Khảo sát tác dụng hạ enzym gan của các loại cao chiết dược liệu trên gan chuột bị gây độc tính mãn bằng CCL4

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ********* LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÁC DỤNG HẠ ENZYM GAN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TRÊN GAN CHUỘT BỊ GÂY ĐỘC TÍNH MÃN BẰNG CCl4 Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS HUỲNH NGỌC THỤY LÊ MỸ NGÂN Ths NGUYỄN NGỌC HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 TÓM TẮT LÊ MỸ NGÂN, Khoa Dược - Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 “ KHẢO SÁT TÁC DỤNG HẠ ENZYM GAN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TRÊN GAN CHUỘT BỊ GÂY ĐỘC TÍNH MÃN BẰNG CCL4 ” Giáo viên hướng dẫn: TS HUỲNH NGỌC THỤY ThS NGUYỄN NGỌC HỒNG Ở Việt Nam người bị mắc bệnh gan chiếm số lượng lớn, nên vấn đề tìm cách để chữa bệnh nhiều người quan tâm Để tiếp tục khảo sát tác dụng làm hạ enzym gan, bảo vệ gan gan bị nhiễm độc tính cấp nghể Râu mèo mà anh chị khoá trước thực Chúng tơi đặt vấn đề khảo sát dược tính hai loại dược thảo gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4 Những kết đạt được: ™ Chiết cao nước cao ethyl acetat từ Nghể Râu mèo theo phương pháp đun hồi lưu, loại dung môi áp suất giảm để thu cao chiết ™ Khảo sát tác dụng làm hạ enzym gan cao ethyl acetat, cao nước hai dược liệu này, quercitrin chất có Nghể Râu mèo dựa vào kết đo enzym gan ALT mơ hình gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4 Dựa vào mơ hình nghiên cứu Rana cộng sự, tồn chuột chia thành lô, lô con, cho uống độc uống mẫu thử lần tuần suốt tuần ™ Qua khảo sát cho kết tác dụng làm hạ enzym gan cao Nghể ethyl acetat tốt cao Râu mèo ethyl acetat so với chất chuẩn silymarin ™Qua mẫu thử nghiệm kết cho thấy hai loại cao: cao nước từ Nghể Râu mèo có độc tính gan ™ Kết thử nghiệm cho thấy chất quercitrin flavonoid có nhiều hai dược liệu có tác dụng làm hạ enzym gan Nhưng quercitrin chất định tác dụng làm hạ enzym gan hai loại dược thảo Kết luận: Qua kết thử nghiệm cho thấy cao chiết ethyl acetat từ Râu mèo Nghể có tác dụng làm hạ enzym gan, bảo vệ gan gan bị nhiễm độc tính mãn ii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Danh sách sơ đồ ix Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan thực vật học .2 2.1.1 Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus Blume.) .2 2.1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 2.1.1.2 Thành phần hóa học 2.1.1.3 Tác dụng dược lý 2.1.2 Cây Nghể ( Polygonum tomentosum Willd.) 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật .7 2.1.2.2 Thành phần hóa học 2.1.2.3 Tác dụng dược lý 2.2 Cấu trúc gan 10 2.2.1 Chức gan 10 2.2.2 Các loại enzym gan 11 2.2.3 Nguồn gốc enzym gan .12 2.2.4 Nguyên nhân gây tăng enzym gan 12 2.2.5 Cơ chế làm phát sinh bệnh gan gốc tự 14 2.3 Mơ hình gan in vitro in vivo 15 2.3.1 Mơ hình gan in vitro .15 2.3.2 Mơ hình gan in vivo 15 iii 2.4 Carbon tetrachlorid ( CCl4 ) 16 2.5 Tổng quan gốc tự 16 2.5.1 Khái niệm gốc tự 16 2.5.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự .16 2.5.3 Tác hại gốc tự .17 2.6 Chất chống oxi hóa 17 2.7 Giới thiệu chất Silymarin 17 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20 3.1.1.1 Nguyên liệu .20 3.1.1.2 Thú thử nghiệm 20 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 21 3.1.2.1 Dụng cụ .21 3.1.2.2 Thiết bị 21 3.1.2.3 Hóa chất 22 3.1.3 Nội dung thí nghiệm 22 3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Xử lý nguyên liệu 22 3.2.2 Quy trình chiết xuất dược liệu 23 3.2.2.1 Phương pháp chiết đun hồi lưu 23 3.2.2.2 Phương pháp điều chế cao nước (H) .23 3.2.2.3 Phương pháp điều chế cao ethyl acetat (EtOAc) 24 3.2.3 Phương pháp sàng lọc tác dụng hạ enzym gan mơ hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo) 25 3.2.3.1 Phương pháp gây độc tính mãn gan chuột CCl4 tuần .25 3.2.3.2 Bố trí thí nghiệm .25 3.2.3.3 Thiết kế thí nghiệm 26 3.2.3.4 Khảo sát sàng lọc tác dụng hạ enzym gan cao chiết, chất tinh khiết, chất chuẩn nồng độ 27 3.3 Phương pháp đánh giá kết thử nghiệm 28 iv 3.3.1 Phương pháp lấy máu chuột 28 3.3.1.1 Lấy máu tim 28 3.3.1.2 Lấy máu đuôi 28 3.3.2 Phương pháp đo ALT hãng Diagnosticum Zrt 29 3.3.2.1 Nguyên tắc 29 3.3.2.2 Cách tiến hành 29 3.3.2.3 Cách tính tốn 30 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Thử tinh khiết thực vật 31 4.1.1 Định dạnh mẫu .31 4.1.1.1 Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus Blume.) 31 4.1.1.2 Cây Nghể (Polygonum tomentosum Willd.) .31 4.1.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu cao chiết 32 4.1.2.1 Xác định độ ẩm mẫu Râu mèo cao chiết từ Râu mèo .32 4.1.2.2 Xác định độ ẩm Nghể cao chiết từ Nghể 33 4.2 Khảo sát nồng độ CCl4 31 4.3 Kết khảo sát sinh học .34 4.3.1 Kết sàng lọc tác dụng hạ enzym gan lô mẫu thử so với lô trắng, lô độc, lô chất chuẩn 34 4.3.2 Kết tác dụng làm hạ enzym gan cao chiết ethyl acetat so với chất chuẩn Silymarin .41 4.3.3 Kết khảo sát sàng lọc tác dụng hạ enzym gan lô chất tinh khiết quercitrin so với lô chất chuẩn silymarin 42 4.3.4 Kết khảo sát sàng lọc tác dụng hạ enzym gan hai lô mẫu ethyl acetat so với lô chất tinh khiết quercitrin 44 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận chung 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 PHỤ LỤC 51 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALAT ALT AST ATP BuOH CCl4 cDNA CHCl3 CYP EtOAc DMSO DĐVN DNA EDTA GSH GPT MDA MeOH NADP ROS SGPT SGOT SOD XDH XO Alanin aminotransferase Alanin transaminase Aspartat transaminase Adenosin 5’ - triphosphat n – Butanol Carbon tetrachlorid Acid Complementary Desoxyribonucleic Chloroform Cytochrome P450 Ethyl acetat Dimethylsulfoxid Dược điển Việt Nam Acid Desoxyribonucleic Ethylendinitrotetraacetat Glutathion Glutamic – pyruvic transaminase Malodialdehyd Methanol Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat Reactive oxy species Serum glutamic pyruvic transaminase Serum glutamic oxaloacetic transaminase Superoxid dismutase Xanthin dehydrogenase Xanthin oxidase vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các gốc hóa học chất Flavonoid Râu mèo Bảng 4.1: Kết xác định độ ẩm Râu mèo 32 Bảng 4.2: Kết xác định độ ẩm Râu mèo 32 Bảng 4.3: Hiệu suất thu cao Râu mèo nước .32 Bảng 4.4: Kết xác định độ ẩm Nghể cao Nghể nước 33 Bảng 4.5: Kết xác định độ ẩm Nghể cao Nghể ethyl acetat 33 Bảng 4.6: Hiệu suất thu cao Nghể nước cao Nghể ethyl acetat 33 Bảng 4.7 Kết gây độc CCl4 lô chuột thử nghiệm sau 24h 34 Bảng 4.8: Kết theo dõi trình thử nghiệm sàng lọc tác dụng hạ enzym gan 40 Bảng 4.9: Kết sàng lọc tác dụng hạ enzym gan lô mẫu thử so với 37 Bảng 4.10: Kết sàng lọc tác dụng hạ enzym gan hai lô mẫu .41 Bảng 4.11: Kết sàng lọc tác dụng hạ enzym gan lô chất tinh khiết quercitrin so với lô chất chuẩn silymarin 43 Bảng 4.12: Kết sàng lọc tác dụng làm hạ enzym gan cao Râu mèo ethyl acetat, cao Nghể ethyl acetat so với chất tinh khiết .44 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus Blume.) Hình 2.2: Cấu trúc flavonoid Hình 2.3: Năm chất orthosiphon tìm thấy Râu mèo Hình 2.4: Acid crosmarinic Hình 2.5: Acid cichonic Hình 2.6: Cây Nghể (Polygonum tomemtosum Willd.) Hình 2.7: Kaempferol Hình 2.8: Quercetin Hình 2.9: Cấu trúc gan 10 Hình 2.10: Cacbon tetraclorid 16 Hình 2.11: Hoa Cúc gai 18 Hình 2.12: Cấu trúc Silymarin 19 Hình 2.13: Các sản phẩm Silymarin 19 Hình 3.1: Bocal nuôi chuột 21 Hình 3.2: Nắp lưới, thức ăn 21 Hình 3.3: Ống uống nước 21 Hình 3.4 Dụng cụ nuôi chuột 21 Hình 3.5: Bắt chuột 27 Hình 3.6: Tư cho chuột uống thuốc 27 Hình 3.7: Cho chuột uống thuốc 27 Hình 3.8: Chuột bị trúng độc 27 Hình 3.9: Bắt chuột cắt đuôi 28 Hình 3.10: Vuốt chuột 28 Hình 3.11: Cắt chuột 28 Hình 3.12: Lấy máu 28 Hình 4.1: Mẫu Râu mèo trồng nơi thu hái 31 viii Hình 4.2: Mẫu Râu mèo vườn dược liệu 31 Hình 4.3: Mẫu Nghể trồng ven sông rạch 31 Hình 4.4: Biểu đồ kết sàng lọc tác dụng làm hạ enzym gan lô mẫu so với lô trắng, lô độc, lô chất chuẩn 38 Hình 4.5: Biểu đồ kết sàng lọc tác dụng làm hạ enzym gan Râu mèo ethyl acetat, Nghể ethyl acetat so với lô chất chuẩn silymarin 42 Hình 4.6: Biểu đồ kết sàng lọc tác dụng làm hạ enzym gan lô chất tinh khiết quercitrin so với lô chất chuẩn silymarin 43 Hình 4.7: Biểu đồ kết sàng lọc tác dụng làm hạ enzym gan lô Nghể ethyl acetat, Râu mèo ethyl acetat so với lô chất tinh khiết quercitrin 45 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế cao nước (H) 23 Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế cao ethyl acetat (EtOAc) 25 ix Chương 1: MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam Nghể Râu mèo phân bố rộng từ bắc đến nam, từ đồng đến miền núi Và đề tài nghiên cứu tác dụng điều trị bệnh hai loại dược thảo công bố nhiều như: tác dụng lợi tiểu, nhiệt, điều trị bệnh sỏi thận… Gần có hai đề tài [4], [8] nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá gan Nghể Râu mèo Hai đề tài thử nghiệm tác dụng làm hạ enzym gan bảo vệ gan của loại cao chiết từ Nghể Râu mèo mô hình in vivo gan chuột bị nhiễm độc CCl4 cấp tính Để tiếp tục nên chúng tơi đặt vấn đề “Khảo sát tác dụng hạ enzym gan loại cao chiết dược liệu gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4 ” nhằm đánh giá tác dụng dược lí hai dược liệu tác dụng làm hạ enzym gan gan bị nhiễm độc CCl4 mãn tính với nội dung thực sau: − Chuẩn bị dược liệu chiết xuất loại cao nghiên cứu − Khảo sát tác dụng làm hạ enzym gan loại cao chiết dược liệu chất tinh khiết quercitrin so với chất chuẩn silymarin mơ hình gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4 báu đói, mà cịn thành phần nhiều chất hóa học kích thích tố khác Sự điều chỉnh chất mỡ yếu tố quan trọng bảo vệ thể trước nhiều bệnh tật Chuyển hố chất đạm: Gan quan việc bào chế thoái biến chất đạm Mỗi ngày gan bào chế khoảng 12 g chất albumin, chất đạm quan trọng thể Ngoài nhiệm vụ trì áp suất thể tích, chất albumin chất có nhiệm vụ vận chuyển chất hóa học khác Khi gan bị chai, chất albumin giảm dần, dễ đưa đến phù thủng Ngoài ra, gan quan bào chế yếu tố đơng máu Khi gan bị viêm lâu năm, đông đặc máu trở nên khó khăn, người bệnh dễ bị chảy máu Hơn nữa, thiếu chất đạm, bệnh nhân viêm gan dễ bị nhiễm trùng vết thương khó lành Thanh lọc độc tố: Gan thận hai quan thể có khả loại bỏ độc tố Những độc tố dể tan nước loại qua thận Những độc tố tan mỡ, chế biến lại tế bào gan thành chất nguy hiểm hơn, dễ hòa tan nước Khi gan bị xơ, độc tố ứ lại thể Tổng hợp chất mật: Chất mật sau chế tạo tế bào gan, cô đọng dự trữ túi mật Sau bữa cơm, chất mật theo ống dẫn mật xuống tá tràng, trà trộn với thức ăn giúp thể nhũ hóa chất béo Khả sản xuất chất mật người bị xơ gan từ từ giảm dần gây trở ngại vấn đề hấp thụ chất mỡ chất béo Vì họ bị sụt ký trở nên thiếu dinh dưỡng thiếu vitamins tan mỡ vitamin A, D, E, K 2.2.2.Các loại enzym gan [28] Để xác định xem gan có bị tổn thương hay khơng người ta lấy máu xét nghiệm để tìm diện số loại enzym gan (men gan) có máu Bình thường, enzym nằm bên tế bào gan, gan bị tổn thương ngun nhân đó, chúng phóng thích vào máu Những loại enzym có gan: Aminotransferas loại enzym nhạy cảm gặp nhiều số enzym gan Aminotransferase bao gồm aspartat aminotransferase 11 (AST SGOT) alanin aminotransferase (ALT SGPT) Những enzym bình thường nằm tế bào gan Khi gan bị tổn thương, tế bào gan phóng thích enzym vào máu làm tăng nồng độ enzym máu báo động cho biết gan bị tổn thương Ngoài AST ALT, cịn có enzym gan khác gồm alkalin phosphatase, - nucleotidase (5 - prime nucleotidase), lactat dehydrogenase (LDH), gamma - glutamyl transpeptidase (GGT) thường khảo sát bệnh gan 2.2.3 Nguồn gốc enzym gan [28] − Alkalin phosphatase loại enzym gan thường tìm thấy thành ống mật gan gan (những cấu trúc dạng ống gan để nối tế bào gan với nhau) Tăng alkalin phosphatase tổn thương tế bào mật Nguyên nhân thường gặp: bệnh sỏi mật − AST hay SGOT enzym bào tương ty thể, diện tế bào gan, tim, vân, thận, não tụy AST men xúc tác phản ứng aspartat alpha ketoglutarat tạo thành oxaloacetat glutamat Enzym tiết vào máu mô bị tổn thương Nồng độ enzym máu tăng bệnh nhân bị nhồi máu tim rối loạn Do đó, khơng phải loại men có tính đặc hiệu cao cho tổn thương gan Giới hạn bình thường AST, SGOT từ - 40 đơn vị lít huyết tương − ALT, SGPT hay ALAT men bào tương, diện chủ yếu tế bào gan, số tế bào vân, tim Vì tăng ALT đặc hiệu cho tổn thương tế bào gan so với AST ALT enzym xúc tác phản ứng transamination (enzyme xúc tác cho phản ứng transaminase) chuyển nhóm amino từ Alanin sang alpha - ketoglutarat tạo thành sản phẩm glutamat pyruvat Alanin acid amine giữ vai trò quan trọng chu trình glucose lượng tạo phản ứng chu trình dành cho co Giới hạn bình thường ALT (SGPT) từ - 56 đơn vị lít huyết tương − Gamma Glutamyl Transpeptidase (GGT) enzym tế bào thành ống mật 2.2.4 Nguyên nhân gây tăng enzym gan [25, 28] Có nhiều nguyên nhân gây tăng enzym gan thường gặp là: 12 Viêm gan virus A, B, C, D Trong trường hợp viêm gan cấp tính hai loại enzym gan ALT, AST tăng cao lần so với số bình thường Cịn trường hợp viêm gan mãn tính AST, ALT tăng nhẹ, khoảng lần so với số bình thường gia tăng kéo dài tháng Viêm gan thuốc: thường bệnh nhân có tiền sử sử dụng loại thuốc paracetamol, rifamicin, tetracyclin, sulfonamid, isoniazid, aminodaron (Cordaron), hydralazine (Apresolin), phenytoin (Dilantin) kèm biểu khác ngứa, sốt… Enzym gan tăng lên đến 3000 U/L viêm gan thuốc Viêm gan rượu: tế bào gan thối hóa hoại tử, gan thường có tế bào căng phồng, có xâm nhiễm bạch cầu đa nhân tế bào lympho Bệnh nhân có triệu chứng thường giống người viêm gan virus như: chán ăn, buồn nơn, khó chịu, sụt cân, đau hạ sườn phải vàng da Viêm gan rượu AST thường cao gấp - 10 lần giới hạn bình thường ALT mức bình thường tăng nhẹ Nồng độ ALT tương đối thấp hậu từ thiếu pyrydoxal 5-phosphat người nghiện rượu, yếu tố cần thiết cho tổng hợp ALT Viêm gan bị nhiễm độc: chì, photpho, thuốc mê, carbon tetraclorua…nặng gây hoại tử nhu mô gan, nhẹ gan cịn hồi phục trở Ví dụ: chế gây độc CCl4 gan CCl4 có khả gây độc gan chuyển hoá CCl4 gan hình thành gốc tự CCl3+ qua hệ thống chuyển hoá NADPH - CYP Một điện tử từ NADPH chuyễn sang CCl4 để hình thành CCl3+ Sau gốc tự tương tác với với phân tử khác Các gốc tự q trình chuyển hố CCl4 thể gây hại cho tế bào chúng khởi phát peroxid hoá lipid, liên kết hoá trị với protein, làm tăng Ca 2+ nội bào, giảm GSH tăng giải phóng sắt, cuối gây chết tế bào Sự chuyển hoá CCl4 enzym CYP ti thể biết từ lâu Khi ủ ti thể với CCl4 thấy liên kết hố trị CCl4 với DNA ti thể cao liên kết hoá trị CCl4 với DNA nhân Ngoài ra, chuyển hố CCl4 hình thành liên kết hố trị với protein, lipid, DNA nhân, làm cho DNA tế bào bị biến đổi Nhưng kết giải thích cho ảnh hưởng gây ung thư CCl4 Sự peroxid hố lipid CCl4 cảm ứng tiến triển bệnh gan nhiễm mỡ xơ gan 13 Malodialdehyd (MDA) chất thị trình peroxid hóa lipid Hàm lượng MDA tăng gấp lần xử lí gan với CCl4 14 Do đó, CCl4 chất gây độc điển hình để tạo mơ gan bị độc mơ hình gan in vivo, in vitro [5] Viêm gan tự miễn: tình trạng tổn thương gan kháng thể thể sản xuất hệ miễn dịch công gan Trong trường hợp enzym gan tăng mức độ nhẹ trung bình Ứ sắt (hay gọi bệnh đái tháo đồng đen) bệnh di truyền hấp thu lượng sắt mức cho phép thể dẫn đến tích tụ sắt gan làm cho gan bị viêm Bệnh Wilson: bệnh di truyền tích tụ chất đồng q mức nhiều loại mơ có gan, não Đồng diện nhiều gan dẫn đến viêm gan mãn tính, đồng có não vượt mức cho phép thể dẫn đến rối loạn vận động, tâm thần Thiếu alpha – antitrypsin: rối loạn di truyền thiếu loại glycoprotein có tên alpha-1-antitrypsin dẫn đến bệnh phổi mãn tính bệnh gan 2.2.5.Cơ chế làm phát sinh bệnh gan gốc tự [17] Các gốc tự có tác dụng lớn q trình phát sinh bệnh gan, chúng sinh trình chuyển hóa chất tế bào gan Trong tế bào có chế để kiểm sốt nồng độ gốc tự dư thừa gây hại cho tế bào enzym SOD, catalase, GSH peroxidase, GSH reductase Tuy nhiên nồng độ gốc tự cao điều khiển hàng loạt phản ứng thể như: làm yếu GSH liên kết đại phân tử tế bào (protein, lipid, acid nucleic) dẫn đến hoạt động bất thường protein, peroxid hóa, lipid, hay phá hủy DNA Những phản ứng ảnh hưởng trực tiếp đến tiểu quan như: ti thể, mạng lưới nội chất, vi ống, nhân tế bào Ngoài chúng phá vỡ thang gradient ion, dự trữ canxi nội bào dẫn đến hoạt động bất thường ti thể làm khả tạo lượng cho hoạt động tế bào 14 2.3 Mô hình gan in vitro in vivo 2.3.1 Mơ hình gan in vitro [6, 13, 14] Trong thập kỷ gần mơ hình in vitro tăng lên cách nhanh chóng khơng phát triển phương pháp ni cấy tế bào phịng thí nghiệm Vì ưu điểm mà phương pháp mang lại − Thời gian làm thí nghiệm dù khảo sát độc cấp tính hay mãn tính ngắn so với in vivo − Lượng chất độc hay lượng mẫu thử nghiệm sử dụng Cùng lúc sàng lọc số lượng lớn chất, nồng độ tác dụng − Về mặt đạo đức sinh học đem người thử nghiệm cách gây độc lại cho dùng thuốc để chữa trị chưa biết nồng độ thời gian sử dụng thuốc Mô hình in vitro giảm bớt số lượng động vật cần sử dụng cho q trình nghiên cứu Mơ hình in vitro khắc phục hạn chế sử dụng lượng mẫu lớn lặp lại nhiều lần Hiện mơ hình ngày phát triển Mơ hình gan in vitro có nhiều loại khác như: phân lập buồng gan, mơ hình cắt lớp mỏng mơ gan, tế bào đơn, Tùy vào mục đích điều kiện thí nghiệm để chọn mơ hình cho thích hợp 2.3.2 Mơ hình gan in vivo [6] Gan đóng vai trị quan trọng thể, ví nhà máy hóa học thể, vừa hấp thụ amino acid, lipid, carbonhydrat, vitamin, vừa dự trữ, chuyển hóa chất cuối phóng thích máu dịch mật Do đó, gan đóng vai trị việc chuyển hóa chất ngoại sinh mà có hàng ngàn chất gây độc cho gan [5, 14] Mơ hình in vivo có đặc điểm kiểm tra tính tổng thể thể Một chất đưa vào thể không tác dụng đến quan riêng biệt mà ảnh hưởng đến phận xung quanh Đều giải thích có nhiều trường hợp loại thuốc thích hợp với người lại không hiệu với người khác [5, 14] 15 2.4 Carbon tetrachlorid ( CCl4 ) [1, 10] CCl4 chất độc cho gan biết từ lâu Chất gây bệnh sơ gan cấp tính mãn tính, bệnh ung thư gan, cảm ứng gây đoạn nhiễm sắc thể CCl4 dùng phổ biến làm chất thử nghiệm để gây tổn thương gan mơ hình động vật Hình 2.10: Carbon tetraclorid 2.5 Tổng quan gốc tự 2.5.1 Khái niệm gốc tự [3] − Trong hóa học, gốc tự nguyên tử, nhóm ngun tử, phân tử có electron khơng ghép cặp lớp ngồi Các electron có lượng cao, bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học phản ứng oxy hóa - khử, phản ứng polymer hóa − Các gốc tự hình thành có đứt nối đồng thời, mối liên kết cộng hóa trị, trình cần lượng Quá trình phản ứng oxy hóa khử điện tử tạo thành gốc tự Ví dụ: phản ứng Fenton tạo gốc tự HO • từ H2O2 xúc tác Fe 2+ ví dụ điển hình phản ứng oxy hóa khử điện tử Fe 3+ + HO• + HO – Fe 2+ + H2O2 2.5.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự [7, 19 ] Gốc tự phát sinh từ hai nguồn : nguồn nội sinh, ngoại sinh − Nguồn nội sinh gốc tự thể tạo q trình sinh lý hơ hấp tế bào, trình bệnh lý viêm nhiễm, thơng qua hệ thống enzym thân oxy hóa, ion kim loại chuyển tiếp Ví dụ hệ thống enzym oxy hố thể có khả tạo gốc tự như: xathin oxidase, NADPH oxidase, nitric oxide synthase, myeloperoxidase, Gốc O 2-• NO• hai gốc sinh xúc tác enzym oxi hóa − Ngồi yếu tố nội sinh, gốc tự cịn hình thành thể yếu tố ngoại sinh ô nhiễm môi trường, xạ, khói thuốc, ozon, [17] 16 2.5.3 Tác hại gốc tự Sự stress oxi hóa: Là kết hình thành gốc tự vượt mức kiểm soát hệ thống kháng oxi hóa thể Điều xảy chất chống oxi hóa có nồng độ thấp, không đủ để hấp thu hết gốc tự trước bùng nổ Các gốc tự lúc công phân tử lipid, protein, DNA Nếu stress oxi hóa mãnh liệt gây chết tế bào Q trình lão hóa: Là q trình biến đổi theo thời gian liên quan đến thối hóa chức sinh học Sự rối loạn đột biến xảy chủ yếu gen nguyên nhân dẫn đến lão hóa Sự rối loạn gốc tự superoxid hydroxyl phản ứng với phân tử di truyền Gốc tự phản ứng với collagen, protein mơ liên kết, làm lão hóa phận Các vết nhăn xuất da collagen bị hư hại dấu hiệu cho lão hóa Q trình peroxyt lipid: Các tế bào bao bọc màng lipid kép Trong cấu trúc lipid có nhiều gốc không no nên dễ bị gốc tự phản ứng, trình gọi trình peroxyt hóa lipid 2.6 Chất chống oxi hóa [19] Chất chống oxy hóa chất có khả tác động lên phản ứng dây chuyền gốc tự do, tạo nên gốc tự bền hoạt động Chúng nhận điện tử tự gốc tự hoạt động biến gốc tự hoạt động thành gốc tự hoạt động Các chất có tác dụng ngăn cản tạo thành gốc tự hoạt động kết thúc dây chuyền (ngăn chặn gốc tự do) Các chất chống oxi hố bao gồm có: enzym chống oxy hóa (superoxid dimutase, catalas, glutathion peroxidase …), vitamin chống oxi hóa (C, E) đặc biệt chất chống oxy hóa có nguồn gồc tự nhiên (carotenoid, phenol, polyphenol) Chất chống oxi hóa chất có ảnh hưởng lên phản ứng dây chuyền gốc tự gốc tự bền hoạt động [21] 2.7 Giới thiệu chất Silymarin − Silymarin hỗn hợp flavonoid chiết từ Cúc gai (Sylibum marianum) sử dụng để điều trị chứng bệnh vàng da rối loạn đường mật Silymarin có tác dụng ổn định màng tế bào, ngăn cản trình 17 xâm nhập chất độc vào bên màng tế bào nên chất độc khơng hủy hoại tế bào Do làm bền vững màng tế bào, trì cấu trúc chức tế bào − Silymarin có tác dụng ức chế biến đổi gan thành tổ chức xơ, giảm hình thành lắng đọng sợi collagen dẫn đến xơ gan Ngoài ra, Silymarin bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức gan kích thích phát triển tế bào gan để thay tế bào gan cũ bị tổn thương, kích thích phục hồi tế bào gan bị hủy hoại có tác dụng chống peroxyd hóa lipid, chống viêm từ cải thiện triệu chứng bệnh gan, làm giảm nồng độ enzym gan máu − Silymarin sản phẩm kiểm tra, chức thực tác dụng phục hồi gan Silymarin bào chế thành thuốc bán thị trường sử dụng rộng rãi Silymarin thường sử dụng chất chuẩn số thí nghiệm để đối chiếu, so sánh tác dụng phục hồi gan bảo vệ gan so với cao chiết, phân đoạn chiết mẫu thử - Một số sản phẩm silymarin sử dụng phổ biến như: M silymarin (được chiết xuất từ Kế (milk thistle) điều trị viêm gan cấp mạn tính, suy gan, gan nhiễm mỡ, bảo vệ phục hồi chức gan người uống rượu bia, ngộ độc thực phẩm…), sản phẩm Super thisilyn (silymarin sản phẩm chiết xuất từ Cúc gai) , sản phẩm Milk thistle (silymarin cũa sản phẩm chiết xuất từ Kế) [ 16 ] Hình 2.11: Cây Cúc gai 18 Hình 2.12 Cấu trúc Silymarin Hình 2.13: Các sản phẩm Silymarin 19 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài: “ Khảo sát tác dụng làm hạ enzym gan cao chiết từ dược liệu gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4” Địa điểm: Bộ mơn Dược liệu - Khoa Dược - Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Thời gian: từ tháng 9/2009 đến tháng 1/2010 3.1.Nguyên vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 3.1.1.1 Nguyên liệu − Nghể tươi thu hái Tây ninh loại bỏ tạp chất, đem phơi, sấy khô 50 – 60 0C để hạn chế hợp chất tự nhiên dược liệu bị phân hủy phần Bộ phận dùng thân − Râu mèo thu hái Thủ đức − Tất dược liệu sau đạt độ ẩm yêu cầu, đem xay nhỏ làm nguyên liệu cho trình chiết thu cao Dược liệu sau xay khô kiểm tra độ ẩm máy đo độ ẩm − Sơ đồ xử lí ngun liệu thơ: Ngun liệu nhỏ làm phơi khô sấy (55 – 60 0C) xay mẫu nguyên liệu − Silymarin tinh khiết cung cấp từ phòng thí nghiệm khoa Hố trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh Silymarin sử dụng chất chuẩn để đối chiếu, so sánh với mẫu thí nghiệm 3.1.1.2.Thú thử nghiệm − Chuột nhắt trắng đực (Mus musculus var Albino), khỏe mạnh, không bị bệnh, nhanh nhẹn, lông mượt, đuôi nhọn rõ tĩnh mạch, mắt hồng, trọng lượng khoảng 23 – 25 g Được cung cấp Viện Pasteur Nha trang, ni phịng ni chuột phịng thí nghiệm Bộ môn Dược Lý, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh − Chuột mua ni bocal có lót trấu ổn định ngày Mỗi bocal ni 10 con, có nắp lưới đậy Chuột cho uống nước ống 20 xilanh sẽ, dùng cám viên dành riêng cho chuột mua từ Viện Pasteur Nha Trang làm thức ăn, ăn thêm giá Chuột nuôi môi trường thông thoáng, mát mẻ, Ba ngày thay trấu lần Hình 3.1: Bocal ni chuột Hình 3.2: Nắp lưới, thức ăn Hình 3.3: Ống uống nước Hình 3.4: Dụng cụ ni chuột 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 3.1.2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm - Ống xi lanh 1ml, 5ml, 10ml - Erlen 100 ml, 250ml - Eppendorf - Ống đong 100ml - Bocal nắp lưới để nuôi chuột - Bercher 50ml, 100ml, 250ml − - Đĩa Petri - Kim tiêm cho chuột uống thuốc - Pippette man đầu típ - Bình định mức 100 ml, 1000 ml - Pippette 1ml, 2ml, 5ml, 10ml - Bình cầu - Giấy lọc - Bình lắng gạn 3.1.2.2.Thiết bị 21 Ống ly tâm - Máy li tâm Hettich – Mikro 200 - Ống xi lanh 1ml, 5ml, 10ml - Máy đo quang phổ UV – Vis - Eppendorf Shimadzu - Cân kỹ thuật Sartorius - Máy cô quay chân không Buchi R2105 - Bể điều nhiệt Memmert - Tủ sấy Memmert ULN – 400 - Máy xác định độ ẩm Sartorius MA 45 3.1.2.3.Hóa chất - Dầu oliu - Ethyl acetat (EtOAc) - Dimethylsulfoxid (DMSO) - EDTA 0,1 % (Bộ mơn Sinh hố) - Carbon tetrachloride ( CCl4 ) - Nước cất - Cồn 96o - ALT (hãng Diagnosticum Zrt) - Chloroform ( CHCl3 ) 3.1.3 Nội dung thí nghiệm − Chiết xuất loại cao chiết − Khảo sát sàng lọc in vivo tác dụng hạ enzym gan cao chiết ethyl acetat cao chiết nước Râu mèo Nghể chuột nhắt trắng bị nhiễm độc tính mãn CCl4 − So sánh tác dụng hạ enzym gan loại cao chiết (cao ethyl acetat, cao nước) hai loại dược liệu với − So sánh tác dụng hạ enzym gan chất tinh khiết quercitrin với cao chiết 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Xử lý nguyên liệu 22 - Định danh ngun liệu: Mơ tả hình thái thực vật nơi mọc, đối chiếu với hình ảnh tài liệu thực vật học, so sánh với mẫu vườn dược liệu thuộc khoa Dược trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh - Độ ẩm: theo phụ lục 5.16 DĐVN III 3.2.2 Quy trình chiết xuất dược liệu Tải FULL (66 trang): https://bit.ly/2TJefis Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net 3.2.2.1 Phương pháp chiết đun hồi lưu * Nguyên tắc chiết xuất:Trong trình chiết xuất thơng thường tiểu phần chất rắn chịu tác dụng dung môi điều kiện Các chất tan tan hoàn toàn dung môi tạo thành dung dịch tạo nên dịch chiết, hịa tan bị ảnh hưởng chất không tan Do chất tan nằm tế bào, ngăn cách bên vách cellulose nên chất tan hòa tan dung mơi cịn phải vượt qua lớp vách tế bào dịch chiết Quá trình chiết chất tan từ tổ chức sinh học thường gọi chiết xuất * Phương pháp chiết xuất đun hồi lưu Tóm tắt phương pháp: Cân mẫu cho vào bình tam giác Ngâm dung mơi tiến hành đun hồn lưu vịng 30 phút, thực lần Sau lọc qua phễu thủy tinh dịch lọc thu loại dung môi áp suất giảm đến thu cao rắn 3.2.2.2 Phương pháp điều chế cao nước (H) (xem sơ đồ 3.1) − Cân 50g dược liệu cho vào erlen nút mài 250 ml, làm ẩm Đun hồi lưu 30 phút kể từ lúc sôi, thực đến thử giọt dung dịch chiết mặt kính đồng hồ khơng cịn để lại cắn kết thúc Sau lọc qua phễu thủy tinh, gộp dịch lọc nước (H) Loại dung môi áp suất giảm đến thu cao (H) 23 Dược liệu 100 ml H / 30 phút – lọc Bã dược liệu Dịch lọc H Loại dung môi Cao H Sơ đồ 3.1: Phương pháp điều chế cao nước (H) 3.2.2.3 Phương pháp điều chế cao ethyl acetat (EtOAc) − Cân 100 g dược liệu xay thành bột thô, làm ẩm cồn 96% 30 phút Cho dược liệu chiết cách đun hồi lưu 30 phút Đem dịch chiết với cồn loại dung môi áp suất giảm, thu cao cồn tồn phần − Hịa cao cồn tồn phần MeOH - H2O (1 : 4), thu dịch MeOH - H2O Lắc với dung môi CHCl3 đến thử giọt dung dịch chiết khơng cịn cắn bề mặt kính đồng hồ ngưng Dịch chiết loại dung môi áp suất giảm, thu cao CHCl3 − Dịch chiết MeOH – H2O sau lắc với dung môi CHCl3 tiếp tục lắc với dung môi ethyl acetat, thử giọt dung dịch chiết khơng cịn để lại cắn bề mặt kính đồng hồ Dịch chiết loại dung mơi áp suất giảm, thu cao EtOAc (xem sơ đồ 3.2) Xác định phần trăm cao thu Tải FULL (66 trang): https://bit.ly/2TJefis Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Phần trăm cao thu m cao % Cao thu = m dl – (m dl x w dl) m cao: khối lượng cao thu (g) m dl: khối lượng dược liệu đem chiết (g) 24 x 100% w dl: độ ẩm dược liệu đem chiết (%) Mẫu thử Chiết với cồn 96% Loại dung mơi Cao cồn tồn phần MeOH - H2O ( : ) Dịch MeOH - H2O Dung mơi CHCl3 Trích ly lỏng – lỏng Dịch CHCl3 Dịch chiết MeOH – H2O sau lắc CHCl3 Loại dung môi Lắc với Ethyl acetat Cao CHCl3 Loại dung môi Cao EtOAc Dịch chiết MeOH – H2O sau lắc EtOAc Sơ đồ 3.2: Phương pháp điều chế cao ethyl acetat (EtOAc) 3.2.3.Phương pháp sàng lọc tác dụng hạ enzym gan mơ hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo) 3.2.3.1 Phương pháp gây độc tính mãn gan chuột CCl4 tuần (theo Rana cộng sự, 1992) Dùng chuột nhắt trắng trưởng thành nặng 20 - 24 g khỏe mạnh, giống đực Gây độc gan chuột cách dùng CCl4, hai lần tuần với liều 0.2 ml, liền tuần Chuột cho ăn không hạn chế tuần thức ăn tổng hợp uống nước bình thường 3.2.3.2 Bố trí thí nghiệm Chuột chia làm lơ Mỗi lô tối thiểu 3484733 25 ... cao chiết dược liệu gan chuột bị gây độc tính mãn CCl4 ” nhằm đánh giá tác dụng dược lí hai dược liệu tác dụng làm hạ enzym gan gan bị nhiễm độc CCl4 mãn tính với nội dung thực sau: − Chuẩn bị dược. .. LÊ MỸ NGÂN, Khoa Dược - Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 “ KHẢO SÁT TÁC DỤNG HẠ ENZYM GAN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TRÊN GAN CHUỘT BỊ GÂY ĐỘC TÍNH MÃN BẰNG CCL4 ” Giáo viên... nghiệm tác dụng làm hạ enzym gan bảo vệ gan của loại cao chiết từ Nghể Râu mèo mơ hình in vivo gan chuột bị nhiễm độc CCl4 cấp tính Để tiếp tục nên đặt vấn đề ? ?Khảo sát tác dụng hạ enzym gan loại cao