 KẾT LUẬN 38 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối động mạch huyết khối tĩnh mạch nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong toàn giới [37] Các thuốc biết đến chống đông máu như: Heparin, wafarin, hay chống ngưng tập tiểu cầu : aspirin, clopidogrel, prasugrel… cho tác dụng điều trị tốt bên cạnh chúng gây nên tác dụng phụ như: dị ứng, giảm tiểu cầu, loét dày… [37,24] Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục loại thuốc đặc biệt thuốc chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu vô cần thiết Xác định đường sinh hoá liên quan đến hoạt hố đơng máu ngưng tập tiểu cầu đưa đến việc tìm kiếm thuốc cho thuốc chống huyết khối có tác dụng phụ nhà khoa học quan tâm Bên cạnh thuốc tổng hợp, thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên ứng viên tiềm để sử dụng nghiên cứu [37] Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) thuộc họ Gừng Zingiberaceae [51,28] sử dụng lâu đời y học Thái Lan y học cổ truyền để tăng cường sức khoẻ [47] Chúng nghiên cứu nhiều tác dụng dược lý, hoá học Tuy nhiên Việt Nam giới, số lượng nghiên cứu tác dụng chống đông máu ức chế ngưng tập tiểu cầu cịn hạn chế Vì vậy, để làm rõ sở khoa học giá trị sử dụng Gừng đen, góp phần sử dụng hiệu tài nguyên thuốc vào điều trị bệnh huyết khối, thực đề tài “ Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu chống đông máu in vitro phân đoạn dịch chiết gừng đen (Kaempferia parviflora)” Mục tiêu đề tài là: Đánh giá hoạt tính chống đơng máu dịch chiết Gừng đen Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu dịch chiết Gừng đen CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Giới thiệu chung tiểu cầu Khái niệm: Tiểu cầu đĩa nhỏ hình trịn bầu dục, có đường kính – µm, độ dày trung bình 0,5 µm thể tích khoảng µm3 Đây thành phần hữu hình nhỏ máu Số lượng tiểu cầu lưu hành máu ngoại vi khoảng từ 150.000 - 400.000/µL (150 – 400 x 109/L) Tiểu cầu tế bào khơng có nhân khơng có khả phân chia Chúng thành phần đóng vai trị quan trọng bậc q trình cầm máu đơng máu, giai đoạn cầm máu ban đầu [3,1,35] Nguồn gốc phát triển: Tiểu cầu sinh sản từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tuỷ (CFU - GEMM), tế bào gốc sinh máu tạo nên (Hình 1.1) Mẫu tiểu cầu trưởng thành tuổi sinh tiểu cầu tế bào máu lớn tế bào máu tủy xương, với nhân to, nhiều múi, nguyên sinh chất rộng chứa nhiều hạt, có đường kính 50 – 100 µm Mỗi mẫu tiểu cầu tạo từ 1000 đến 3000 tiểu cầu [3,9,14] Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu [3] (HSC: tế bào gốc sinh máu, MTC: mẫu tiểu cầu, TC: tiểu cầu) Đời sống tiểu cầu: Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ - 14 ngày Hiện giữ tiểu cầu ngày thể nhiệt độ 20 – 22°C, lắc liên tục [3] Tổng 12,07±0,25