Khảo sát hoạt tính của quercetin từ cây an điền hai hoa ( hedyotis biflora (l) lam) lên chỉ tiêu về sinh lý của chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) đề xuất sử dụng quercetin chống lại bệnh ung thư

Tác dụng của quercetin đối với các chỉ tiêu sinh lý máu của chuột nhắt trắng hồng cầu, bạch cầu và hemoglobin.. Trọng lượng trung bình của chuột đực: Trọng lượng trung bình của chuột đực

1

TÁC GIẢ: Nguyễn Thái Kim Hằng

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng thảo mộc làm thuốc trị bệnh Ngày nay, với sự phát triển của khoa học, đặc biệt là lãnh vực nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên kết hợp với ngành sinh học, dược học và y học, người ta có thể xác định một cách khoa học nguồn gốc chữa bệnh của các phương thuốc cổ truyền Hơn thế, việc cô lập, ly trích, xác định cấu trúc, thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng vai trò then chốt trong quá trình khám phá các loại thuốc mới cũng như tổng hợp các hợp chất mới hữu ích cho đời sống con người

Như chúng ta đã biết, ung thư là căn bệnh nguy hiểm và có tỉ lệ tử vong cao hơn các bệnh khác Khảo sát gần đây tại Hà Nội, TP.HCM, cần Thơ, Thái Nguyên và Huế cho thấy, tỷ lệ mắc mới nhiều loại ung thư ở Việt Nam đang ngày càng tăng, ước tính ở Việt Nam có 100.000 người mắc ung thư mới/năm Ngày nay chứng ta chưa có một biện pháp nào dùng dể ngăn ngừa bệnh ung thư mà chỉ điều trị ung thư bằng các phương pháp như sau: hóa trị, xạ trị, giải phẫu Mặc dầu với tốc độ phát triển của kỹ thuật khá cao nhưng để tìm ra giải pháp chữa trị có hiệu quả về mặt y học lẫn kinh tế đối với bệnh ung thư thì vẫn còn nhiều mặt hạn chế và tốn kém

Gần đây, đã có một số nghiên cứu cho thấy, một vài ly trích từ thực vật có khả năng kháng phân bào Ngày nay không chỉ ở nước ta và các nước có nền Y học cổ truyền ở khu vực Châu

Á - Thái Bình Dương biết sử dụng cây cỏ làm thuốc, mà ở nhiều nước phát triển trên thế giới đang ngày càng có xu hướng quay lại với thảo dược để tận dụng các hoạt chất gần gũi với thiên nhiên, ít độc hại cho con người để dự phòng và điều trị ung thư một cách riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp điều trị để làm giảm độc tính và các tác dụng không mong muốn.Chứng ta đang sẵn có dồi dào nguồn dược liệu do thiên nhiên ban tặng, lẽ nào lại coi nhẹ

Chính vì thế chúng tôi muốn tiến hành nghiên cứu khả năng kháng phân bào của các chiết xuất tự nhiên này, cụ thể là quercetin trong cây An điền hai hoa (Hedyotií

biflora (L.) Lam.) Chúng tôi rất hy vọng sẽ khám phá ra một vài chiết xuất tự nhiên

cỗ khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư và dùng đề chữa ung thư hiệu quả hơn

Đây là bưởc đầu nghiên cứu hoạt tính của quercetin - ly ưích từ cây An điền hai

hoa (Hedyotis biflora (L.) Lam.) của chúng tôi

12* Giới hạn đề tàỉ

- Xác định chỉ tiêu về trọng lượng và sinh lý máu của chuột (số lượng hồng cầu,

sé lượng bạch cầu, hàm lượng hemoglobin)

- Nghiên cứu trên chuột nhắt trắng Mus musculus Var Albino

13 Thòi gỉan và địa điểm

- Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2009 đến tháng 05/2009

- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Công Nghiệp IV

1A Tồng quan

1.4.1 Cây An điền hai hoa:

- Tên khoa học: Hedyotis biflora (L.)

Cây An điền hai hoa (Hedyotis biflora (L.) Lam.) thích hợp với đất cát, nơi thoáng mát,

thường gặp ở sân vườn, từ bình nguyên đến trung du khắp nước ta, và nhiều nước nhiệt đới khác (Nam Trung Quốc, các nước Châu Á, Phi, Mỹ như Ấn Độ, Indonesia )

3

An điền hai hoa có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, bổ thần kinh, trị vết rắn cắn và trị đau bao tử Ở Minh Hải nhân dân dùng cây sắc nước uống để giúp kháng viêm sau khi mổ, đau xương cốt thấp khớp Ở Ấn Độ cây dùng để chữa dạ dày bị kích thích, suy giảm thần kinh

1.4.2 Quercetin:

1.4.2.1 Nguồn gốc:

Quercetin là một trong số các màu vàng tự nhiên được phân bố rất rộng rãi trong thực vật Nó được phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercetin có trong vỏ cây Quercus tinctoria; khi thủy giải quercetin trong môi trương acid thì nhận được

quercetin và một phân tử rhamnose

C21H20On + H2O - ►C15H10O7 +CH3(CHOH)4CHO

1.4.2.2 Tên gọi:

- Tên thương mại: Quercetin

- Tên quốc tế: 2-(3, 4 - dihydroxyphenyl) - 3 , 5 , 7 - trihydroxy- 4H- chromen - 4- one

Tên gọi khác: 3, 3’, 4’, 5, 7- Pentahydroxyflavone; Meletin; Sophoretin

Bột kết tinh màu vàng, hình kim

- Điểm nóng chảy: 316 - 317°c (có tài liệu ghi là 313 - 314°C)

- Độ hòa tan: lg quercetin hòa tan trong 290 ml cồn tuyệt đối, 23 ml cồn sôi

Công thức phân tử:

Công thức cấu tạo:

rr"

O-nnnciia

Tính tan: tan trong acid acetic băng, tan trong dung dịch kiềm có màu vàng, không tan trong nước

1.4.2.5 Tính chất hóa học:

- Quercetin khi đun với KOH thì tạo thành hai sản phẩm có cấu trúc đơn giản hơn 12 phloroglucinol và acid protocatechuic

Tác dụng với diazometan hoặc dimetilsulíat trong môi trường kiềm tạo thảnh hợp chất

pentametilquercetin (3, 5, 7, 3’, 4’ - pentametoxiflavon) có điểm nóng chảy là 152°c

Hợp chất này khi đun sôi với dung dịch KOH trong EtOH thì nhận được hai sản phẩm mới

- Nhóm 3 - o - metal của quercetin pentametil eter thủy giải khá nhanh trong môi trường acid

1.4.2.6 Tính kháng và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư:

- Dựa trên các nghiên cứu thử nghiệm in vitro thì quercetin không những có hoạt tính kháng

ung thư mà còn có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các dòng ung bướu ác tính Kết quả nghiên cứu của Yoshida và cộng sự cho thấy quercetin có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các dòng ung thư dạ dày HGC-27, NUGC-2, NKN-7 và MKN-28

- Nghiên cứu của Markaverich và Scambia cho thấy quercetin có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư vú, buồng trứng và ung thư ruột (COLON 320 DM)

1.4 Các công trình nghiên cứu liên quan

Trong nước:

Phạm Nguyễn Kim Tuyến (2008), Luận án tiến sĩ hóa học - “Tìm hiểu thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Hedyotis mọc ở Việt Nam và điều chế một số dẫn xuất Thioílavon từ các Flavon cô lập được”, ĐH Khoa học tự nhiên

5

- Nguyễn Trung Nhân (2000), Luận án thạc sĩ hóa học - “Ly trích Rutin từ cây hoa hòe

Sophora jaonica., và điều chế Quercetin cùng các dẫn xuất”, ĐH Khoa học tự nhiên

- Lương Đăng Hoàng (2007), “ Sử dụng phương pháp bàn cờ để khảo sát tác dụng hiệp

đồng giữa Flavonoid và kháng sinh trên Staphylococcus aureus đề kháng methicillin”,

ĐH Y Dược TP.HCM

Bài báo:

- Nguyễn Cửu Khoa , Hoàng Thị Kim Dung (2003), “Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất

của Quercerin, xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chúng”, Hoả học thế kỷ

XXI vì sự phát triển bền vững: Tuyển tập các session, 3

Phạm Nguyễn Kim Tuyến; Nguyễn Kim Phi Phụng; Phạm Đình Hùng, Khảo sát hỏa

học cây an điền hai hoa Hedyotis biflora L., Tuyển tập các công trình Hội nghị khoa học

và công nghệ hoá học hữu cơ toàn quốc lần thứ tư - Hội Hoá học Việt Nam ; 2007/SỐ

00 552-555

Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh (2006), “So sánh hoạt tính chống ôxy hoá của một số flavonoid (dạng glucosid và genin) chiết từ hoa hoè và

vỏ quýt”( Extraction - hydrolysis and comparison of antioxidant activity of some

flavonoids from Sophora japonica and Citrus deliciosa Peel), Tạp chỉ Dược liệu

antioxidant activity, The Naresuan University Journal

Lee Wattenberg (2006), Influence of quercetin and rutin on growth and antioxidant

defense system of a human hepatoma cell line (HepG2), The European Journal of

Nutrition

European Journal of Nutrition (2006), “Ảnh hưởng của quercetin và rutin lên sự phát triển và hệ bảo vệ chống oxi hóa của dòng tế bào ung thư gan người” (Influence of quercetin and rutin on growth and antioxidant defense system of a human hepatoma cell line (HepG2))

Chương 2: MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Muc tiêu

Khảo sát tác dụng của quercetin trên các chỉ tiêu sinh lý của chuột nhắt trắng Mus

musculus var Albino

Với các mục tiêu:

Tác dụng của quercetin đối với trọng lượng chuột nhắt trắng

Tác dụng của quercetin đối với các chỉ tiêu sinh lý máu của chuột nhắt trắng (hồng cầu, bạch cầu và hemoglobin )

2.2 Phương pháp

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Cây An điền hai hoa ( Hedyotis biflora (L.) Lam.) được thu hái ở ven các sườn đồi thuộc địa phận huyện Đồng Xoài, tỉnh Bình Phước Cây An điền hai hoa( Hedyotis biflora (L.)

Lam.) được nhận danh khoa học bởi ThS Liêu Hồ Mỹ Trang, Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

- Chuột nhắt trắng Mus musculus Var Albino được mua tại viện Pastuer Hồ Chí Minh về

nuôi ổn định một tuần tại chuồng chuột cơ sở chuột

7

Chuột thỉ muscuỉus

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm lặp lại trên 3 lô chuột giống nhau Mỗi lô được chia thành 3 liều thí nghiệm:

• Liều 1 là liều thí nghiệm được cho chuột uổng 0,01 ml dung dịch vởi tỉ lệ 2mg/ml Quercetin pha với Dimethylsunlphoxide (DMSO)

• Liều 2 là liều thí nghiệm được cho chuột uống 0,01 ml dung dịch với tỉ lệ 5mg/ml Quercertin pha DMSO

• Liều đối chứng là liều thí nghiệm được cho chuột uống 0,01 ml dung dịch DMSO Mỗi liều gồm 2 nhóm chuột đực và chuột cái (5 con/nhỗm) Cứ cách 3 ngày sẽ khảo

sát cho uống thuốc và khảo sát các chỉ tiêu: trọng lượng, sinh lý máu của mỗi lô

Bảng 2.1: Phân liều thí nghiệm ở mỗi lô

Hình 2.2: Phần ỉô chuột ỉàm thỉ nghiệm

Các chỉ tiêu sinh lí khảo sát: trọng lượng, số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng hemoglobin ở các mốc thời gian 3, 6, 9,12,15,18,21 ngày uống quercetin

Becher 200 ml Hình 2.3: Dụng cụ theo dõi trọng lượng

b Theo dõi hồng cầu - bạch cầu - hemoglobin:

- Dụng cụ sát trùng và chích máu - Ống nhốt chuột

- Dụng cụ lấy máu để theo dối hàng cầu, bạch cầu - cồn 70°, bông gòn

- Ống trộn hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin - Giá kẹp đỡ chuột

9

cầu, bạch cầu, hàm lượng hemoglobin

2.2.3 Theo dõi trọng lượng chuột:

Trọng lượng chuột được cân kiểm tra bằng cân điện tử và ghi nhận sự thay đổi trọng lượng chuột

2.2.4 Phưomg pháp đếm sá lượng hồng cầu:

Nguyên tắc:

Pha loãng máu ở một tỉ lệ nhất định, cho máu đó vào trong một phòng đếm đã biết rõ kích thưởc rồi đếm dưới kính hiển vi ở một số thể tích nhất định, và tính ra số lượng hồng cầu có trong lmm3 máu

Dung dịch đếm hồng cầu: sử dụng dung dịch Marcano (gồm 5g Na2 SO4 , 1 ml formol, vài giọt xanh methylen, nước cất vừa đủ 100 ml)

- Công thức tính hồng cầu /mm3 máu là:

N = A/80 X 4000 X 200= A xioooo (tế bào/mm3máu)

Vói N: số lượng hồng cầu trong lmm3 máu

Kết quả:

số lượng hồng cầu đếm được trong lmm3 máu là số lượng hồng cầu đếm được trong 5 ô lớn trên phòng đếm Neubauer nhân với 104

2.2.5 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu:

Nguyên tắc:

Pha loãng máu ở một tỷ lệ nhất định bằng dung dịch Lazarus, để phá vỡ hồng cầu và tạo nền xanh để nhận dạng bạch cầu Sau đó vào phòng đếm biết rõ kích thước rồi đếm dưới kính hiển

vi ở một số thể tích nhất định, và tính ra số lượng bạch cầu có trong lmm3 máu

Dung dịch đếm bạch cầu: sử dụng dung dịch Lazarus (gồm 5 ml dung dịch acid acetic bão hòa, 2-3 giọt xanh methylen trong cồn 90°, nước cất vừa đủ 100 ml)

Kết quả:

Đọc theo kết quả của hemoglobin chuẩn có trên bộ huyết sắc kế Sahli

2.2.7 Phương pháp xử lý sổ liệu:

Trọng lượng trung bình của chuột đực:

Trọng lượng trung bình của chuột đực thí nghiệm được xử lí thống kê và trình bày trong bảng 3.1, và đồ thị 3.1

Bảng 3.1: Trọng lượng TB (g) của chuột đực ở các mốc thời gian khảo sát

Đồ thị 3.1: Trọng lượng TB (g) của chuột đực ở các mốc thời gian khảo sát

Dựa vào bảng 3.1, đồ thị 3.1 và kiểm định bằng ANOVA (bảng 1 phần phụ lục) ta thấy: Trọng lượng trung bình của chuột đực giữa liều 1, liều 2 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,82 > 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột đực giữa liều 1 và liều 2 ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,98 > 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột đực giữa liều 1 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,56 > 0,05)

13

Trọng lượng trung bình của chuột đực giữa liều 2 và liều đối chứng ở các mốc thời

gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,63 > 0,05)

Bên cạnh đó, với kết quả ở bảng thống kê mô tả trọng lượng trung bình của chuột đực ở các mốc thời gian khảo sát (bảng 2 phần phụ lục), cho thấy độ chính xác (P) giao động tương đối lớn (95,65% - 98,85%) và hệ số phân tán (CV) giao động tương đối nhỏ (1,15%-4,35%) Như vậy, trọng lượng của chuột đực giữa 3 liều thí nghiệm khác biệt không ý nghĩa thống

kê sinh học ở điểm thời gian khảo sát Vậy việc cho chuột nhắt trắng đực uống quercetin không ảnh hưởng đến sự tăng trọng bình thường của chuột

Trọng lượng trung bình của chuột cái :

Trọng lượng trung bình của chuột cái thí nghiệm được xử lí thống kê trình bày trong bảng 3.2 và đồ thị 3.2

Bảng 3.2: Trọng lượng TB (g) của chuột cải ở các mốc thời gian khảo sát

Đồ thị 3.2: Trọng lượng TB (g) của chuột cải ở các mốc thời gian khảo sát

Dựa vào bảng 3.2, đồ thị 3.2 và kiểm định bằng ANOVA (bảng 3 phần phụ lục) ta thấy: Trọng lượng trung bình của chuột cái giữa liều 1, liều 2 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,59 > 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột cái giữa liều 1 và liều 2 ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,35 > 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột cái giữa liều 1 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,41> 0,05)

Trọng lượng trung bình chuột cái giữa liều 2 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,96 > 0,05)

Bên cạnh đó, với kết quả ở bảng thống kê mô tả trọng lượng trung bình của chuột cái ở các mốc thời gian (bảng 4 phần phụ lục); cho thấy độ chính xác (P) giao động tương đối lớn 95,96%

- 98,61%) và hệ số phân tán (CV) giao động tương đối nhỏ (1,39%-4,04%)

Như vậy, trọng lượng trung bình của chuột cái giữa 3 liều thí nghiệm khác biệt không ý nghĩa thống kê sinh học ở điểm thời gian khảo sát Vậy việc cho chuột nhắt trắng cái khi uống quercetin không ảnh hưởng đến sự tăng trọng bình thường của chuột

Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái

Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái thí nghiệm được xử lí thống kê và được trình bày bày trong bảng 3.3, và đồ thị 3.3

15

Bảng 3.3: Trọng lượng TB (g) của chuột đực và cái ở

các mốc thời gian khảo sát

18

Đực 28,13+3,29 28,79 + 3,83 28,18+3,61 Cái 26,36 +0,55 27,95 +2,25 27,95 +0,65

21

Đực 28,68 +3,21 29,34 + 1,95 28,91 +2,05 Cái 27,20 + 1,08 28,33 +2,25 28,50 + 0,57

Đồ thị 3.3: Trọng lượng TB (g) của chuột đực và cái ở các mốc thời gian khảo

sát

Dựa vào bảng 3.3, đồ thị 3.3 và kiểm định bằng ANOVA (bảng 5 phần phụ lục) ta thấy: Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái giữa liều 1, liều 2 và liều đối chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,81 >0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái giữa liều 1 và liều 2 ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,55 > 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái giữa liều 1 và liều đối chứng ở cácmốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,97> 0,05)

Trọng lượng trung bình của chuột đực và cái giữa liều 2 và liều đối chứng ởcác mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,60 > 0,05)

Bên cạnh đó, với kết quả ở bảng thống kê mô tả trọng lượng trung bình của chuột đực và chuột cái ở các mốc thời gian khảo sát (bảng 6 phần phụ lục); cho thấy độ chính xác (P) giao động tưorng đối lớn (90,96% - 93,54%) và hệ số phân tán (CV) giao động tương đối nhỏ (6,46% - 9,04%)

Như vậy, trọng lượng trung bình của chuột đực và chuột cái giữa 3 liều thí nghiệm khác biệt không ý nghĩa thống kê sinh học ở điểm thời gian khảo sát Vậy việc cho chuột nhắt trắng đực và cái uống quercetin không ảnh hưởng đến sự tăng trọng bình thường của chuột

17

3.2.Các chỉ tiêu sinh lý máu giữa lô đổi chứng và lô thí nghiệm

3.2.1 Hàm lượng hemoglobin trung bình:

Hàm lượng hemoglobin trung bình của chuột đực:

Hàm lượng hemoglobin trung bình của chuột đực thí nghiệm được xử lí thống kê và trình bày trong bảng 3.4, và đồ thị 3.4

Bảng 3.4 : Hàm lượng hemoglobin TB (%) của chuột đực ở các mốc thời gian

khảo sát

Liều thí nghiệm

3 12,13+0,25 11,69 + 1,09 11,75+0,85 Thời 6 11,95+0,21 11,87 + 1,45 12,08+0,95 gian

khảo

9 12,21 +0,32 11,97+0,85 12,17 + 1,60 sát 12 12,79+0,35 12,25+0,64 12,49 + 1,09 (ngày) 15 12,37+0,40 12,41+0,72 12,51 + 1,32

18 12,69+0,15 12,71+0,38 12,79+0,80

21 12,91 +0,65 12,51+0,35 12,71 +0,45

Đồ thị 3.4: Hàm lượng hemoglobin TB (%) của chuột đực ở các mốc thời gian khảo

sát

Dựa vào bảng 3.4, đồ thị 3.4 và kiểm định bằng ANOVA (bảng 7 phần phụ lục) ta thấy:

Hàm lượng hemoglobin trung bình của chuột đực giữa liều 1, liều 2 và liều đối

chứng ở các mốc thời gian khảo sát khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,50 >

0,05)