Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính của enzyme nattokinase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH - 2016.Y Người hướng dẫn: TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Vũ Thị Thơm Trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh – phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viên Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Cô giáo TS Vũ Thị Thơm – Trưởng môn Y dược học sở – Trường Đại học Y dược –ĐHQGHN người dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất, thiết bị suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hiền Trang toàn thể cán Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam bảo, giúp đỡ tận tình cho em suốt trình em thực đề tài Cuối cùng, em xin bày bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình thân u ln khích lệ ủng hộ em mặt vật chất lẫn tinh thần để em hồn thành luận văn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vật liệu polymer tự nhiên Bảng 2.4 Cố định enzyme Nattokinase (NK) Microcrystalline cellulose (MCC) 23 Bảng 3.4 Hàm lượng protein tổng số hoạt tính thủy phân casein mẫu enzyme tủa cồn muối ammonium sulfate 24 Bảng 3.7 Tóm tắt trình tinh enzyme Nattokinase từ chủng B subtilis27 Bảng 3.19 Hiệu suất gắn enzyme Nattokinase với chất mang 33 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Nattokinase Hình 1.2 Cơ chế tác dụng Nattokinase Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tìm vật liệu cố định enzyme NK 14 Hình 2.2 Đường chuẩn Tyrosine 21 Hình 2.3 Đường chuẩn Bradford 22 Hình 3.1 (A) Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme sau kết tủa (M: marker, 1: tủa ammonium sulfate nồng độ 30 %, 2: tủa ammonium sulfate nồng độ 70 %, 3: tủa cồn, 4: dịch enzyme trước tủa) (B) Hoạt tính thủy phân fibrinogen enzyme Nattokinase 25 Hình 3.2 Sắc kí đồ phân đoạn enzyme Nattokinase sau qua cột DEAE-Sepharose 26 Hình 3.3 Điện di Nattokinase sau qua cột DEAE 27 Hình 3.4 Điện di γ-PGA 28 Hình 3.5 Hình ảnh kính hiển vi Na-γ-PGA độ phóng đại 100X 28 Hình 3.6 γ-PGA dạng natri 29 Hình 3.7 Độ bền NK NK- Na-γ-PGA với pH khác sau 1h (A) 24h (B) 30 Hình 3.8 Độ bền NK NK-Na-γ-PGA với nhiệt độ khác Sau 1h ủ (A), Sau 24 h ủ (B) 32 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NK : Nattokinase γ-PGA : γ-Polyglutamic acid MCC : Microcrystalline cellulose t-PA : tissue plasminogen activator - yếu tố hoạt hóa plasminogen PAI-1 : plasminogen-1 LDL : low-density lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng thấp AD : bệnh Alzheimer TNF‐α : Tumour necrosis factor α IFN‐γ : Interferon- γ IL‐1β : Interleukin-1β MIP‐2 : Macrophage inflammatory protein-2 TCA : tricloacetic acid SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis DEAE : diethylaminoethyl MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN Tổng quan enzyme Nattokinase 1.1 Giới thiệu chung Nattokinase 1.2 Cơ chế tác dụng Bacillus subtilis natto 2.1 Giới thiệu Bacillus subtilis natto 2.2 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis natto 2.3 Ứng dụng Bacillus subtilis natto Vật liệu cố định enzyme Chất mang sử dụng nghiên cứu cố định Nattokinase 4.1 Poly glutamic acid (PGA) 4.2 Microcrystalline cellulose (MCC) 10 Một số nghiên cứu hướng đề tài 10 5.1 Nghiên cứu nước 10 5.2 Nghiên cứu giới 11 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 Vật liệu 13 1.1 Chủng 13 1.2 Hóa chất 13 Phương pháp nghiên cứu 13 2.1 Phương pháp nuôi cấy 15 2.2 Phương pháp tinh enzyme 16 2.3 Phương pháp cố định enzyme Nattokinase (NK) 22 2.4 Xử lý số liệu 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 Tinh enzyme Nattokinase Na-γ-PGA từ B subtilis 24 1.1 Tinh enzyme Nattokinase 24 1.2 Tinh Na-γ-PGA 28 Xác định khả làm bền enzyme Nattokinase Na-γ-PGA 29 2.1 Xác định khả làm bền enzyme Nattokinase Na-γ-PGA ảnh hưởng pH 29 2.2 Xác định khả làm bền enzyme Nattokinase Na-γ-PGA ảnh hưởng nhiệt độ 31 Đánh giá hiệu suất gắn NK với chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) 32 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối tượng xuất cục máu đông động mạch hay tĩnh mạch nằm bên thể Bình thường có tác dụng cầm máu trường hợp chảy máu tổn thương mạch máu Khi q trình đơng máu xảy khơng tổn thương gọi chứng huyết khối bệnh lý nguyên nhân dẫn đến bệnh như: tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ, nhồi máu tim…nguy hiểm dẫn đến tử vong [52] Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) năm 2016, tồn cầu có 17,9 triệu người tử vong bệnh tim mạch, nhiều gấp lần tổng số người tử vong bệnh lý HIV/AIDS, sốt rét lao phổi Nguyên nhân cục máu đơng biến chứng Có nhiều phương pháp điều trị huyết khối sử dụng thuốc phẫu thuật Tuy nhiên, thuốc tan huyết khối Alteplase, Streptokinase, Urokinase… có hiệu lực tức sau tiêm tĩnh mạch thời gian bán hủy ngắn, giá thành cao tác động điều trị triệu chứng, không điều trị nguyên bệnh Cả sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch phẫu thuật có nguy biến chứng cao Natto, loại thực phẩm làm từ đậu nành lên men với Bacillus subtilis tiêu thụ loại thực phẩm truyền thống nước châu Á 2000 năm Tiêu thụ natto cho yếu tố đóng góp đáng kể vào tuổi thọ dân số Nhật Bản Các nghiên cứu gần chứng minh ăn nhiều natto có liên quan đến việc giảm nguy tử vong tổng số bệnh tim mạch đặc biệt giảm nguy tử vong bệnh tim thiếu máu cục [47] Trước năm 1980, người biết việc tiêu thụ natto có lợi cho sức khỏe tim mạch tổng thể Năm 1987, Sumi cộng phát natto có chứa loại enzyme tiêu sợi huyết mạnh có tên Nattokinase (NK) [59] Kể từ đó, số lượng đáng kể nghiên cứu NK thực Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc Hoa Kỳ, nghiên cứu xác nhận NK có nhiều tác dụng thuận lợi sức khỏe tim mạch NK không liên quan đến kinase biết mà serine protease tinh chế chiết xuất từ natto [64] Ngồi ra, ưu điểm NK cịn bao gồm an toàn tiện lợi sử dụng đường uống, quy trình sản xuất đơn giản với chi phí thấp loại thuốc chống huyết khối hạ huyết áp khác Tại Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc nước phương Tây bao gồm Úc, Hoa Kỳ, Canada Châu Âu, sản phẩm NK sử dụng rộng rãi dạng viên nén viên nang chất bổ sung dinh dưỡng để tăng cường sức khỏe bao gồm làm loãng máu, ngăn ngừa cục máu đơng cải thiện tuần hồn [15] Tuy nhiên, chưa có liệu thuyết phục để chứng minh tính sinh khả dụng chuyển hóa NK qua đường uống Hiệu enzyme máu tiêu hóa địi hỏi nhiều nghiên cứu để cải thiện độ ổn định enzyme điều kiện nhiệt độ độ pH thay đổi cách tăng cường điều kiện cho bảo quản sản xuất NK [17, 39] Hiện nay, có nhiều phương pháp để ổn định tăng cường hoạt động enzyme sử dụng vật liệu để cố định enzyme biến đổi enzyme Trong đó, cố định enzyme phương pháp sử dụng nhiều Enzyme cố định có ưu điểm enzyme tự tái sử dụng nhiều lần thời gian dài, bền với nhiệt, pH dung môi hữu Xuất phát từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính enzyme Nattokinase” nhằm mục tiêu: Tinh enzyme Nattokinase (NK) lên men từ vi khuẩn B subtilis 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats", Biol Pharm Bull, 34(11), 1696-701 Gomez L., Ramírez H.L., Neira-Carrillo A., and Villalonga R (2006), "Polyelectrolyte complex formation mediated immobilization of chitosan-invertase neoglycoconjugate on pectin-coated chitin", Bioprocess and Biosystems Engineering, 28(6), 387-395 Gontijo de Melo P., Fornazier Borges M., Afonso Ferreira J., Vicente Barbosa Silva M., and Ruggiero R (2018), "Bio-Based Cellulose Acetate Films Reinforced with Lignin and Glycerol", Int J Mol Sci, 19(4) Guo Q., Su J., Yuan F., Mao L., and Gao Y (2019), "Preparation, characterization and stability of pea protein isolate and propylene glycol alginate soluble complexes", Lwt, 101, 476-482 Haritha M and Meena V (2011), "Nattokinase: A review of fibrinolytic enzyme", Chemical, environmental and pharmaceutical research, 2(1), 61-66 Hartmann M and Kostrov X (2013), "Immobilization of enzymes on porous silicas–benefits and challenges", Chemical Society Reviews, 42(15), 6277-6289 Hosseinkhani S., Szittner R., Nemat-Gorgani M., and Meighen E.A (2003), "Adsorptive immobilization of bacterial luciferases on alkylsubstituted Sepharose 4B", Enzyme and microbial technology, 32(1), 186-193 Hsieh C.-W., Lu W.-C., Hsieh W.-C., Huang Y.-P., Lai C.-H., and Ko W.-C (2009), "Improvement of the stability of nattokinase using γpolyglutamic acid as a coating material for microencapsulation", LWTFood Science and Technology, 42(1), 144-149 Itaya M., Nagasaku M., Shimada T., Ohtani N., Shiwa Y., Yoshikawa H., Kaneko S., Tomita M., and Sato M (2019), "Stable and efficient delivery of DNA to Bacillus subtilis (natto) using pLS20 conjugational transfer plasmids", FEMS Microbiol Lett, 366(4) Jang J.Y., Kim T.S., Cai J., Kim J., Kim Y., Shin K., Kim K.S., Park S.K., Lee S.P., Choi E.K., Rhee M.H., and Kim Y.B (2013), "Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation", Lab Anim Res, 29(4), 221-5 Jegannathan K.R., Jun-Yee L., Chan E.-S., and Ravindra P (2010), "Production of biodiesel from palm oil using liquid core lipase encapsulated in κ-carrageenan", Fuel, 89(9), 2272-2277 Ji H., Yu L., Liu K., Yu Z., Zhang Q., Zou F., and Liu B (2014), "Mechanisms of Nattokinase in protection of cerebral ischemia", Eur J Pharmacol, 745, 144-51 38 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 Katwa L., Ramakrishna M., and Rao M.R (1981), "Spectrophotometric assay of immobilized tannase", Journal of Biosciences, 3(2), 135-142 Kim J.Y., Gum S.N., Paik J.K., Lim H.H., Kim K.C., Ogasawara K., Inoue K., Park S., Jang Y., and Lee J.H (2008), "Effects of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial", Hypertens Res, 31(8), 1583-8 Kumari A and Kayastha A.M (2011), "Immobilization of soybean (Glycine max) α-amylase onto Chitosan and Amberlite MB-150 beads: Optimization and characterization", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 69(1-2), 8-14 Laemmli U.K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), 680-5 Law D and Zhang Z (2007), "Stabilization and target delivery of Nattokinase using compression coating", Drug Dev Ind Pharm, 33(5), 495-503 Lee E.-H., Tsujimoto T., Uyama H., Sung M.-H., Kim K., and Kuramitsu S (2010), "Enhancement of enzyme activity and stability by poly (γ-glutamic acid)", Polymer journal, 42(10), 818-822 Liu C.-H., Wu J.-Y., and Chang J.-S (2008), "Diffusion characteristics and controlled release of bacterial fertilizers from modified calcium alginate capsules", Bioresource technology, 99(6), 1904-1910 Lopez H.W., Coudray C., Levrat-Verny M.A., Feillet-Coudray C., Demigné C., and Rémésy C (2000), "Fructooligosaccharides enhance mineral apparent absorption and counteract the deleterious effects of phytic acid on mineral homeostasis in rats", J Nutr Biochem, 11(10), 500-8 Lu L., Xu S., Zhao R., Zhang D., Li Z., Li Y., and Xiao M (2012), "Synthesis of galactooligosaccharides by CBD fusion β-galactosidase immobilized on cellulose", Bioresour Technol, 116, 327-33 Maeda H., Mizutani O., Yamagata Y., Ichishima E., and Nakajima T (2001), "Alkaline-resistance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin", J Biochem, 129(5), 675-82 Mislovičová D., Masárová J., Vikartovská A., Gemeiner P., and Michalková E (2004), "Biospecific immobilization of mannan– penicillin G acylase neoglycoenzyme on Concanavalin A-bead cellulose", Journal of biotechnology, 110(1), 11-19 Murooka Y and Yamshita M (2008), "Traditional healthful fermented products of Japan", J Ind Microbiol Biotechnol, 35(8), 791-8 Nagata C., Wada K., Tamura T., Konishi K., Goto Y., Koda S., Kawachi T., Tsuji M., and Nakamura K (2017), "Dietary soy and natto intake and cardiovascular disease mortality in Japanese adults: the Takayama study", Am J Clin Nutr, 105(2), 426-431 39 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 Nakamura T., Yamagata Y., and Ichishima E (1992), "Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)", Biosci Biotechnol Biochem, 56(11), 1869-71 Ogawa Y., Hosoyama H., Hamano M., and Motai H (1991), "Purification and properties of gamma-glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto)", Agric Biol Chem, 55(12), 2971-7 Peng H., Wang J., Kang H., Dong S., Sun P., Bu D., and Zhou L (2012), "Effect of feeding Bacillus subtilis natto fermentation product on milk production and composition, blood metabolites and rumen fermentation in early lactation dairy cows", Journal of animal physiology and animal nutrition, 96(3), 506-512 Qiu D., Oshima H., Ohashi Y., and Itaya M (2003), "Construction of physical maps of Bacillus subtilis (natto) strains", Nucleic Acids Res Suppl, (3), 207-8 Raskob G.E., Angchaisuksiri P., Blanco A.N., Buller H., Gallus A., Hunt B.J., Hylek E.M., Kakkar A., Konstantinides S.V., McCumber M., Ozaki Y., Wendelboe A., and Weitz J.I (2014), "Thrombosis: a major contributor to global disease burden", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 34(11), 2363-71 Ren N.N., Chen H.J., Li Y., McGowan G.W., and Lin Y.G (2017), "[A clinical study on the effect of nattokinase on carotid artery atherosclerosis and hyperlipidaemia]", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 97(26), 2038-2042 Serban D.E (2014), "Gastrointestinal cancers: influence of gut microbiota, probiotics and prebiotics", Cancer Lett, 345(2), 258-70 Shen Q., Yang R., Hua X., Ye F., Zhang W., and Zhao W (2011), "Gelatin-templated biomimetic calcification for β-galactosidase immobilization", Process Biochemistry, 46(8), 1565-1571 Shih I.L and Van Y.T (2001), "The production of poly-(gammaglutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresour Technol, 79(3), 207-25 Sirisha V.L., Jain A., and Jain A (2016), "Enzyme Immobilization: An Overview on Methods, Support Material, and Applications of Immobilized Enzymes", Adv Food Nutr Res, 79, 179-211 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., and Hiratani H (1990), "Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase", Acta Haematol, 84(3), 139-43 Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., and Muraki H (1987), "A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet", Experientia, 43(10), 1110-1 40 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Sun P., Wang J.-Q., and Zhang H.-T (2011), "Effects of supplementation of Bacillus subtilis natto Na and N1 strains on rumen development in dairy calves", Animal Feed Science and Technology, 164(3-4), 154-160 Sun P., Wang J., and Zhang H (2010), "Effects of Bacillus subtilis natto on performance and immune function of preweaning calves", Journal of Dairy Science, 93(12), 5851-5855 Sun P., Wang J.Q., and Deng L.F (2013), "Effects of Bacillus subtilis natto on milk production, rumen fermentation and ruminal microbiome of dairy cows", Animal, 7(2), 216-22 Tümtürk H., Karaca N., Demirel G., and Şahin F (2007), "Preparation and application of poly (N, N-dimethylacrylamide-co-acrylamide) and poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)/κ-Carrageenan hydrogels for immobilization of lipase", International Journal of Biological Macromolecules, 40(3), 281-285 Urano T., Ihara H., Umemura K., Suzuki Y., Oike M., Akita S., Tsukamoto Y., Suzuki I., and Takada A (2001), "The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis Cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1", J Biol Chem, 276(27), 24690-6 Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G., and Feng Y (2009), "Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12", J Agric Food Chem, 57(20), 9722-9 Wang H., Liu H., Wang L., Zhao G., Tang H., Sun X., Ni W., Yang Q., Wang P., and Zheng Z (2019), "Improvement of menaquinone-7 production by Bacillus subtilis natto in a novel residue-free medium by increasing the redox potential", Appl Microbiol Biotechnol, 103(18), 7519-7535 Wang L.-L., Chen J.-T., Wang L.-F., Wu S., Zhang G.-z., Yu H.-Q., Ye X.-d., and Shi Q.-S (2017), "Conformations and molecular interactions of poly-γ-glutamic acid as a soluble microbial product in aqueous solutions", Scientific reports, 7(1), 1-11 Wingfield P (2001), "Protein precipitation using ammonium sulfate", Curr Protoc Protein Sci, Appendix 3, Appendix 3F Zheng Z.L., Zuo Z.Y., Liu Z.G., Tsai K.C., Liu A.F., and Zou G.L (2005), "Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase", J Mol Graph Model, 23(4), 373-80 Ogunleye A., Bhat A., Irorere V.U., Hill D., Williams C., and Radecka I (2015), "Poly-γ-glutamic acid: production, properties and applications", Microbiology, 161(1), 1-17 41 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Thành phần loại đệm dung dịch 43 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy 43 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 44 Bảng 3.1 Hàm lượng protein enzyme NK sau tủa 44 Bảng 3.2 Hoạt tính thủy phân casein enzyme NK sau tủa 45 Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi phương pháp tủa enzyme NK sau tủa 45 Bảng 3.5 Hàm lượng protein enzyme NK sau qua cột DEAE 46 Bảng 3.6 Hoạt tính enzyme NK sau qua cột DEAE 47 Bảng 3.8 Hiệu suất gắn Na-γ-PGA vào NK 47 Bảng 3.9 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ pH 47 Bảng 3.10 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ pH 48 Bảng 3.11 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 pH 48 Bảng 3.12 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 pH 49 Bảng 3.13 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ nhiệt độ 50 Bảng 3.14 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ nhiệt độ 50 Bảng 3.15 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 nhiệt độ 51 Bảng 3.16 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 nhiệt độ 51 Bảng 3.17 Hoạt tính thủy phân enzyme phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau thí nghiệm 52 Bảng 3.18 Hoạt tính tổng phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau thí nghiệm 52 42 Bảng 2.1 Thành phần loại đệm dung dịch Dung dịch Bradford stock solution Bradford working buffer Dung dịch A Dung dịch B Dung dịch C Dung dịch D Dung dịch nhuộm PAGE Dung dịch tẩy PAGE Đệm điện di protein (biến tính) Đệm tra mẫu protein 5X (biến tính) Thành phần, nổng độ 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml Bradford stock solution Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8 Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid 10% SDS (tinh thể); 25 mM EDTA 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,4 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% β-mercaptho-ethanol pha đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy Tên môi Thành phần trường LB lỏng 1% pepton (w/v); 1% NaCl (w/v); 0,5% cao nấm men (w/v) LB đặc LB lỏng; 1,5-2% agar (w/v) GSP 1% pepton (w/v); 1,5% glucose (w/v); 1,5% glutamic acid (w/v) 43 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Tên thiết bị Xuất xứ Box cấy vi sinh vật Laminar LB Sartorious (Đức) Cân phân tích BL150S Metrohm (Thụy Sĩ) Nồi khử trùng ES-315 Tony (Nhật) Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ) Tủ lạnh 4°C GR-N45VTV Toshiba (Nhật) Lị vi sóng Panasonic (Nhật) Tủ lạnh -84°C MDF-192 Sanyo (Nhật) Máy voltex OSI Rotolab (Đức) Máy ni lắc Centomat® HK Sartorious (Đức) Máy ly tâm lạnh to CF16RXII Hettich (Đức) Máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hettich (Đức) Bảng 3.1 Hàm lượng protein enzyme NK sau tủa Các bước kết tủa Enzyme thô 30 70 Cồn OD595nm TN1 0,726 0,685 0,687 0,675 TN2 0,713 0,776 0,657 0,606 Pha loãng 1 4 44 Hàm lượng protein (mg/ml) TN1 TN2 0,217 0,213 0,204 0,232 0,82 0,782 0,805 0,719 Sai số 0,003 0,019 0,0263 0,061 Bảng 3.2 Hoạt tính thủy phân casein enzyme NK sau tủa Các bước kết tủa Enzyme thô 30 70 Cồn OD750nm TN1 0,225 0,356 0,981 0,664 TN2 0,325 0,58 0,925 0,756 Pha loãng 1 5 Hoạt tính thủy phân casein (U/ml) TN1 TN2 0,245 0,363 0,4 0,664 5,687 5,357 3,817 4,36 Sai số 0,0834 0,187 0,234 0,384 Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi phương pháp tủa enzyme NK sau tủa Các bước kết tủa Enzyme thơ 30 70 Cồn Hoạt tính riêng (U/mg) Sai số Thể tích (ml) Hoạt tính tổng (U) Hiệu suất thu hồi (%) TN1 TN2 1,141 1,69 0,388 250 76,1 100 1,831 7,1 5,01 3,041 6,688 5,722 0,856 0,292 0,504 5 1,064 27,611 20,442 1,398 36,279 26,861 45 Bảng 3.5 Hàm lượng protein enzyme NK sau qua cột DEAE Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 OD595nm 0,006 0,007 0,013 0,012 0,019 0,028 0,025 0,029 0,013 0,006 0,016 0,008 0,008 0,009 0,007 0,013 0,027 0,072 0,103 0,116 0,046 0,042 0,03 0,012 0,01 0,004 0,02 0,009 0,001 Pha loãng 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 46 Hàm lượng protein (mg/ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,013971 0,023595 0,027631 0,005899 0,004657 0 0 0 Bảng 3.6 Hoạt tính enzyme NK sau qua cột DEAE Hoạt tính thủy phân casein (U/ml) OD750nm Các phân đoạn 19 20 21 22 23 TN1 TN2 0,155 0,142 0,239 0, 18 0,354 0,157 0,144 0,242 0,202 0,367 Pha loãng 1 1 TN1 TN2 0,163 0,147 0,262 0,192 0,398 0,165 0,15 0,265 0,218 0,413 Hoạt tính trung bình (U/ml) 0,164 0,1487 0,264 0,205 0,405 Sai số 0,002 0,002 0,002 0,018 0,011 Bảng 3.8 Hiệu suất gắn Na-γ-PGA vào NK HTR (U/mg) TN1 TN2 HTR TB (U/mg) Sai số HTTĐ (%) TN1 HTTĐ Sai số TB (%) TN2 NK 2,525 2,4889 2,507 0,026 100,73 99,264 NKNa-γPGA 1,65 1,696 0,065 65,808 69,485 67,647 1,742 100 1,0398 2,599 Bảng 3.9 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ pH HTR (U/mg) pH NK NKNa-γPGA ĐC ĐC TN1 TN2 2,099 2,794 2,731 2,398 3,071 2,779 2,145 2,825 2,748 2,353 2,783 2,776 HTR TB (U/mg) 2,122 2,809 2,739 2,375 2,927 2,778 47 Sai số 0,032 0,022 0,012 0,032 0,204 0,002 HTTĐ (%) TN1 TN2 HTTĐ Sai số TB (%) 76,631 101,963 99,683 86,321 110,556 100,063 78,277 103,103 100,317 84,697 100,187 99,937 77,454 102,533 100 85,509 105,371 100 1,164 0,806 0,448 1,148 7,332 0,0883 Bảng 3.10 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ pH HTR HTR HTTĐ (%) Sai (U/mg) pH TB số TN1 TN2 (U/mg) TN1 TN2 0 0 0 0 0 0 2,26 2,16 2,219 0,07 82,837 79,164 NK 2,59 2,72 2,664 0,09 98,947 103,85 10 0,95 0,90 0,931 0,03 36,491 34,385 ĐC 2,59 2,65 2,627 0,03 98,947 101,05 0 0 0 0 0 0 NK- 2,58 2,56 2,577 0,01 93,191 92,317 Naγ8 3,56 3,85 3,708 0,2 153,63 166,364 PGA 10 0,885 0,674 0,779 0,149 38,182 29,091 ĐC 2,254 2,381 2,318 0,089 97,273 102,727 HTTĐ Sai TB số (%) 0 0 81 2,59 101,4 3,47 35,438 1,48 100 1,48 0 0 92,754 0,61 160 8,999 33,636 6,428 100 3,856 Bảng 3.11 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 pH pH OD750nm TN1 0,622 NK 0,822 ĐC 0,804 NK- 0,708 Na8 0,902 γĐC 0,818 PGA TN2 0,635 0,831 0,809 0,695 0,819 0,817 1 1 Hoạt tính HTTB (U/ml) Sai số (U/ml) TN1 TN2 0,178 0,182 0,18 0,003 0,237 0,240 0,239 0,002 0,232 0,233 0,233 0,001 0,204 0,2 0,202 0,0027 0,261 0,236 0,249 0,017 0,236 0,236 Pha loãng 48 0,236 0,0002 Bảng 3.12 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 pH NK NKNaγPGA OD750nm TN1 TN2 Pha loãng 0 0 pH Hoạt tính (U/ml) TN1 TN2 HTTB (U/ml) 0 0 0 0 Sai số 0,671 0,642 0,193 0,184 0,189 0,006 0,158 0,165 0,041 0,044 0,043 0,001 10 0,069 0,066 0,015 0,014 0,015 0,0006 ĐC 0,158 0,161 0,041 0,042 0,042 0,0006 0 0 0 0 0 0 0,763 0,756 0,22 0,218 0,219 0,001 0,186 0,049 0,054 0,052 0,002 10 0,059 0,049 0,012 0,009 0,011 0,002 ĐC 0,124 0,031 0,033 0,032 0,001 0,2 0,13 49 Bảng 3.13 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ nhiệt độ Nhiệt độ (˚C) 28 37 NK 50 ĐC 28 NKNa-γPGA 37 50 ĐC OD750nm TN1 TN2 0,26 0,29 0,15 0,29 0,25 0,27 0,23 0,25 0,29 0,32 Pha lỗng Hoạt tính (U/ml) HTTB (U/ml) Sai số TN1 TN2 0,072 0,083 0,077 0,008 0,083 0,089 0,086 0,004 0,041 0,043 0,042 0,002 0,081 0,079 0,08 0,0008 0,072 0,061 0,066 0,007 0,27 0,077 0,075 0,076 0,001 0,25 0,063 0,071 0,067 0,006 0,23 0,071 0,063 0,067 0,006 0,16 0,28 0,22 Bảng 3.14 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ nhiệt độ Nhiệt độ (˚C) 28 37 NK 50 ĐC 28 NK37 Naγ50 PGA ĐC Hoạt tính HTTĐ (%) HTTB Sai HTTĐ riêng (U/mg) Sai số (U/mg) số (%) TN1 TN2 TN1 TN2 2,249 2,59 2,419 0,241 89,705 103,308 96,507 9,619 2,59 2,793 2,691 0,143 103,308 111,397 107,353 5,719 1,272 1,345 1,3 0,052 50,735 53,676 52,205 2,08 2,525 2,488 2,507 0,026 100,73 99,264 100 1,039 2,633 2,272 2,452 0,254 106,167 91,629 98,899 10,279 2,84 2,764 2,802 0,054 114,53 111,453 112,995 2,18 2,338 2,633 2,485 0,208 94,273 106,167 100,22 8,4105 2,633 2,272 2,452 0,254 106,167 91,63 98,898 10,279 50 Bảng 3.15 Hoạt tính NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 nhiệt độ Nhiệt độ (˚C) OD750nm TN1 TN2 Pha lỗng Hoạt tính (U/ml) 28 0,307 0,303 0,085546 0,084366 0,084956 0,000834 37 0,168 0,19 0,044543 0,051032 0,047788 0,004589 50 0 ĐC 0,319 0,32 0,089086 0,089381 0,089233 0,000209 28 0,268 0,243 0,074041 0,066667 0,070354 0,005215 37 0,191 0,18 0,051327 0,048083 0,049705 0,002294 50 0 ĐC 0,268 0,263 TN1 HTTB (U/ml) TN2 Sai số NK NKNaγPGA 0 0 0 0 0,074041 0,072566 0,073304 0,001043 Bảng 3.16 Hoạt tính tương đương NK NK-Na-γ-PGA ủ 24 nhiệt độ Nhiệt HTR (U/mg) HTR độ TB TN1 TN2 (˚C) (U/mg) Sai số HTTĐ (%) TN1 TN2 HTTĐ TB (%) Sai số 28 2,673 2,636 2,654 0,026 95,867 94,54 95,206 0,935 37 1,391 1,594 1,493 0,143 49,917 57,19 53,55 5,142 0 0 0 100 0,233 NK 50 NKNa-γPGA 0 ĐC 2,783 2,793 2,788 0,006 99,834 100,165 28 2,742 2,469 2,605 0,193 101,006 90,945 95,975 7,113 37 1,901 1,78 1,84 0,084 70,02 65,596 67,806 3,13 50 0 0 0 0 2,714 0,036 101 98,993 100 1,422 ĐC 2,742 2,687 51 Bảng 3.17 Hoạt tính thủy phân enzyme phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau thí nghiệm Các thí nghiệm OD750nm TN1 TN2 0,022 0,019 0,154 Pha lỗng Hoạt tính thủy phân casein (U/ml) Sai số TN1 TN2 0,006 0,002 0,002 0,138 0,162 0,143 0,013 0,071 0,201 0,064 0,217 0,108 0,127 0,195 0,13 0,21 0,057 0,02 0,026 0,003 0,0106 0,005 0,101 0,112 0,099 0,112 0,009 0,127 0,142 0,129 0,147 0,012 0,06 0,052 0,0507 0,041 0,006 Bảng 3.18 Hoạt tính tổng phức hợp Nattokinase (NK) – chất mang Microcrystalline cellulose (MCC) sau thí nghiệm Các thí nghiệm Hoạt tính trung bình (U/ml) 0,004 0,152 0,140 0,170 0,007 0,106 0,139 0,046 Thể tích 10 4,8 11 10 52 Hoạt tính tổng (U) 0,033 1,522 0,983 0,849 0,034 0,317 1,525 0,460 ... phương pháp để ổn định tăng cường hoạt động enzyme sử dụng vật liệu để cố định enzyme biến đổi enzyme Trong đó, cố định enzyme phương pháp sử dụng nhiều Enzyme cố định có ưu điểm enzyme tự tái... hữu Xuất phát từ lý trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu sàng lọc vật liệu cố định enzyme để ổn định hoạt tính enzyme Nattokinase? ?? nhằm mục tiêu: Tinh enzyme Nattokinase (NK) lên men từ vi khuẩn B subtilis... HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN TÙNG LÂM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYME ĐỂ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME NATTOKINASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: