Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NƠNG THỊ ĐẶNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU VÀ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỐT KHÍ CỦ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hà Nội – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: Nông Thị Đặng NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU VÀ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỐT KHÍ CỦ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Khóa : QH2016.Y Người hướng dẫn : TS.Lê Hồng Luyến ThS.Nguyễn Xuân Tùng Hà Nội - 2021 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học sở tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo khoa dìu dắt, giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập suốt năm qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Hồng Luyến, trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học Quốc gia Hà Nội ln tận tình hướng dẫn, tạo kiện giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Bộ mơn Dược lí – Dược lâm sàng Bộ môn Y Dược học sở giúp đỡ em q trình thực khóa luận Em xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện huyết học truyền máu Trung ương giúp đỡ em thực thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người than quan tâm, động viên giúp em hồn thành khóa luận Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khố luận them hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nông Thị Đặng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa CKC Cốt khí củ NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu ( Platelet poor Plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) AUC Diện tích đường cong CFU - GEMM Tế bào nguồn dòng tủy NSC PDECGF Nội sinh nguyên chất Tế bào nội mạc nguồn gốc từ tiểu cầu EA ethyl acetate IC50 Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration TXA2 Thromboxan A2 EtOAc Phân đoạn ethyl acetate CKC (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) H2O Phân đoạn nước CKC (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) EtOH Phân đoạn ethanol CKC (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) ADP Adenosin diphosphat GP AMP HP Glycoprotein Adenosin monophosphate Heparin APTT Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa (Activated Partial Thromboplastin Time) DMSO Dimethyl sulfoxide PT PT (Prothrombin Time TT Thrombin Time PVA Poly Vinyl Alcohol PEG Polyethylene glycol DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các thành phần gây huyết khối kháng huyết khối thể 11 Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) Cốt khí củ 30 Bảng 3.2 Bảng kết độ dốc S Cốt khí củ 31 Bảng 3.3 Bảng kết phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu 32 Bảng 3.4 Ảnh huởng chất Cốt khí củ thời gian đơng máu 36 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ phát triển trưởng thành tiểu cầu Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo tiểu cầu Hình 1.3 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu ADP (- ức chế, ngăn cản) Hình 1.4 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của acid arachidonic Hình 1.5 Sơ đồ đinh cầm máu (nút tiểu cầu) 12 Hình 1.6 Sơ đồ q trình đơng máu huyết tương 14 Hình 1.7 Sơ đồ giai đoạn tiêu sợi huyết 17 Hình 1.8 Cốt khí - Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc 18 Hình 2.1 Quá trình ngâm chiết mẫu dược liệu có sử dụng máy siêu âm 23 Hình 2.2 Qúa trình lọc mẫu,cơ quay đuổi dung mơi thu hồi cao chiết 24 Hình 3.1 Qúa trình phân lập hợp chất từ cao phân đoạn Hexane EtOAc 29 Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng khảo sát thành phần hóa học cao chiết tổng 30 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Tổng quan tiểu cầu 1.1.2 Khả ngưng tập tiểu cầu 1.1.2.1 Các chất có khả gây ngưng tập tiểu cầu 1.1.2.2 Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu 1.2 Sinh lý q trình đơng cầm máu 10 1.2.1 Giới thiệu chung q trình đơng cầm máu 10 1.2.2 Các giai đoạn chế đông cầm máu 11 1.2.2.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu 12 1.2.2.2 Giai đoạn đông máu huyết tương 13 1.2.2.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết 16 1.3 Tổng quan Cốt khí củ 17 1.3.1 Đặc điểm thực vật 17 1.3.2 Thực trạng phân bố 19 1.3.3 Thành phần hóa học 19 1.3.4 Công dụng tác dụng dược lý 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp phân tích số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Kết thực nghiệm 29 3.1.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết dược liệu 29 3.1.2 Tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu lồi Cốt khí củ 30 3.1.3 Tác dụng chống đơng máu từ Cốt khí củ 35 Tài liệu tham khảo 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh lý huyết khối (bao gồm huyết khối động mạch huyết khối tĩnh mạch) nhóm bệnh có số bệnh nhân tử vong cao giới Huyết khối nguyên nhân hàng đầu tắc nghẽn mạch máu gây tử vong để lại di chứng nặng nề cho người bệnh.Nhiều nghiên cứu cho thấy ngưng tập tiểu cầu đơng máu đóng vai trị quan trọng q trình hình thành huyết khối [8,9] Thuốc chống ngưng tập tiểu cầu thuốc chống đông máu coi liệu pháp lý tưởng phòng điều trị bệnh lý liên quan đến huyết khối.Tuy nhiên, việc sử dụng loại thuốc tồn nhiều hạn chế Hạn chế lớn thuốc chống ngưng tập tiểu cầu chúng có khả làm giảm đường kích hoạt tiểu cầu Trong đó, tiểu cầu kích hoạt thông qua nhiều đường, nên tác dụng ức chế loại thuốc có khả thất bại cao có tác nhân kích thích mạnh kích hoạt tiểu cầu[7] Đối với thuốc chống đông máu, hạn chế loại thuốc bao gồm: Tác dụng chậm, yêu cầu thay đổi liểu lượng, đa hình di truyền phổ biến ảnh hưởng đến chuyển hóa chúng nhiều tương tác thuốc thuốc làm tăng giảm tác dụng chống đông máu chúng Nhằm giảm thiểu tác dụng không mong muốn này, nhà khoa học nước giới có xu hướng nghiên cứu nhằm tìm hợp chất, tác nhân có nguồn gốc từ thiên nhiên với hiệu an toàn cao điều trị Việt Nam có lồi Cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb & Zucc) mọc tự nhiên vùng núi cao, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) Trong dân gian Cốt khí củ dùng để chữa tê thấp bị ngã, bị thương Ngồi cịn có cơng hoạt huyết thông kinh, thống, trừ phong thấp, thấp nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn [4] Tuy nhiên nay, nghiên cứu tác dụng sinh học lồi cịn hạn chế nước ta Các nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học Cốt khí củ cho thấy rễ lồi có chứa thành phần bao gồm: Quinon, stilben, flavonoid, coumarin, polyphenol [2,12] Làm rõ sở khoa học giá trị sử dụng Cốt khí củ, góp phần sử dụng hợp lý hóa tài nguyên thiên nhiên áp dụng giải pháp khoa học công nghệ nhằm phát triển duợc liệu nước, đặc biệt nghiên cứu tác dụng q trình đơng máu ngưng tập tiểu cầu, chúng tơi tiến hành đề tài Nghiên cứu hoạt tính chống đông máu ngưng tập tiểu cầu in vitro số phân đoạn dịch chiết củ Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb & Zucc.) với mục tiêu cụ thể sau : - Đánh giá tác dụng chống đông máu phân đoạn dịch chiết củ Cốt khí mơ hình in vitro - Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết củ Cốt khí in vitro CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Tổng quan tiểu cầu Khái niệm : Tiểu cầu thành phần hữu hình nhỏ máu, có đường kính – µm Số lượng tiểu cầu lưu hành máu ngoại vi khoảng từ 150.000 - 400.000/µL (150 – 400 x 109/L) Tiểu cầu thành phần đóng vai trị quan trọng bậc q trình cầm máu đơng máu, giai đoạn cầm máu ban đầu ngồi tiểu cầu có vai trị quan trọng q trình sinh lý bệnh khác bao gồm viêm hình thành xơ vữa, bảo vệ vật chủ kháng khuẩn, phát triển di khối u [3,7,10] Nguồn gốc phát triển Tiểu cầu sinh sản từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tuỷ (CFU - GEMM), tế bào gốc sinh máu tạo nên (H.1.1) Mỗi mẫu tiểu cầu tạo 3000 tiểu cầu.[3] Hình 1.1 Sơ đồ phát triển trưởng thành tiểu cầu [3] Đời sống tiểu cầu Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ - 14 ngày Hiện giữ tiểu cầu ngày thể nhiệt độ 20 – 22°C, lắc liên tục.[3] Cấu trúc tiểu cầu Cũng tế bào khác, tiểu cầu gồm có lớp màng, hạt, hệ thống vi ống, hệ thống nội NSC (nội sinh nguyên chất) - Màng tiểu cầu: Gồm hai lớp lipid (lớp lipid kép) Trong có thành phần quan trọng glycoprotein (GP), chúng có trọng lượng phân tử khoảng 140kD có thành phần sau đây: + GPIb protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố Von Willebrand (vWF) Đây bước hoạt động động cầm máu tiểu cầu + GPIIb/IIIa protein màng, hoạt động phụ thuộc vào Ca ++ có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập thành “đinh cầm máu” [5] - Hệ thống hạt đặc hiệu có hai loại hạt: + Hạt đặc chứa nhiều chất: ADP, calci, serotonin nucleotid khác Các chất giải phóng tiểu cầu bị kích thích + Các hạt α chứa nhiều protein khác thromboglobulin, yếu tố cơng thức máu hồn chỉnh để kiểm tra số lượng tình trạng tế bào máu Phần máu cịn lại cho vào các ống natri citrat (3,2%), ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút 10 phút để lấy huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) 3000 vòng/phút 10 phút để thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) Các phân đoạn dịch chiết hòa tan dung môi DMSO 0,1%, sử dụng nồng độ nghiên cứu 0,2 mg/mL Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp đo quang Born (1962) để đo độ ngưng tập tiểu cầu máy CHRONO-LOG 530 VS Mục đích: Đánh giá mơ hình tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu mơ hình in vitro phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ với chất kết tập Collagen Tiến hành: Chia 450 µL PRP vào cuvet thuỷ tinh chứa khuấy từ Thêm vào cuvet 50µL, thêm l0 µL PRP vào cuvet thu 50µL phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ với nồng độ 0,2 mg/mL; ủ phút 37 0C Sau đó, cho thêm vào cuvet µL collagen (2 µg/mL) để kích thích ngưng tập tiểu cầu Aspirin (0,1 mg/mL) DMSO 0,1% sử dụng làm chứng dương chứng âm Tính phần trăm ngưng tập tiểu cầu ống PRP cách so sánh lượng ánh sáng truyền qua ống so với ống chứng PPP (lượng ánh sáng truyền qua ống chứng PPP coi 100%) Lặp lại thí nghiệm lần nồng độ Đánh giá kết quả: 23 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tính theo cơng thức sau: X: Sự ngưng tập tiểu cầu chứng âm Y: Sự ngưng tập tiểu cầu chất thử Bên cạnh phần trăm ngưng tập tiểu cầu tốc độ thay đổi phút (Slope) số diện tích đường cong (AUC) đánh giá Slope số nhằm đánh giá giai đoạn đầu trình ngưng tập, giai đoạn tiểu cầu hoạt hóa Trong AUC số thể mức độ ngưng tập tiểu cầu tính từ thời điểm sau tiểu cầu biến dạng đến tiểu cầu ngưng tập tối đa Hiện nay, ba số nhà lâm sàng quan tâm việc đánh giá chức tiểu cầu người bệnh, có giá trị phân loại dạng bệnh lý tiểu cầu [27] Đánh giá tác dụng chống đông máu phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ Nguyên tắc: Thời gian đông máu in vitro đo máy ACL TOP500 theo nguyên lý đo quang (phương thức phát ánh sáng tán xạ), dựa theo mơ hình Li C.et al 2013 [27] Mục đích: - Đánh giá mơ hình tác dụng chống đơng máu in vitro - Nghiên cứu tác dụng chống đông máu in vitro phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ thông qua số PT, APTTvà TT Tiến hành: Chia 450 µL PPP vào ống máu loại chất chống đơng 24 Thêm 50µL hóa chất gồm DMSO 0,1%, heparin 0,2 IU/Ml vào phân đoạn dịch chiết Cốt khí củ với nồng độ 0,2 mg/mL vào ống theo thứ tự sau ủ 37 C vòng phút: ● Ống 1: Dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm) ● Ống 2: Dung dịch Heparin 0,2 UI/mL (chứng dương) ● Ống 3: Dung dịch EtoAc nồng độ 0,2 mg/mL ● Ống 4: Dung dịch EtOH nồng độ 0,2 mg/mL ● Ống 5: Dung dịch H2O nồng độ 0,2 mg/mL Tiến hành đo số PT, APTT TT máy ALC-TOP 500 Lặp lại thí nghiệm lần nồng độ 2.3 Phương pháp phân tích số liệu Tất thí nghiệm thực ba lần liệu biểu diễn dạng giá trị trung bình ± SD (SD: Độ lệch chuẩn) Số liệu xử lý thống kê phần mềm SPSS 23.0, sử dụng Test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey Sự khác biệt nhóm coi có ý nghĩa thống kê p < 0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết thực nghiệm 3.1.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết dược liệu + Đầu tiên lắc với n-Hexane: lít n-Hexane, để phân lớp tách lớp, thu phân lớp Hexane (1L), thực lặp lại lần, sau gộp lại tiến hành quay đuổi dung môi áp suất giảm thu cao chiết phân bổ Hexane có khối lượng = 4.4 g + Sau tiếp tục chiết ethyl acetate (EA): lít EA x lần, cô cạn 25 dung môi thu cao chiết phân bổ EA có khối lượng = 45 g + Dịch nước lại sau quay khơ có khối lượng vào khoảng 200 g Hình 3.1 Qúa trình phân lập hợp chất từ cao phân đoạn Hexane EtOAc Dựa kết phân tích sắc ký mỏng (SKBM) hình ta nhận thấy hai phân đoạn Hexane EA có khối lượng khác hầu hết hợp chất phân bổ giống Do tiến hành gộp hai phân đoạn lại thành phân đoạn EA có khối lượng khoảng gần 50g Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng khảo sát thành phần hóa học cao chiết tổng (MeOH) cao chiết phân bổ (n-Hexane, EA H2O) với hệ dung môi khác 26 Các phân đoạn tương ứng cốt khí củ phân đoạn cao chiết dung môi n-hexan phân đoạn cao ngâm chiết với dung mơi methanol, quy trình tạo cặn chiết MeOH tổng, phân đoạn chết cao ethyl acetate (EA),quá trình Sắc ký lớp mỏng khảo sát thành phần hóa học cao chiết tổng (MeOH) cao chiết phân bổ (n-Hexane, EA H 2O) với hệ dung môi khác tiến hành Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên VAST TS.Nguyễn Phi Hùng thực 3.1.2 Tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu lồi Cốt khí củ Diện tích đường cong AUC độ dốc S thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với cao chiết Cốt khí củ Bảng 3.1 bảng kết AUC thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu cao chiết từ Cốt khí củ (Aspirin 0,1 mg/mL DMSO 0,1% sử dụng làm chứng dương chứng âm ) Lô Hợp chất Nồng độ mg/mL AUC(%.min) p so với Aspirin p so với DMSO DMSO 0,1% 322,50±9,10 p
Ngày đăng: 16/09/2021, 14:24
Xem thêm:
