Khảo sát tác dụng kháng u da của cao toàn phần ethanol từ lá tía tô perilla frutescens lamiaceae trên chuột nhắt trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VƯU THANH TÚ QUYÊN KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TỒN PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VƯU THANH TÚ QUYÊN KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 60720402 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017 Luận văn Thạc sỹ - Niên khóa: 2015 – 2017 Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TỒN PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Vưu Thanh Tú Quyên Người hướng dẫn: PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh Mục tiêu Khảo sát tác dụng dự phòng điều trị u da cao tồn phần ethanol từ Tía tơ mơ hình gây u da hai giai đoạn hóa chất Đồng thời tiến hành kiểm nghiệm dược liệu Tía tô phương pháp vi học xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao tồn phần Tía tơ Phương pháp nghiên cứu Tồn thân Tía tơ quan sát, phân tích đặc điểm tiến hành vi phẫu phận thân, cuống Cao toàn phần Tía tơ chiết xuất từ bột với ethanol 50% Flavonoid có cao Tía tơ định tính SKLM định lượng HPLC pha đảo, đầu dị PDA bước sóng 300 nm Khảo sát tác dụng dự phịng điều trị cao Tía tơ 10% mơ hình chuột gây u 7,12dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) croton oi với DMBA bôi lần nhất, croton oil bơi cách tuần với tần suất lần/tuần thời gian 20 tuần Kết Kết định tính SKLM cho thấy cao tồn phần Tía tơ có chứa acid rosmarinic luteolin Bằng phương pháp định lượng HPLC với đầu dò PDA, tính hàm lượng acid rosmarinic luteolin 1.178 ± 0.011 % (w/w) 0.105 ± 0.001 % (w/w) Cao Tía tơ 10% khơng làm thay đổi tỷ lệ chuột u, số khối u trung bình làm chậm xuất khối u tuần làm giảm thể tích khối u có ý nghĩa thống kê so với lô chứng glycerin 5% Trong thử nghiệm đánh giá tác động điều trị, cao Tía tô 10% không làm giảm tỷ lệ chuột u, số khối u trung bình thể tích trung bình khối u so với lơ bệnh Kết luận Cao tồn phần ethanol từ Tía tơ Perilla frutescens cho thấy hiệu dự phịng khơng thể tác động điều trị u da chuột nhắt trắng Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017 Speciality: Pharmacology – Clinical Pharmacology ANTI-TUMOR EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT FROM LEAVES OF PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE IN MOUSE SKIN Vuu Thanh Tu Quyen Supervisor: Assoc Prof Dr Huynh Ngoc Trinh Background This study aimed to investigate the antitumor effects of Perilla leaf extract (PLE) in a two-stage chemical carcinogenesis protocol in mice We also evaluates the effect of PLE on normal mouse skin Morevoer, we analysed perilla plant by microscopic method and formed pharmacopoeial standards of PLE Methods A whole plant of perilla was observed, analysed by microscopic method Total extract of Perilla leaves was obtained by percolation method using 50% ethanol The identification of PLE was performed by thin layer chromatography (TLC) with normal phase of silica gel F254 and HPLC-PDA with reversed phase of C18 column at UV 300 nm The cutaneous tumors were initiated by the a single application by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) on the dorsal shaved skin, then promoted by repeated applications of croton oil during 20 weeks Results The TLC chromatogram for the studied extract highlighted the presence of rosmarinic acid and luteolin By means of HPLC-PDA analysis, the content of rosmarinic acid and luteolin were found in amounts of 1.178 ± 0.011 % (w/w) and 0.105 ± 0.001 % (w/w), respectively In the preventing effect experiment, the PLEtreated group prolonged the latency period of tumor appearance up to weeks and also significantly reduced average tumor volume in dorsal skin of mice compared with untreated group In the treated effect experiment, PLE did not change the tumor incidence, tumor burden and average tumor volume Conclusion The ethanol extract from leaves of Perilla frutescens demonstrated promising antitumor-promotion in preventing activity but it did not show the prevented antitumor effect on mouse skin LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình trước Vưu Thanh Tú Qun i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thư da 1.1.1 Sự hình thành phát triển ung thư da 1.1.2 Tác nhân gây ung thư da 1.1.3 Phân loại ung thư da 1.2 Mơ hình gây u da giai đoạn hóa chất chuột thực nghiệm 1.2.1 Cơ chế tác động tác nhân gây u qua giai đoạn thử nghiệm 1.2.2 Tác nhân hóa học mơ hình gây u hai giai đoạn 1.2.3 Các mơ hình gây u da hai giai đoạn hóa chất nghiên cứu giới 1.2.4 Đặc điểm mô học khối u da chuột 10 1.3 Hoạt chất có tác dụng kháng u nghiên cứu 14 1.3.1 Imiquimod 14 1.3.2 Curcumin 14 1.3.3 Tía tơ 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Dược liệu Tía tơ 18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 18 ii 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 18 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Kiểm nghiệm dược liệu Tía tơ phương pháp vi học 20 2.2.2 Chiết xuất cao tồn phần từ Tía tơ 20 2.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao tồn phần Tía tơ 21 2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng cao toàn phần Tía tơ lên da chuột bình thường 24 2.2.5 Khảo sát tác động kháng u cao tồn phần Tía tơ lên mơ hình gây u da chuột 24 2.3 Đánh giá thử nghiệm 25 2.3.1 Đánh giá trình thử nghiệm 25 2.3.2 Đánh giá cuối thử nghiệm 26 2.4 Xử lý số liệu 26 Chương KẾT QUẢ 27 3.1 Kiểm nghiêm dược liệu Tía tơ phương pháp vi học 27 3.1.1 Đặc điểm hình thái Tía tơ 27 3.1.2 Bóc tách biểu bì Tía tô 29 3.1.3 Vi phẫu mơ thực vật Tía tơ 29 3.1.4 Khảo sát thành phần bột Tía tơ 34 3.2 Chiết xuất cao toàn phần từ Tía tơ 35 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần Tía tơ 35 3.3.1 Cảm quan 35 3.3.2 Thử tinh khiết 35 3.3.3 Định tính 36 3.3.4 Định lượng 38 iii 3.4 Đánh giá ảnh hưởng cao tồn phần Tía tơ 10% lên da chuột bình thường 39 3.5 Khảo sát tác động phòng ngừa điều trị u da cao tồn phần Tía tơ 40 3.5.1 Đánh giá ảnh hưởng aceton glycerin 5% da chuột 40 3.5.2 Đánh giá tác động phịng ngừa u da cao tồn phần Tía tô 10% 47 3.5.3 Đánh giá tác động điều trị u da cao TT 10% 57 Chương BÀN LUẬN 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 73 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh 5-LOX 5-lipoxygenase BCCs Basel cell carcinomas COX2 cyclooxygenase DĐVN IV Tiếng Việt Ung thư tế bào đáy Dược Điển Việt Nam IV DMBA 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen DNA Deoxyribo Nucleic Acid FDA Food and Drug Aministration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography NF-κB Nuclear factor kappa B PLA2 Phospholipase A2 RNA Ribo Nucleic Acid Yếu tố nhân kappa B Sắc ký lớp mỏng SKLM SCCs Squamous cell carcinomas Ung thư tế bào gai SEM Standard Error of Means Sai số chuẩn TNF-a Tumor necrosis factor alpha Yếu tổ hoại tử khối u TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13acetate Tía tơ TT UV Ultra violet Tia cực tím v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các hình thái lâm sàng BCCs .4 Hình 1.2 Ung thư tế bào gai – SCCs Hình 1.3 Cấu trúc hóa học 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA) Hình 1.4 Cấu trúc hóa học 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Hinh 1.5 Cấu trúc da người (a) da chuột (b) .10 Hình 1.6 Cấu trúc lớp biểu bì da .11 Hình 1.7 Quá trình hình thành SCCs da chuột 11 Hình 1.8 Hyperplasia da chuột .12 Hình 1.9 Papilloma da chuột 13 Hình 1.10 SCCs da chuột 13 Hình 1.11 Cấu trúc hóa học imiquimod 14 Hình 1.12 Cấu trúc hóa học hợp chất curcuminoid 15 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thân Tía tơ 27 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái hoa Tía tơ 28 Hình 3.3 Đặc điểm biểu bì Tía tơ .29 Hình 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân Tía tơ .30 Hình 3.5 Đặc điểm lỗ khí lơng che chở thân Tía tơ 30 Hình 3.6 Các kiểu lơng tiết thân Tía tơ 31 Hình 3.7 Cấu tạo vi phẫu gân .31 Hình 3.8 Đặc điểm lỗ khí lơng tiết Tía tơ 32 Hình 3.9 Cấu tạo vi phẫu phiến Tía tơ 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM tăng gai), tạo nhú Kết luận: papilloma 10, 13 Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa tế bào dị dạng, tạo cầu sừng cầu liên bào, có nghịch sản, tế bào u phá vỡ màng đáy, xâm nhập mô đệm Kết luận: Ung thư tế bào gai 1, 3, 12*, 13*, 14*, 15* Curcumin 4% 11* 10* Lớp biểu bì da chuột tăng sản, chủ yếu lớp gai (kèm tăng sừng nhẹ) Kết luận: hyperplasia Da chuột có tăng sản lớp biểu bì (tăng sừng tăng gai), tạo nhú Kết luận: papilloma Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa tế bào dị dạng, tạo cầu sừng cầu liên bào, có nghịch sản, tế bào u phá vỡ màng đáy, xâm nhập mô đệm Kết luận: Ung thư tế bào gai 5, 7, 9, 11 Lớp biểu bì da chuột tăng sản, chủ yếu lớp gai (kèm tăng sừng nhẹ) Kết luận: hyperplasia 3, Da chuột có tăng sản lớp biểu bì (tăng sừng tăng gai), tạo nhú Kết luận: papilloma Cao TT 10% dự phòng Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa nhiều tế bào u dị dạng bất thường Kết luận: papilloma kèm dysplasia 16 Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa tế bào dị dạng, tạo cầu sừng cầu liên bào, có nghịch sản, tế bào u phá vỡ màng đáy, xâm nhập mô đệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Kết luận: Ung thư tế bào gai 4, 9, 10, 12 Lớp biểu bì da chuột tăng sản, chủ yếu lớp gai (kèm tăng sừng nhẹ) Kết luận: hyperplasia Imiquimod 5% 2, Da chuột có tăng sản lớp biểu bì (tăng sừng tăng gai), tạo nhú Kết luận: papilloma Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa nhiều tế bào u dị dạng bất thường Kết luận: papilloma kèm dysplasia 1, 4, 11 Lớp biểu bì da chuột tăng sản, chủ yếu lớp gai (kèm tăng sừng nhẹ) Kết luận: hyperplasia Cao TT 10% 15 Da chuột có tăng sản lớp biểu bì (tăng sừng tăng gai), tạo nhú Kết luận: papilloma điều trị 9, 14, 17 Biểu bì da chuột tăng sản lớp tế bào gai, chứa tế bào dị dạng, tạo cầu sừng cầu liên bào, có nghịch sản, tế bào u phá vỡ màng đáy, xâm nhập mô đệm Kết luận: Ung thư tế bào gai Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ CAO TT 10% CHỨNG Da chuột bình thường Da chuột tăng gai nhẹ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ ACETON Da chuột bình thường Da chuột tăng gai nhẹ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ BỆNH Hyperplasia 10* 11* Papilloma 8 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 12* 13* 14* 14* Ung thư tế bào gai – SCC 1 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 15* 15* VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ GLYCERIN Hyperplasia Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 15 Papilloma 3 Ung thư tế bào gai – SCC 10 10 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 13 13 VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ CURCUMIN 4% Hyperplasia 12* 13* 15* 14* Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Papilloma 2 11* 11* Ung thư tế bào gai – SCC 9 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 10* 10* VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LƠ CAO TT 10% DỰ PHỊNG Hyperplasia 11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Papilloma 8 Ung thư tế bào gai – SCC 16 16 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM VI PHÃU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ IMIQUIMOD 5% Hyperplasia 10 12 Papilloma 1 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM VI PHẪU MÔ HỌC DA CHUỘT LÔ CAO TT 10% ĐIỀU TRỊ Hyperplasia 11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Papilloma 15 Ung thư tế bào gai – SCC 14 17 ... ti? ?u chuẩn sở cho cao tồn phần ethanol từ Tía tơ - Khảo sát tác dụng cao tồn phần Tía tơ da chuột bình thường - Khảo sát tác dụng phịng ngừa đi? ?u trị u da cao toàn phần Tía tơ 2 Chương TỔNG QUAN... V? ?U THANH TÚ QUYÊN KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TỒN PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 60720402 LUẬN... TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG V? ?u Thanh Tú Quyên Người hướng dẫn: PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh Mục ti? ?u Khảo sát tác dụng dự phòng đi? ?u trị u da cao tồn phần ethanol từ Tía