Đề tài thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng quét gốc tự do của các phân đoạn polysaccarid chiết xuất từ nấm Thượng hoàng.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN POLYSACCARID TỪ NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS TENG, HYMENOCHAETACEAE) Lê Thị Anh Thi**, Trần Công Luận*,****, Lê Trần Minh Thảo*, Nguyễn Ngọc Chương*, Cổ Đức Trọng*** TÓM TẮT Mục tiêu: Phellinus linteus loại nấm dược liệu quý coi thượng phẩm loại nấm có chứa hoạt chất có đặc tính chống khối u mạnh, phòng chống hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, giúp trẻ hóa thể… Các loại nấm chi Phellinus nhà khoa học giới quan tâm Trên giới, nhiều nhóm nghiên cứu kết hợp phương pháp nghiên cứu y dược học đại dược lý, miễn dịch, sinh học phân tử, dược lý tế bào chứng minh polysaccarid nấm Thượng hoàng thành phần có tác dụng chống oxy hóa Hiện nghiên cứu nước hợp chất polysaccarid nấm Vì đề tài thực với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng quét gốc tự phân đoạn polysaccarid chiết xuất từ nấm Thượng hoàng Đối tượng phương pháp: Nấm Thượng hồng cung cấp Cơng ty TNHH Linh chi VINA Chiết xuất tinh phân đoạn polysaccarid cột trao đổi ion resin DEAE-cellulose với nồng độ muối NaCl tăng dần, kiểm tra đo quang λ = 204 nm Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn phương pháp quét gốc tự DPPH (in vitro) Kết quả: Giá trị IC50 mẫu polysaccarid A, B, B11, B16 là: 284,19µg/ml; 220,44 µg/ml; 664,96 µg/ml; 194,76 µg/ml Kết luận: Polysaccarid toàn phần phân đoạn polysaccarid chiết từ nấm Thượng hồng có tác dụng chống oxy hóa theo hướng quét gốc tự thử nghiệm DPPH Từ khóa: Phellinus linteus, polysaccarid, chống oxy hóa ABSTRACT STUDY ON ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYSACCHARIDE FRACTIONS OF PHELLINUS LINTEUS TENG, HYMENOCHAETACEAE Le Thi Anh Thi, Tran Cong Luan, Le Tran Minh Thao, Nguyen Ngoc Chuong, Co Duc Trong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 100 - 104 Objective: Phellinus linteus, a rare medicinal fungus, contains the bioactive ingredients that have useful activities such as anti-tumor, prevention and treatment of cancer, rejuvenation Besides, antioxidant effects of polysaccharides of Phellinus linteus have been evidenced However, there are very few researches for polysaccharide compounds in Vietnam The purpose of this study was to evaluate the antioxydant activity and the free radical scavenging effect of polysaccharide extracted from Phellinus linteus Methods: Phellinus linteus was offered by Linh chi Vina Co, Ltd Extraction and purification of polysaccharide fractions were carried out by exchanged ion resin DEAE-cellulose column The free radical scavening effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical tests of crude polysaccharide and polysaccharide * Khoa Y học cổ truyền- ĐH Y dược Tp.HCM Cty TNHH Linh chi Vina Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Công Luận ĐT: 0903671323 100 Đại học Khoa học tự nhiên ĐH Tây đô Email: congluan53@gmail.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học fractions were performed Results: IC50 values of polysaccharide A, B, B11 and B16 were 284.19 µg/ml, 220.44 µg/ml, 664.96 µg/ml and 194.76 µg/ml, respectively Conclusion: Crude polysaccharide and polysaccharide fractions extracted from Phellinus linteus had antioxidant effects Key words: Phellinus linteus, polysaccharide, antioxidant activity C) (Merck, Đức) Phương pháp xác định khả ĐẶT VẤN ĐỀ quét gốc tự (thử nghiệm DPPH) Phellinus linteus loại nấm dược liệu quý Dung dịch DPPH coi thượng phẩm loại nấm Pha dung dịch DPPH 0,6 mM có chứa hoạt chất có đặc tính chống khối u methanol (MeOH) 70% cách hòa tan 5,915 mạnh, phòng chống hỗ trợ điều trị bệnh mg DPPH vào 17,5 ml MeOH cho vào bình định ung thư, giúp trẻ hóa thể(3,5,7) Hợp chất mức sau thêm nước cho đủ 25 ml polysaccarid nấm Thượng Hồng có hoạt Mẫu thử tính chống khối u cao loại nấm Cân xác 10 mg mẫu khơ, thêm có khả kích thích miễn dịch kìm hãm nước vào hòa tan cho vào bình định mức 10 ml sinh sản tế bào khối u(1,2,4) Tuy nhiên, thêm nước đến vạch dung dịch mẫu có nghiên cứu nước hợp chất nồng độ 1000 µg/ml Các mẫu thử tiến polysaccarid nấm Chính hành nghiên cứu ngưỡng nồng độ từ vậy, đề tài “Khảo sát tác dụng chống oxy hóa 10 đến 700 µg/ml (các mẫu thử pha nước) phân đoạn polysaccaride từ nấm Thượng Tương tự với mẫu chứng dương khoảng hoàng (Phellinus linteus Teng)” thực nồng độ từ 10 đến 40 µg/ml 0,5 ml mẫu thử với mục tiêu khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in hay mẫu chứng dương nồng độ khảo sát vitro phân đoạn polysaccharide từ nấm cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH Thượng hoàng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2Thêm MeOH 70% vừa đủ ml Ống chứng: 0,5 ml DPPH thêm vào 3,5 ml MeOH 70% Lắc đều, picrylhydrazyl (DPPH) hỗn hợp sau pha để nhiệt độ phòng ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 30 phút Đo quang bước sóng = 516 nm Đối tượng nghiên cứu Nấm Thượng hồng cung cấp Cơng ty TNHH Linh chi VINA Mẫu định danh lưu trữ Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh Nguyên liệu xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát chiết xuất theo sơ đồ Vật liệu nghiên cứu Cồn 96%, muối ăn (NaCl), bán thấm cho phép chất có trọng lượng phân tử thấp (đường monose, lipid, muối khoáng, acid amin…) qua, resin DEAE-cellulose, 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sigma, Mỹ), MeOH (Trung Quốc), acid ascorbic (Vitamin Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Cách tính kết Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) tính theo cơng thức: HTCO (%) (ODc ODt ) 100 ODc Trong đó: ODc: Mật độ quang dung dịch DPPH MeOH ODt: Mật độ quang DPPH mẫu thử Từ HTCO (%) nồng độ mẫu dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn tính IC50 (khả đánh bắt 50% DPPH mẫu) Giá trị IC50 thấp tương ứng với HTCO cao ngược lại Các số liệu kết thử nghiệm biểu thị trung bình lần đo khác 101 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Chiết xuất tinh polysaccarid từ nguyên liệu(4,6) Error! Bột nấm Cồn 96%, 7lít Hồi lưu 12 h (3 lần) Bã Dịch chiết cồn lít H2O, đun100 C, h (5 lần) Bã Dịch chiết nước Cô 1:1 Cao nước Tủa cồn 96% (1:5) Tủa (polysaccharid thơ TP) Thẩm tích Dịch qua màng thẩm tích Cắn khơng tan Poly B DEAE-cellulose Rửa nước Dịch nước Rửa muối Các phân đoạn polysaccarid Sơ đồ Quy trình chiết xuất tinh polysaccarid 102 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Chiết xuất tinh polysaccarid từ nguyên liệu Kết chiết polysaccarid thơ tồn phần (polysaccarid A) từ 700 g ngun liệu ban đầu 25,04 g, hiệu suất chiết 3,58% Kết tinh polysaccarid thơ tồn phần sau thẩm tích thu 0,44 g cắn không tan nước, hay loại dung mơi khác Dịch lại tiến hành đông khô thu 8,64 g (polysaccarid B) B11 Nghiên cứu Y học Tiến hành rửa giải polysaccarid B cột trao đổi ion DEAE-cellulose với nồng độ muối NaCl tăng dần, quay, thẩm tích loại muối, đông khô chân không thu 23 phân đoạn Trong phân đoạn polysaccarid B5 (5,0 mg), B7 (6,3 mg), B11 (9,1 mg) nồng độ muối 0,22 M, B12 (7,0 mg), B14 (5,6 mg), B15 (6,8 mg), B16 (12 mg) nồng độ muối 0,3 M, B18 (8,0 mg), B19 (4,0 mg), B21 (3,2 mg), B22 (8,0 mg), B23 (6,1 mg) có độ hấp thu tử ngoại 204 nm đạt trị số cao (Hình 1) B16 OD 204nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100 200 300 400 -0.2 Số ống nghiệm hứng phân đoạn Hình1: Đồ thị phân đoạn rửa giải nồng độ muối NaCl - 1M tiến hành thí nghiệm khảo sát tác dụng Kết thử nghiệm DPPH in vitro chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Vì lượng mẫu phân đoạn polysaccarid phân đoạn polysaccarid A, polysaccarid B, thu qua sắc kí cột trao đổi anion DEAEpolysaccarid B11 polysaccarid B16 cellulose ít, có phân đoạn polysaccarid B11 B16 nhiều Do vậy, chúng tơi Bảng 4: Hoạt tính chống oxy hóa in vitro mẫu polysaccarid chiết từ nấm Thượng hoàng so với vitamin C Nồng độ Polysaccarid A µg/ml OD trung HTCO % bình 1000 800 600 0,147 80,05 500 0,165 77,59 400 0,210 71,43 300 0,318 56,73 200 0,456 37,87 100 0,562 23,58 50 0,656 10,75 Polysaccarid B Polysaccarid B11 Poysaccarid B16 OD trung OD trung OD trung HTCO % HTCO % HTCO % bình bình bình 0,281 59,53 0,319 54,12 0,134 83,25 0,359 48,42 0,086 87,59 0,127 82,21 0,093 86,63 0,160 80,01 0,432 37,98 0,107 84,62 0,277 65,46 0,155 77,73 0,354 55,81 0,521 25,14 0,297 57,33 0,577 28,09 0,597 14,17 0,454 34,82 0,695 10,66 0,625 10,11 0,587 15,61 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Vitamin C OD trung HTCO % bình - 103 Nghiên cứu Y học Nồng độ Polysaccarid A µg/ml OD trung HTCO % bình 40 35 30 25 20 15 10 0,694 5,58 0,735 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Polysaccarid B Polysaccarid B11 Poysaccarid B16 OD trung OD trung OD trung HTCO % HTCO % HTCO % bình bình bình 0,735 0,696 0,696 Nhận xét bàn luận Qua thông số bảng trên, vẽ vào phần mềm Excel ta có phương trình tuyến tính hoạt tính chống oxy hóa sau: Polysaccarid A: y = 0,1548x + 6,0066 (R2 = 0,9835) Polysaccarid B: y = 0,1919x + 7,6970 (R2 = 0,9497) dụng chống oxy hóa in vitro theo hướng quét gốc tự thử nghiệm DPPH TÀI LIỆU THAM KHẢO Phân đoạn polysaccarid B11: y = 0,0598x + 10,235 (R2 = 0,9645) Phân đoạn polysaccarid B16: y = 0,1972x + 12,605 (R2 = 0,9511) Vitanin C: y = 7,7081x – 7,1249 (R2 = 0,9913) Từ suy IC50 mẫu polysaccarid A, B, B11, B16 là: 284,19 µg/ml; 220,44 µg/ml; 664,96 µg/ml; 194,76 µg/ml vitamin C 7,41 µg/ml Vitamin C OD trung HTCO % bình 0,239 69,78 0,302 61,82 0,380 51,96 0,485 38,68 0,553 30,09 0,633 19,98 0,672 15,04 0,791 Chen CY, Kim SH, Zhu T (2008) “A medicinal mushroom: Phellinus linteus” Current medicinal chemistry 15:1330-1335 Inoue M, Kojima K, Mizukami H, Nagatsu A, Ohno T (2008) “Phellifuropyranone A: A new furopyranone compound isolated from fruit bodies of wild Phellinus linteus” Chem Pharm Bull 56 (2):173-175 Jiménez-Medina E, Berruguilla E, Romero I, Algarra I, Collado A, Garrido F, and Garcia-Lora A (2008) “The immunomodulator PSK induces in vitro cytotoxic activity in tumour cell lines via arrest of cell cycle and induction of apoptosis” BMC Cancer, 8:78 Kim GY, Lee JD, Lee SJ, Park HS (2003) “Purification and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting body of Phellinus linteus (Berk & M.A Curtis) Teng” Bioresource Technology 89:81-87 Kim GY, Roh SI, Park SK, Ahn SC, Oh YH, Lee JD, Park YM (2003) “Alleviation of experimental septic shock in mice by acidic polisaccharide isolated from the medicinal mushroom Phellinus linteus” Biol.Pharm.Bull; 26(10):1418-1423 Liu YF, Tang QJ, Yang Y, Ye LB, Zhang JS (2009).“Structural analysis of a bioactive polysaccaride PISP1 from the medicinal mushroom Phellinus igniarius” Biosci.Biotechnol.Biochem; 73(1):13-139 Mau JL, Lin HC, Chen CC (2002) “Antioxidant properties of several medicinal mushrooms” J Agri Food Chem; 50 (21):6072-6077 Phân đoạn polysaccarid B16 có IC50 thấp tương ứng với khả chống oxy hóa cao so với phân đoạn polysaccarid A, B B11 Tuy nhiên hoạt tính chống oxy hóa mẫu polysaccarid yếu hoạt chất đối chiếu dương vitamin C Ngày nhận báo: 27/02/2015 KẾT LUẬN Ngày phản biện nhận xét báo: 18/05/2015 Ngày báo đăng: 08/09/2015 Polysaccarid toàn phần phân đoạn polysaccarid chiết từ nấm Thượng hồng có tác 104 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... Các mẫu thử tiến polysaccarid nấm Chính hành nghiên cứu ngưỡng nồng độ từ vậy, đề tài Khảo sát tác dụng chống oxy hóa 10 đến 700 µg/ml (các mẫu thử pha nước) phân đoạn polysaccaride từ nấm Thượng. .. khoảng hoàng (Phellinus linteus Teng)” thực nồng độ từ 10 đến 40 µg/ml 0,5 ml mẫu thử với mục tiêu khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in hay mẫu chứng dương nồng độ khảo sát vitro phân đoạn polysaccharide... hứng phân đoạn Hình1: Đồ thị phân đoạn rửa giải nồng độ muối NaCl - 1M tiến hành thí nghiệm khảo sát tác dụng Kết thử nghiệm DPPH in vitro chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Vì lượng mẫu phân đoạn polysaccarid