Phân lập vi nấm kháng vi sinh vật từ đất công viên ở thành phồ hồ chí minh

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: PHÂN LẬP VI NẤM KHÁNG VI SINH VẬT TỪ ĐẤT CƠNG VIÊN Ở THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH Số hợp đồng: 2020.01.074/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 03/2020 – 11/2020 TP Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 09 năm 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: PHÂN LẬP VI NẤM KHÁNG VI SINH VẬT TỪ ĐẤT CÔNG VIÊN Ở THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH Số hợp đồng: 2020.01.074/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 03/2020 – 11/2020 Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Ký tên MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM SỢI .2 1.1 Đặc điểm vi nấm sợi 1.2 Nguồn lợi vi nấm sợi đất TỔNG QUAN VỀ HỆ VI NẤM SỢI TRONG ĐẤT 2.1 Nghiên cứu giới .5 2.2 Nghiên cứu nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 1.1 Đối tượng nghiên cứu 1.2 Dung mơi – hóa chất 1.3 Vi sinh vật thử nghiệm 1.4 Môi trường nuôi cấy 1.5 Trang thiết bị 10 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Phân lập vi nấm từ mẫu đất 10 2.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu đất .10 2.1.2 Phân lập vi nấm 11 i 2.2 Định danh vi nấm sợi 11 2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn kháng nấm Candida chất biến dưỡng từ vi nấm 12 2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm 12 2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn – kháng nấm Candida 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .14 KẾT QUẢ 14 1.1 Phân lập vi nấm 14 1.2 Định danh vi nấm .14 1.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật chất biến dưỡng từ vi nấm 15 1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 21 3.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm Candida 23 3.2 BÀN LUẬN 25 3.2.1 Phân lập định danh vi nấm 25 3.2.2 Hoạt tính sinh học chất biến dưỡng từ vi nấm đất 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 4.1 KẾT LUẬN 29 4.2 ĐỀ NGHỊ .30 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: Môi trường nuôi cấy ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ec Escherichia coli LPCB Lactophenol coton blue MHA Mueller Hinton Agar MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicillin Pa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar Sa Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar Sf Streptococcus faecalis TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết định danh vi nấm phân lập từ đất công viên Tp.HCM 14 Bảng 3.2 Vi nấm có hoạt tính kháng khuẩn 21 Bảng 3.3 Vi nấm có hoạt tính kháng nấm Candida 24 Bảng 3.4 Tỷ lệ phân bố vi nấm phân lập từ đất công viên Tp.HCM 26 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Một số mẫu Penicillium 15 Hình 3.2 Một số mẫu Aspergillus 16 Hình 3.3 Paecilomyces sp G46 .17 Hình 3.4 Trichoderma sp T411 18 Hình 3.5 Mucor sp T13 18 Hình 3.6 Fusarium H22 19 Hình 3.7 Phoma sp T23 19 Hình 3.8 Curvularia sp G26 20 Hình 3.9 Cladosporium sp H57 20 v ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật sống khắp nơi Trái Đất, nơi mà điều kiện tưởng chừng khắc nghiệt thấy có phát triển vi sinh vật Vi sinh vật đất nước có vai trị quan trọng lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y tế… Hiện nay, tượng đề kháng kháng sinh ngày lan rộng gây nhiều khó khăn cho việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn Việc tìm kiếm hoạt chất có tính kháng sinh có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt từ chủng vi sinh vật, nhiều nhà khoa học quan tâm Trên giới, nhà khoa học tập trung theo hướng tìm kiếm hoạt chất thiên nhiên có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất biến dưỡng từ vi sinh vật Trong nước có số đề tài tương tự thực vùng Tp Cần Thơ, huyện Cần Giờ…Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu thường ứng dụng để bảo vệ trồng [3,9] Chỉ có số đề tài tiến hành phân lập chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh người động vật [4] Việc nghiên cứu sàng lọc vi nấm có hoạt tính sinh học từ đất mang ý nghĩa khoa học thiết thực nhằm khai thác nguồn lợi thiên nhiên cách hợp lý Với mục tiêu trên, thực đề tài “PHÂN LẬP VI NẤM CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT TỪ NGUỒN ĐẤT Ở CÔNG VIÊN THUỘC TP HỒ CHÍ MINH” Mục tiêu đề tài gồm: - Phân lập vi nấm từ đất vườn số vùng thuộc Tp.HCM - Định danh vi nấm phân lập chủng - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng Candida chất biến dưỡng vi nấm sản xuất CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ VI NẤM SỢI 1.1 Đặc điểm vi nấm sợi Vi nấm xếp loại giới Nấm (Fungi) Vi nấm nhóm nấm có kích thước hiển vi thuộc nhóm sinh vật nhân thật (Eukaryote) Vi nấm sinh vật dị dưỡng, có đời sống hoại sinh ký sinh Tế bào vi nấm khơng có diệp lục nên khơng tự quang hợp có hệ thống enzym dồi (cellulase, protease, catalase…) tham gia chuyển hóa chất Chúng tiết enzym môi trường giúp phân giải hợp chất phức tạp thành hợp chất đơn giản để hấp thu Tùy theo cấu tạo, chia vi nấm thành hai nhóm gồm dạng nấm men (yeast) có cấu trúc đơn bào nấm sợi (hyphae) có cấu trúc đa bào Dựa vào vai trị, nấm đất chia thành ba nhóm: [18] - Decomposers - nấm hoại sinh: nhóm nấm giúp biến đổi vật liệu hữu chết thành sinh khối nấm, carbon dioxide (CO2) phân tử nhỏ acid hữu Những loại nấm thường sử dụng chất phức tạp cellulose lignin Chúng cần thiết việc phân hủy cấu trúc vòng carbon số chất gây nhiễm Giống vi khuẩn, chúng đóng vai trò quan trọng giúp giữ lại chất dinh dưỡng đất - Mutualists - nấm mycorrhizal: nhóm nấm cộng sinh rễ loài Để đổi lấy chất dinh dưỡng từ cây, vi nấm giúp hịa tan chuyển hóa chất phốt pho, nitơ, chất vi lượng… có đất khơng khí cho sử dụng - Pathogens hay Parasites - nấm ký sinh gây bệnh: nhóm nấm thường gây giảm suất trồng, gây bệnh gây chết sinh vật chúng xâm chiếm rễ cơng sinh vật khác Các vi nấm thuộc nhóm thường gặp Verticillium, Pythium Rhizoctonia Chúng gây thiệt hại kinh tế lớn nông nghiệp năm Tuy nhiên, nhiều lồi nấm giúp kiểm sốt bệnh trồng chúng thiên địch số loài sâu hại vi nấm gây bệnh khác Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 giống 50.000 lồi mơ tả, nhiên, ước tính có 100.000 đến 250.000 lồi nấm diện Trái đất 1.2 Nguồn lợi vi nấm sợi đất Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến sống người cách trực tiếp làm hư hỏng, giảm chất lượng thực phẩm trước sau thu hoạch, chế biến bảo quản Nấm mốc gây hư hại vật dụng, quần áo gây bệnh cho người, động vật trồng Nhưng bên cạnh đó, vi nấm cịn giữ vai trị quan trọng việc phân giải chất hữu trả lại độ màu mỡ cho đất trồng Các quy trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men cần đến có mặt vi sinh vật, có nấm mốc Nấm men sử dụng để sản xuất rượu vang hay bia Chúng thêm vào bột để làm bánh mì có độ nở định, số sử dụng để sản xuất mát Ở châu Á, số vi nấm thêm vào đậu nành để tạo số thực phẩm nước tương ủ nấm mốc Aspergillus (A.oryzae, A.soyae, A.niger, A.terriol… ) [2] Nấm có lợi với số vi khuẩn hình thành mạng lưới bảo vệ xung quanh rễ để bảo vệ chủ Nấm Trichoderma bảo vệ rễ khỏi cơng vi sinh vật có hại Nấm cung cấp lớp vỏ bảo vệ để cung cấp nước phốt cho rễ hạn hán Bên cạnh đó, Trichoderma có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào amylase, protease… có khả kháng số bệnh hại trồng [5, 23, 24, 26, 28] Hợp chất cytosporone chiết tách từ nước dùng lên men nấm Trichoderma sp FKI-6626 Cấu trúc hóa học xác định chủ yếu quang phổ NMR khối phổ Hợp chất thể hoạt tính kháng khuẩn chống lại số loài vi khuẩn S.aureus, E.coli, P.aeruginosa vi nấm gây bệnh Candida albicans, Aspergillus oryzae, Mucor racemosu…[19] Trichoderma viride phân lập từ đất trồng dưa leo trang trại Omar Makram (Beheara Governorate, Ai Cập) vào mùa thu hoạch mùa đông năm 2012/2013 thử nghiệm chất kháng khuẩn, chất chống oxy hoá chống ung thư 3 10 11 Penicillium T17 Penicillium T18 Penicillium T11 - - - G58 Penicillium H23 - G33 09 13 Aspergill 15 15 us 09 - - - - - Aspergill 14 16 us 2 - 13 21 12 12 - - - G51 11 - - - - Aspergill - - - - - - - 13 - - - 11 - - - - - - - - - - - - - - 11 - - 2 - - - - - - 17 us G52 Aspergill 18 us G53 19 - - Aspergill us G54 Aspergill 20 - - - - - G42 12 - - - - - Aspergill - - - - - - - - - - H43 - - 08 Trichoder - - ma - 6 21 us - G13 09 - Aspergill - 22 us - G21 10 - Aspergill - 09 14 10 12 - - - - - - 23 us G24 24 2 14 - Aspergill us G31 1 1 1 0 - 13 15 10 16 12 10 14 - - - - - - - - 15 us - G56 us 2 Penicillium - H13 Penicillium Penicillium 14 - G57 Aspergill - T33 Penicillium - - - - G55 - - Penicillium - - - T216 - - 2 Penicillium - 1 1 12 10 - 15 10 - 14 1 1 18 13 18 - 12 15 - 17 Trichoder 12 ma G34 Trichoder 13 ma T35 - - - - - - - - - 09 - - - - - - - - - 20 - 20 - - 11 - - - - - - - - - - - - - - - 25 26 T212 H14 - 27 H34 1 - 07 - Có 27/103 chủng vi nấm thể hoạt tính kháng khuẩn gồm 10 chủng Penicillium, 11 chủng Aspergillus, 03 chủng Trichoderma 03 chủng không đủ sở định danh Cả 27 chủng vi nấm thể hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương vi khuẩn S.feacalis S.aureus hai Hoạt tính kháng MRSA xuất chủ yếu 10/11 chủng Aspergillus, rải rác 03 chủng Penicillium, 01 chủng Trichoderma chủng H34 Chỉ có 13 chủng thể hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm gồm chủng Aspergillus, chủng Penicillium, chủng Trichoderma chủng TD212 Cụ thể: - Các chủng Penicillium thể tính kháng chủ yếu với vi khuẩn Gram dương, bật chủng H23 kháng S.aureus với vòng ức chế 26 mm Chủng Penicillium cho hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm yếu với chủng T216 kháng E.coli (11 mm) chủng H43 kháng P.aeruginosa (08 mm) - 11 chủng Aspergillus thể hoạt tính kháng khuẩn 05 lồi vi khuẩn thử nghiệm, trội chủng G13, G31, G33, G51 H13; riêng G52 thể tính kháng S.aureus MRSA; G53 thể tính kháng vi khuẩn Gram dương, đặc biệt S.feacalis (20 mm) - 03 chủng Trichoderma thể tính kháng chủ yếu với vi khuẩn Gram dương, T35 cho tác động kháng 04/05 loài vi khuẩn thử nghiệm, đặc biệt S.feacalis S.aureus (16 20 mm) - 03 chủng chưa định danh thể hoạt tính kháng khuẩn Trong đó, chủng T212 cho hoạt tính kháng khuẩn tốt E.coli P.aeruginosa với vòng ức chế 20 mm Bên cạnh đó, kết cho thấy đa phần chủng Aspergillus nuôi cấy môi trường thể tính kháng khuẩn tốt mơi trường phù hợp với Trichoderma 3.3 Khảo sát hoạt tính kháng Candida Có 12 chủng thể hoạt tính kháng Candida Trong đó, 09/12 chủng thể hoạt tính kháng C.albicans chủng Candida thường gây bệnh lâm sàng Các chủng cho tính kháng C.albicans bật gồm Pencillium T33, Penicillium T34 chủng H34 Cả 12 chủng thể tính kháng C.glabrata C.tropicalis hai – chủng Candida gây bệnh lâm sàng tỉ lệ đề kháng thuốc cao Các chủng có khả kháng C.glabrata/C.tropicalis trội gồm Pencillium T33, Penicillium T34, Trichoderma H32 04 chủng G36, G38, G49, H34 Bên cạnh đó, kết cho đa phần chủng vi nấm thể hoạt tính kháng Candida tốt nuôi cấy môi trường hỗn hợp nước chiết ngô cao nấm men Như vậy, có 03 chủng vi nấm vừa thể tính kháng khuẩn vừa thể tính kháng nấm Candida gồm Penicillium T33, Aspergillus G51 chủng H34 T Chủng T nấm Mơi trườn g Đường kính vịng ức chế (mm) T Candid Candid Candid a a a T Chủn Môi g trườn nấm g Đường kính vịng ức chế (mm) Candid Candid Candid a a a albican glabrat tropical albican glabrat tropical s a is s a is - - - 11 16 15 - - 15 - - 13 09 - 13 13 - 18 - - - 10 12 - - - 15 10 - 16 11 - 14 20 - 18 Penicillium - - - T33 21 22 28 Penicillium - - - T34 20 25 28 Aspergillus - - 12 G51 - - - Trichoder - - - - 20 - 16 10 19 10 08 - 15 - 18 12 09 18 ma H32 G36 G38 G44 G47 G49 10 H17 11 H19 12 H34 Kết luận đề xuất Theo kết thực nghiệm, vi nấm sợi đất nội thành Tp.HCM chiếm tỉ lệ cao gồm Penicillium (35,9%), Aspergillus (16,5%), Trichoderma (5,8%)… Kết phân lập định danh chứng tỏ hệ vi nấm đất thuộc Tp.HCM đa dạng phù hợp với nghiên cứu hệ vi nấm đất giới nghiên cứu Admetz, Oudermans Koning… [10] Qua khảo sát sơ hoạt tính kháng khuẩn kháng Candida cho thấy số chủng vi nấm tiềm có khả sản xuất chất biến dưỡng thể hoạt tính sinh học tốt Có 03 chủng gồm Penicillium T33, Aspergillus G51 chủng H34 vừa thể tính kháng khuẩn vừa thể tính kháng Candida Sự khác biệt hệ vi nấm đất thuộc Tp.HCM khu vực giới khác biệt điều kiện thổ dưỡng, địa lý khí hậu [6,7,9] Tài liệu tham khảo Trần Thị Minh Định, Trần Thị Thanh Thủy (2013), "Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Aspergillus terreus phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ sinh tổng hợp chất kháng sinh", Tạp chí Khoa học ĐHSP TPHCM, tr 119-125 Nguyễn Thị Hà (2014), "Phân lập tuyển chọn số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng khuẩn quận Ninh Kiều, Tp Cần thơ", Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, tr 7-11 Phạm Thị Ánh Hồng, Đinh Minh Hiệp cộng (2005), "Điều tra khảo sát phân bố chủng nấm Trichoderma Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh Đơng Nam Bộ", Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005, tr 17-19 Nguyễn Thiện Phú, Vũ Thị Phương (2016), "Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi có khả tạo Lovastatin từ rừng ngập mặn Cần Giờ.", Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM, (87), tr 113-126 Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr 80 Awad N E, Kassem H A, Hamed M A, El-Feky A M, et al (2018), "Isolation and characterization of the bioactive metabolites from the soil derived fungus Trichoderma viride", Mycology, (1), pp 70-80 E Gharaei-Fathabad, Tajick-Ghanbary M, Shahrokhi N (2014), "Antimicrobial Properties of Penicillium Species Isolated from Agricultural Soils of Northern Iran", Research Journal of Toxins, (1), pp 1-7 R Koffler, Liggett W (1948), Corn steep liquor in microbiology, Bacteriol Reviews, pp 297–311 Svahn K S, Göransson U, El-Seedi H, Bohlin L, et al (2012), "Antimicrobial activity of filamentous fungi isolated from highly antibiotic-contaminated river sediment", Infection Ecology & Epidemiology, pp 11591 10 Watanabe T (2002), Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi: morphologies of cultured fungi and key to species, CRC PRESS, pp 1-2 Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ NTTU đề tài mã số 2020.01.074 ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF FILAMENTOUS FUNGI ISOLATED FROM SOIL IN PARKS OF HO CHI MINH CITY (VIETNAM) Mai Ha Thanh Binh, Le Quang Hanh Thu* Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University *lqhthu@ntt.edu.vn Abstract: The aim of our study was to isolate fungi from soil in parks of Ho Chi Minh city, identify and evaluate antimicrobial activities of metabolites from these fungi There were 69 isolates were identified belong to 09 genous such as Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Fusarium, Phoma, Curvularia, Paecilomyces, Cladosporium and 34 isolates couldn’t identified 27 isolates include Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, and some strains of unidentified fungi showed the antibiotic activity against Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus feacalis, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa 12 isolates include Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, and some strains of unidentified fungi effected against Candida albicans, C.glabrata and C.tropicalis Keywords: antimicrobial, fungi, against Candida NTTU-NCKH-03 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2020 I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài (Tiếng Việt Tiếng Anh) 1a Mã số Phân lập vi nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật từ nguồn đất số cơng viên địa bàn TP Hồ Chí Minh 2020.01.074 1b Lĩnh vực nghiên cứu: Vi sinh Thời gian thực hiện: 09 tháng (Từ tháng 03/2020 đến tháng 11/2020) Tổng kinh phí thực hiện: 15 triệu đồng, đó: Kinh phí (triệu đồng) Nguồn - Từ Quỹ NTTU 15 - Từ nguồn khác 00 Phương thức khoán chi:  Khoán đến sản phẩm cuối Khốn phần, đó: - Kinh phí khốn: …………… triệu đồng - Kinh phí khơng khốn: …… ….triệu đồng Chủ nhiệm đề tài Họ tên: LÊ QUANG HẠNH THƯ Ngày, tháng, năm sinh: 15/09/1988 Giới tính: Nam 󠄄 Nữ  Học hàm, học vị/ Trình độ chuyên môn: Thạc sĩ Đơn vị công tác: Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành Chức vụ: Giảng viên Địa liên lạc: Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành Điện thoại: 0907.799.790 Email: lqhthu@ntt.edu.vn Các tổ chức phối hợp thực đề tài (nếu có) Tên quan chủ quản Điện thoại: Fax: Địa chỉ: Họ tên thủ trưởng tổ chức: Các cán sinh viên thực đề tài (Ghi người có đóng góp khoa học chủ trì thực nội dung tham gia thực đề tài) Cán giảng viên ( tối đa người) TT Họ tên Chuyên ngành Đơn vị Nội dung tham gia Ký tên Sinh viên/ Học viên cao học/ Nghiên cứu sinh ( tối đa người) Đối tượng TT Họ tên (SV/ HV cao học/ NCS) Tên đơn vị Cán hướng dẫn Ký tên II MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Mục tiêu đề tài (Bám sát cụ thể hoá định hướng mục tiêu theo đặt hàng) - Phân lập vi nấm từ đất trồng số công viên địa bàn Tp Hồ Chí Minh - Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật mẫu vi nấm phân lập - Định danh sơ mẫu vi nấm có hoạt tính tốt Tình trạng đề tài 󠄄 Mới  Kế tiếp hướng nghiên cứu nhóm tác giả 󠄄 Kế tiếp nghiên cứu người khác 10 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải mục tiêu nội dung nghiên cứu 10.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Ngồi nước: Trên giới, có nhiều nghiên cứu tiến hành phân lập vi nấm từ vùng đất địa phương có điều kiện tự nhiên khác đất ngập mặn, đất nhiễm phèn, đất đồng bằng/đồi núi, đất nông nghiệp, đất trầm tích… Kết nghiên cứu cho thấy diện vi nấm thường gặp đất Aspergillus, Penicillium, Trichoderma; đồng thời cũng cho thấy khác biệt phân bố vi nấm vùng đất Mucor Penicillium thường xuất đất vùng ơn đới hay vùng có khí hậu mát mẻ, Aspergillus có đất vùng nhiệt đới, Trichoderma xuất đất có tính chất ẩm ướt hay có tính acid… Nhiều nghiên cứu quan tâm đến khả kháng vi sinh vật tác dụng sinh học vi nấm từ đất khả bảo vệ rễ trồng Trichoderma khỏi cơng vi sinh vật có hại, khả sinh tống hợp enzym ngoại bào có khả kháng số bệnh hại trồng, hợp chất cytosporone chiết từ nước dùng lên men Trichoderma chứng minh có tác dụng kháng S.aureus, E.coli, P.aeruginosa, Candida số nấm mốc (theo Ishii cộng 2013) Một số chủng nấm Penicillium phân lập từ đất nông nghiệp Bắc Iran thể hoạt tính kháng đáng kể Candida albicans, Bacillus subtilis, S.aureus, Salmonella typhi E.coli (theo E Gharaei-Fathabad cộng 2014) Các chủng Aspergillus thể hoạt tính kháng khuẩn tốt vi khuẩn MRSA, E.coli, Enterococcus feacalis kháng vancomycin Candida albicans (theo Svahn K S cộng 2012) Trong nước: Một số đề tài tương tự thực vùng Tp.Cần Thơ, huyện Cần Giờ… Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu thường tập trung khai thác nguồn vi nấm từ vùng đất có điều kiện khắc nghiệt rừng ngập mặn, đất nhiễm phèn đất nơng nghiệp Bên cạnh đó, kết nghiên cứu thường ứng dụng để bảo vệ trồng kháng bệnh sâu khoang trồng… Theo nghiên cứu Trần Thị Minh Định Trần Thị Thanh Thủy phân lập 58 chủng nấm từ đất rừng ngập mặn Cần Giị, tuyển chọn 01 Aspergillus terrus thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh E.coli Bacillus subtilis; đồng thời nhóm nghiên cứu khảo sat điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu hoạt chất kháng khuẩn từ chủng A.terrus Một nghiên cứu khác từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ tác giả Nguyễn Thiện Phú Vũ Thị Phương phân lập 120 chủng vi nấm tuyển chọn chủng vi nấm có khả sản xuất lovastatin Cũng rừng ngập mặn Cần Giờ, nghiên cứu Võ Thị Bích Viên phân lập 476 chủng vi nấm chứng minh chủng Penicillium có tính kháng Bacillus subtilis đáng kể Nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Hà phân lập 11 chủng nấm từ đất quận Ninh Kiều, Cần Thơ cho hoạt tính kháng E.coli B.subtilis, chủng Penicillium pinophilum Fusarium solani cho hoạt tính tốt Đa phần nghiên cứu nước phân lập từ đất chủng vi nấm chủ yếu thuộc chi gồm Aspergillus, Penicillium Trichoderma Các chủng vi nấm thể hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh hại trồng có khả sản xuất chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học tốt 10.2 Luận giải việc đặt mục tiêu nội dung, phạm vi/đối tượng cần nghiên cứu đề tài Như vậy, đất coi mơi trường thích hợp cho phát triển vi sinh vật tận dụng để phân lập vi sinh vật hữu ích Trong nước, đa phần nghiên cứu có nội dung tương tự miền Nam tập trung khai thác nguồn vi nấm có lợi khu vực rừng ngập mặn, số nghiên cứu thực đất nông nghiệp Bên cạnh đó, số nghiên cứu vi nấm thường tập trung lớp đất gần rễ trồng Do đó, nhóm nghiên cứu tập trung khai thác nguồn vi nấm có lợi từ đất trồng lâu năm/cây cổ thụ số công viên thuộc Tp.HCM Đây nghiên cứu ban đầu giúp tìm kiếm nguồn thu chất có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt 11 Liệt kê danh mục cơng trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dẫn đánh giá tổng quan Trần Thị Minh Định, Trần Thị Thanh Thủy (2013), "Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp để chủng Aspergillus terreus phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ sinh tổng hợp chất kháng sinh", Tạp chí Khoa học ĐHSP TPHCM, tr 119-125 Nguyễn Thị Hà (2014), “Phân lập tuyển chọn số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng khuẩn từ đất quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ”, Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ 34(2014), tr 7-11 Nguyễn Thiện Phú, Vũ Thị Phương (2016), “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi có khả tạo lovastatin từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM, 9(87), tr 113-126 Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM, tr 80 E Gharaei-Fathabad, Tajick-Ghanbary M, Shahrokhi N (2014), “Antimicrobial properties of Penicillium species isolated from argricultural soils of Northern Iran”, Research Journal of Toxins, 6(1), pp.1-7 Ishii T, Nonaka K, Suga T, Masuma R, et al (2013), "Cytosporone S with antimicrobial activity, isolated from the fungus Trichoderma sp FKI-6626", Bioorg Med Chem Lett, 23 (3), pp 679-681 Karaoglu S A, Ulker S (2006), "Isolation, identification and seasonal distribution of soilborne fungi in tea growing areas of Iyidere-Ikizdere vicinity (Rize-Turkey)", J Basic Microbiol, 46 (3), pp 208-218 Svahn K S, Göransson U, El-Seedi H, Bohlin L, et al (2012), "Antimicrobial activity of filamentous fungi isolated from highly antibiotic-contaminated river sediment", Infection Ecology & Epidemiology, pp 11591 12 Nội dung nghiên cứu khoa học, triển khai thực nghiệm phương án thực Nội dung 1: Phân lập vi nấm từ đất trồng số công viên địa bàn Tp.HCM - Thu mẫu đất 03 công viên địa bàn Tp.HCM gồm công viên Gia Định, cơng viên Hồng Văn Thụ, cơng viên Tao Đàn Chọn đất nơi có bóng râm, gần rễ lớn/cây cổ thụ; Loại bỏ rác/sỏi đá bề mặt, thu mẫu đất độ sau cm dụng cụ thích hợp giữ mẫu đất petri vơ trùng Rây đất qua lưới cỡ 1mm - Pha loãng mẫu đất với nước vơ trùng với độ pha lỗng từ 10 -1 đến 10 -5 Cụ thể: cho g đất vào ml nước vô trùng, lắc kỹ thu dịch nước có độ pha lỗng 10-1 (dung dịch 1) Sau lắc kỹ, để lắng phân tử lớn hút ml dung dịch cho vào ml nước vô trùng để thu dịch nước có độ pha lỗng 10-2 Lặp lại để thu dung dịch có độ pha lỗng từ 10-2 đến 10-5 Trải 0,1 ml dung dịch độ pha lỗng lên mơi trường Potato Dextrose Agar (PDA) thêm cloramphenicol 0,1% Các đĩa thạch ủ nhiệt độ phòng theo dõi xuất khuẩn ty mơi trường Ly trích khuẩn ty cấy chuyền để tinh chủng; sử dụng môi trường nuôi cấy mơi trường PDA mơi trường PDA có Chloramphenicol 0,1% Đánh giá độ tinh dựa đồng khóm nấm đặc điểm hiển vi Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn, Candida) mẫu vi nấm phân lập - Nuôi cấy vi nấm số môi trường nghèo chất dinh dưỡng (Dự kiến sử dụng môi trường cao nấm men môi trường hỗn hợp nước ngâm bắp, cao nấm men) để kích thích vi nấm sản xuất có hợp chất có hoạt tính Điều kiện ni cấy dự kiến nhiệt độ phịng thời gian 14 ngày - Sử dụng dịch nuôi cấy để thử tính kháng vi sinh vật phương pháp đục lỗ (giếng) + Môi trường sử dụng để thử hoạt tính mơi trường Meller Hinton Agar (MHA) có độ dày mm + Vi sinh vật thử nghiệm gồm vi khuẩn (gồm Staphylococcus aureus, MRSA, E.coli, Pseudomonas aeruginosa ) vi nấm Candida (gồm C.albicans, C.tropicalis , C glabrata) Vi sinh vật thử nghiệm cần hoạt hóa trước thực thử nghiệm Đối với vi khuẩn, sau thời gian nuôi cấy môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) 24h, chuyển vi khuẩn sang môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) để tăng sinh 4h; sau tiến hành pha lỗng với nước muối sinh lý vô trùng để đạt nồng độ 1-5x10^8 tế bào vi khuẩn/ml Đối với Candida, sau thời gian nuôi cấy môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA) 48h, vi nấm pha lỗng với nước muối sinh lý vơ trùng đế đạt nồng độ 1-5x1066 tế bào nấm/ml + Trải hỗn dịch vi sinh vật pha loãng lên bề mặt thạch MHA, sử dụng dụng cụ để đục lỗ (giếng) có đường kính mm Nhỏ 70µl dịch nuôi cấy vi nấm vào giếng Đặt đĩa thử nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh 2h để dịch nuôi cấy vi nấm khuếch tán vào thạch Sau đó, ủ đĩa nhiệt độ 370C đọc kết dựa đường kính vịng vơ khuẩn sau 24h vi khuẩn 48h Candida Nội dung 3: Định danh sơ vi nấm có hoạt tính tốt - Định danh sơ vi nấm đến tên Chi dựa vào đặc điểm hình thái khóm nấm hiển vi theo số khóa phân loại vi nấm Dự kiến nuôi cấy vi nấm môi trường PDA, Potato Carrot Agar (PCA), Czapeck Dox Sử dụng kỹ thuật nhuộm vi nấm Lactophenol cotton blue (LPCB) để quan sát đặc điểm hiển vi 13 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng (Luận tiếp cận vấn đề nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng gắn với nội dung đề tài; so sánh với phương pháp giải tương tự khác phân tích để làm rõ tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo đề tài) Cách tiếp cận: Đa phần nghiên cứu vi nấm từ đất tập trung vào nguồn đất nông nghiệp, đất nhiễm mặn/phèn… Trong đó, điều kiện khí hậu nóng ẩm Tp.HCM điều kiện phù hợp có vi nấm phát triển, đồng thời nhiều nghiên cứu vi nấm đất thường tập trung vùng đất trồng lâu năm Do đó, nghiên cứu chọn mẫu đất trồng lớn/cổ thụ địa bàn Tp.HCM nhằm khai thác vi nấm nguồn đất chưa có nhiều nghiên cứu quan tâm, đồng thời giảm chi phí q trình thu thập mẫu Các phương pháp lựa chọn nghiên cứu gồm kỹ thuật phân lập vi nấm từ đất phương pháp pha loãng, phương pháp đục lỗ định danh vi nấm dựa hình thái phương pháp với chi phí thấp, dễ thực hiện, sử dụng sàng lọc với số lượng mẫu lớn Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Phân lập: Sử dụng phương pháp pha lõng mẫu đất đến nồng độ phù hợp nuôi cấy để thu khuẩn ty Ly trích khuẩn ty cấy chuyền nhằm tinh chủng Kiểm tra độ chủng dựa đồng hình thái khóm đặc điểm hiển vi Khảo sát tính kháng vi sinh vật: Sử dụng phương pháp đục lỗ (giếng) với vi sinh vật thử nghiệm dự kiến gồm vi khuẩn nấm Candida Dịch nuôi cấy vi nấm mẫu sử dụng để thử nghiệm Định danh vi nấm: Ghi nhận đặc điểm khóm hiển vi vi nấm, dựa vào số khóa phân loại vi nấm để xác định tên Chi Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo: Nội dung đề tài sử dụng phương pháp thường quy, rẻ tiền để dễ áp dụng sàng lọc cho số lượng lớn mẫu 14 Phương án phối hợp với tổ chức nước quốc tế (Trình bày phương án phối hợp: tên tổ chức phối hợp tham gia thực đề tài nội dung công việc tham gia đề tài, kể sở sản xuất người sử dụng kết nghiên cứu; khả đóng góp nhân lực, tài chính, sở hạ tầng-nếu có) 15 Tiến độ thực Các nội dung, công việc chủ yếu cần thực hiện; mốc đánh giá chủ yếu Thời gian Kết phải đạt (bắt đầu, kết thúc) Nội dung 1: Phân lập vi nấm - Công việc 1: Thu mẫu đất 15 – 20 mẫu đất 12/2019 - Công việc 2: Phân lập vi nấm 50 - 80 mẫu vi nấm 12/2019 – 02/2020 Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Nội dung 3: Định danh đến tên Chi 15 - 20 mẫu vi nấm 02/2020 – có hoạt tính 03/2020 15- 20 mẫu vi nấm 03/2020 – có hoạt tính 05/2020 định danh III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI 16 Sản phẩm KH&CN đề tài yêu cầu chất lượng cần đạt (Liệt kê theo dạng sản phẩm) Dạng I: Mẫu (model, maket); Sản phẩm (là hàng hố, tiêu thụ thị trường); Vật liệu; Thiết bị, máy móc; Dây chuyền cơng nghệ; Giống trồng; Giống vật nuôi loại khác; Dự kiến số Số TT Tên sản phẩm cụ thể tiêu chất lượng chủ yếu sản phẩm Đơn vị đo lượng/quy Mức chất lượng mô sản phẩm tạo Dạng II: Nguyên lý ứng dụng; Phương pháp; Tiêu chuẩn; Quy phạm; Phần mềm máy tính; Bản vẽ thiết kế; Quy trình cơng nghệ; Sơ đồ, đồ; Số liệu, Cơ sở liệu; Báo cáo phân tích; Tài liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mơ hình, ); Đề án, qui hoạch; Luận chứng kinh tế-kỹ thuật, Báo cáo nghiên cứu khả thi sản phẩm khác TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Bộ sưu tập vi nấm sợi từ đất 50 – 80 chủng vi nấm phân lập từ đất, có 15 – 20 chủng vi nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật Dạng III: Bài báo; Sách chuyên khảo; sản phẩm khác TT Tên sản phẩm Dự kiến nơi công bố Yêu cầu khoa học cần đạt (Tạp chí, Nhà xuất bản) Bài báo Tạp chí khoa học có số ISSN 16.3 Kết tham gia huấn luyện đào tạo sinh viên TT 17 Cấp đào tạo Số lượng Chuyên ngành đào tạo Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết đề tài Phục vụ công tác nghiên cứu khoa học Bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành 18 Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu 18.1 Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan (Nêu dự kiến đóng góp vào lĩnh vực khoa học cơng nghệ nước quốc tế) - Lưu giữ nguồn gen vi nấm; - Là sở mở rộng nghiên cứu vi nấm Bộ môn Khoa 18.2 Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu - Tiết kiệm chi phí tăng chủ động cơng tác nghiên cứu - Là sở mở rộng nghiên cứu vi nấm Bộ môn Khoa IV NHU CẦU KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ NGUỒN KINH PHÍ (Giải trình chi tiết phụ lục kèm theo) Đơn vị tính: Triệu đồng 19 Kinh phí thực đề tài phân theo khoản chi Trong Nguồn kinh phí Trả cơng Tổng số Thiết lao động Nguyên vật bị, (khoa học, liệu máy phổ thông) Tổng kinh phí 15.000.000 Chi khác móc 1.250.000 Trong đó: Quỹ NTTU 15.000.000 3.000.000 10.750.000 - Nguồn khác - - - - Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 11 năm 2019 KHOA/VIỆN/PHÒNG/TRUNG TÂM (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Họ tên chữ ký) Lê Quang Hạnh Thư HIỆU TRƯỞNG TRƯỞNG PHÒNG TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA HOC CƠNG NGHỆ (Họ tên chữ ký, đóng dấu) (Họ tên chữ ký) - ... “PHÂN LẬP VI NẤM CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT TỪ NGUỒN ĐẤT Ở CÔNG VI? ?N THUỘC TP HỒ CHÍ MINH? ?? Mục tiêu đề tài gồm: - Phân lập vi nấm từ đất vườn số vùng thuộc Tp.HCM - Định danh vi nấm phân lập. .. gồm 34 chủng từ công vi? ?n Tao Đàn, 38 chủng từ công vi? ?n Gia Định 31 chủng từ cơng vi? ?n Hồng Văn Thụ 1.2 Định danh vi nấm Bảng 3.1 Kết định danh vi nấm phân lập từ đất công vi? ?n Tp.HCM STT Chi... vật (kháng khuẩn, kháng Candida) chủng nấm phân lập từ đất công vi? ?n Tp.HCM Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Vi nấm sợi thu thập từ đất công vi? ?n Tp.HCM gồm: + Công vi? ?n