Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển ( bacopa monnieri (l) wettst) trên chuột nhắt trắng chưa trưởng thành

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG MAI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI (L) WETTST) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG CHƯA TRƯỞNG THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HOÀNG MAI MÃ SINH VIÊN: 1501315 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI (L) WETTST) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG CHƯA TRƯỞNG THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phí Thị Xuyến PGS TS Đào Thị Vui Nơi thực hiện: Khoa Dược lý Sinh hóa - Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp mình, em nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm nhiệt tình đến từ cá nhân, tập thể Đó hỗ trợ động lực to lớn giúp em hồn thành khóa luận cách trọn vẹn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Đào Thị Vui tạo điều kiện cho em tham gia làm khóa luận Viện Dược liệu ln hết lịng giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu giúp em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng ThS Phí Thị Xuyến - Khoa Dược lý Sinh hóa - Viện Dược liệu, người thầy, người chị luôn tận tình bảo, giúp đỡ em từ ngày em tham gia nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình anh chị khoa Dược lý Sinh hóa – Viện dược liệu Được làm việc gắn bó với anh chị suốt q trình làm khóa luận điều may mắn khoảng thời gian vô đáng nhớ em Em xin cảm ơn Ban Giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em học tập tham gia nghiên cứu khoa học, trang bị cho em kiến thức quý báu suốt năm học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ln động viên giúp đỡ em, làm động lực chỗ dựa tinh thần vững giúp em vượt qua khó khăn học tập sống Hà Nội, ngày 18 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Hoàng Mai MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ iii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phát sinh thần kinh giai đoạn vị thành niên .2 1.1.1 Định nghĩa vị thành niên 1.1.2 Sự phát sinh thần kinh (neurogenesis) thùy hải mã .3 1.1.3 Mối liên hệ phát sinh thần kinh thùy hải mã khả ghi nhớ, học tập .5 1.1.4 Sự phát sinh thần kinh tuổi vị thành niên 1.1.5 Một số yếu tố nguy ảnh hưởng đến khả ghi nhớ, nhận thức phát sinh thần kinh tuổi vị thành niên 1.2 Tổng quan Rau đắng biển .10 1.2.1 Tên gọi, phận dùng 10 1.2.2 Phân bố 10 1.2.3 Thành phần hóa học .11 1.2.4 Tác dụng dược lý 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Nguồn gốc 17 2.1.2 Chuẩn bị cao chiết Rau đắng biển 17 2.2 Nguyên vật liệu, trang thiết bị hóa chất .18 2.2.1 Động vật thí nghiệm .18 2.2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 19 2.3.2 Đánh giá tác dụng tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh thơng qua phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch 21 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 25 3.1.1 Kết đối tượng chuột tuần tuổi sử dụng cao chiết Rau đắng biển vòng ngày 28 ngày 25 3.1.2 Kết đối tượng chuột tuần tuổi tuần tuổi sử dụng cao chiết Rau đắng biển vòng ngày 26 3.2 Đánh giá tác dụng tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh thơng qua phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch .27 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 30 4.1 Bàn luận phương pháp nghiên cứu 30 4.1.1 Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 30 4.1.2 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch .31 4.2 Bàn luận kết nghiên cứu .33 4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 33 4.2.2 Đánh giá tác dụng tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh thơng qua phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BME Bacopa monnieri extract (Cao chiết Rau đắng biển) BrdU 5-bromo-2’-deoxyuridin DCX Doublecortin NeuN Neuronal nuclear antigen (Kháng nguyên nhân tế bào thần kinh) T2VO Transient vessels occlusion (Thắt tạm thời động mạch cảnh chung) GABA Gama-amonibutyric acid LD50 Lethal dose 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) TBS-T Tris buffered saline-Tween 20 (Dung dịch đệm Tris Tween 20) PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm phosphat) PKC Protein kinase C PI3K/Akt Phosphoinositide 3-kinases/Protein kinase B V/v Volume/volume (Thể tích/thể thích) W/v Weight/volume (Khối lượng/thể tích) 2D NMR Two-dimentional nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều) 3D NMR Three-dimentional nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều) GCL Granule cell layer (Lớp tế bào hạt) SGZ Subgranular zone (Vùng cận tế bào hạt) DG Dentate gyrus (Hồi răng) i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các trang thiết bị, dụng cụ, phần mềm sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Các hóa chất dùng nghiên cứu 19 ii DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển theo độ tuổi chuột nhắt trắng người [19] Hình 1.2 Sự biệt hóa trưởng thành tế bào thần kinh hồi [3] Hình 1.3 Cây Rau đắng biển 10 Hình 1.4 Aglycol bacosid 11 Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị cao chiết Rau đắng biển 17 Hình 2.2 Thời gian tiến hành thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 20 Hình 2.3 Thiết kế thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến 21 Hình 2.4 Thời gian tiến hành nhuộm hóa mơ miễn dịch 22 Hình 3.1 Tỷ lệ thời gian chuột khám phá cánh thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến sau sử dụng cao chiết Rau đắng biển từ lúc tuần tuổi vòng ngày 28 ngày 25 Hình 3.2 Tỷ lệ thời gian chuột khám phá cánh thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến sau sử dụng cao chiết Rau đắng biển vòng ngày 26 Hình 3.3 Ảnh chụp tiêu nhuộm BrdU lơ chứng lô sử dụng BME 27 Hình 3.4 Số lượng tế bào dương tính với BrdU vào ngày 28 Hình 3.5 Ảnh chụp tiêu nhuộm BrdU NeuN 29 Hình 4.1 Chu kì tế bào 32 Hình 4.2 Các protein biểu trình phát triển tế bào thần kinh [14] 33 iii ĐẶT VẤN ĐỀ Thùy hải mã khu vực não có vai trị quan trọng chức học tập trì trí nhớ [2], [43] Đây số vùng não mà phát sinh thần kinh (neurogenesis) từ tế bào gốc thần kinh diễn sau sinh tiếp diễn tuổi trưởng thành Ngày nay, nhiều nghiên cứu giới thực chứng minh phát sinh thần kinh hồi hãi mã có liên quan đến khả ghi nhớ, nhận thức [26], [18] Đặc biệt, phát sinh thần kinh thùy hải mã diễn mạnh mẽ tuổi vị thành niên, gợi ý giai đoạn quan trọng phát triển chức não nói chung khả ghi nhớ, nhận thức nói riêng [15] Vì vậy, mặt, giai đoạn này, não nhạy cảm dễ bị tổn thương yếu tố công Mặt khác, phát triển nhanh chóng não giai đoạn mở hội để nghiên cứu biện pháp can thiệp nhằm tăng cường chức não bộ, đồng thời giúp ngăn ngừa làm giảm nhẹ tổn thương xảy đến, từ dự phịng nguy suy giảm trí nhớ, nhận thức Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst), hay gọi rau sam trắng, rau sam đắng, biết đến loại thuốc bổ thần kinh điều trị rối loạn thần kinh suy giảm trí nhớ, trầm cảm, động kinh [1], [2] Nhiều nghiên cứu đại thành phần hóa học dược lý chứng minh tác dụng Rau đắng biển hệ thần kinh chuột người Ở Việt Nam có số nghiên cứu chứng minh hiệu cao chiết Rau đắng biển (BME) điều trị suy giảm trí nhớ mơ hình động vật thực nghiệm [28], [42], nhiên chưa có nghiên cứu thực đối tượng vị thành niên khỏe mạnh để đánh giá tác dụng BME lên chức ghi nhớ/nhận thức phát sinh thần kinh thùy hải mã Vì vậy, để nghiên cứu tác dụng dược lý Rau đắng biển mở triển vọng phát triển thuốc dự phòng, ngăn ngừa suy giảm trí nhớ, đề tài “Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) chuột nhắt trắng chưa trưởng thành” thực với hai mục tiêu sau: Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ Rau đắng biển chuột nhắt trắng chưa trưởng thành thông qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến Đánh giá tác dụng tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh Rau đắng biển chuột nhắt trắng chưa trưởng thành phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phát sinh thần kinh giai đoạn vị thành niên 1.1.1 Định nghĩa vị thành niên Vị thành niên định nghĩa giai đoạn chuyển giao độ tuổi trẻ em người lớn Mặc dù thuật ngữ vị thành niên dậy có liên quan đến nhau, số trường hợp sử dụng thay cho nhau, nhiên khái niệm khơng hồn tồn đồng nghĩa Cụ thể, dậy giai đoạn phát triển riêng biệt đánh dấu thay đổi rõ rệt hình thể hormon sinh dục Trong đó, vị thành niên giai đoạn rộng dậy thì, thời điểm khởi phát dậy kết thúc đạt trưởng thành mặt thể chất, khả sinh sản hành vi, tâm lý người lớn [19] Độ tuổi cụ thể giai đoạn chưa thống quốc gia, tổ chức y tế hay nhà nghiên cứu giới Trong Tổ chức Y tế giới (WHO) quy định lứa tuổi vị thành niên từ 10 đến 18 tuổi [19], nhiều nhà nghiên cứu quan niệm 10 đến 20 tuổi tuổi vị thành niên [41], chí theo số nhà nghiên cứu, 25 tuổi xem vị thành niên muộn [5] Độ tuổi phụ thuộc vào giới, với giới nữ cho trưởng thành nhanh so với giới nam Đối với động vật thực nghiệm, việc xác định xác độ tuổi giai đoạn vị thành niên vấn đề gây nhiều tranh cãi Theo Spear Brake, vị thành niên khoảng thời gian trưởng thành mặt giới tính mà có thay đổi hành vi tâm lý rõ rệt theo độ tuổi Theo đó, chuột nhắt, giai đoạn xác định khoảng thời gian từ 30 đến 42 ngày tuổi [51] Cũng giống người, thời gian bắt đầu kết thúc vị thành niên chuột nhắt khác cá thể, với chuột nhắt đực có xu hướng trưởng thành chậm so với chuột nhắt Trong số trường hợp, dấu hiệu vị thành niên xuất chuột 20 ngày tuổi, chuột đực, thời gian kết thúc vị thành niên kéo dài đến 60 ngày tuổi [19] Hình 3.5 Ảnh chụp tiêu nhuộm BrdU NeuN Hình 3.6 Số lượng tế bào dương tính với BrdU NeuN vào ngày 28 Chú thích: Mỗi cột biểu diễn giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n= 4) với **p < 0,01 so sánh với lô chứng Nhận xét: Sau tuần từ ngưng sử dụng BME, tức ngày 28 kể từ liều BME đầu tiên, số lượng tế bào gốc thần kinh sinh biệt hóa thành tế bào thần kinh trưởng thành (bắt màu BrdU NeuN) lô sử dụng BME tăng khoảng lần so với lô chứng (p < 0,01) 29 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Bàn luận mức liều cao chiết Rau đắng biển sử dụng nghiên cứu Rau đắng biển loại dược liệu sử dụng từ lâu đời Các nghiên cứu đại tác dụng dược lý BME thực nhiều giới thông qua mơ hình động vật thực nghiệm Trong nghiên cứu này, mức liều BME thường sử dụng từ 20mg/kg đến 100mg/kg Ở Việt Nam, nghiên cứu tác giả Lê Thị Xoan cộng năm 2015 chứng minh BME sử dụng với liều 50mg/kg có tác dụng cải thiện khả ghi nhớ ngắn hạn mơ hình chuột thiếu máu não cục gây cách thắt tạm thời hai động mạch cảnh chung Ngoài ra, nghiên cứu tác giả Phạm Thị Nguyệt Hằng cộng sử dụng mô hình gây độc tế bào thần kinh chuột trimethyltin cho thấy BME liều 50mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ chuột thơng qua chế bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tác động trimethyltin chế phụ thúc đẩy phát sinh thần kinh thùy hải mã Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn mức liều 50mg/kg cân nặng để tiến hành đánh giá tác dụng BME đối tượng chuột nhắt trắng chưa trưởng thành 4.2 Bàn luận phương pháp nghiên cứu 4.2.1 Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến thử nghiệm hành vi dùng để đánh giá khả sẵn sàng khám phá môi trường loài động vật gặm nhấm, có chuột nhắt Trong nghiên cứu này, thử nghiệm tiến hành với mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn hình thành thơng qua trình học tập làm việc phụ thuộc vào vị trí khơng gian cao chiết Rau đắng biển đối tượng chuột nhắt chưa trưởng thành khỏe mạnh Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến tiến hành qua hai giai đoạn: + Giai đoạn luyện tập: ba cánh đóng lại với mục đích cho chuột tự khám phá làm quen với hai cánh mở + Giai đoạn kiểm tra: cánh lại mở với vai trò cánh với mục đích kiểm tra thời gian mà chuột khám phá cánh Trong thử nghiệm này, chuột có khả ghi nhớ khơng gian tốt có xu hướng nhận diện cánh thích khám phá cánh nhiều khám phá lại hai cánh quen thuộc trước Khả ghi nhớ, làm việc có liên quan đến khơng gian phụ thuộc vào chức thùy hải mã não chuột 30 Ngày nay, có nhiều mơ hình sử dụng để đánh giá chức ghi nhớ, nhận thức chuột Tuy nhiên, khuôn khổ nghiên cứu này, thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến lựa chọn mơ hình có nhiều ưu điểm Đầu tiên, mê lộ chữ Y cải tiến thử nghiệm đánh giá khả ghi nhớ không gian liên quan đến trình học tập phụ thuộc vào thùy hải mã não chuột Thùy hải mã số vùng não mà phát sinh thần kinh diễn suốt đời [26] Sự phát sinh thần kinh thùy hải mã chứng minh đóng vai trị quan trọng chức ghi nhớ, học tập nhận thức, đặc biệt tuổi vị thành niên [15] Nghiên cứu thực nhằm đánh giá tác dụng cải thiện khả ghi nhớ, nhận thức khả phát sinh thần kinh thùy hải mã chuột nhắt trắng chưa trưởng thành sau sử dụng BME Vì vậy, mê lộ chữ Y cải tiến thử nghiệm hành vi phù hợp với mục tiêu nghiên cứu Ngoài ra, thử nghiệm dựa tị mị thích khám phá thứ lạ chuột, đặc tính đánh giá sau khoảng thời gian luyện tập ngắn, tiết kiệm thời gian tiến hành thí nghiệm Bên cạnh đó, thử nghiệm để đánh giá trí nhớ ngắn hạn, ghi nhớ chuột hoạt động diễn thử nghiệm không kéo dài lâu, từ cho phép thực thử nghiệm nhiều lần đối tượng mà kết thử nghiệm không bị ảnh hưởng lẫn (thử nghiệm lần sau tiến hành sau thử nghiệm lần trước tuần) Cuối cùng, trang thiết bị sử dụng cho thử nghiệm tương đối đơn giản, không đắt tiền, trình vận động, di chuyển chuột dễ dàng ghi lại tính tốn [13] Những ưu điểm cho thấy thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến cơng cụ hữu dụng thích hợp để đánh giá khả ghi nhớ, làm việc phụ thuộc không gian chuột nhắt trắng chưa trưởng thành 4.2.2 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Để tìm hiểu chế tác dụng BME lên cải thiện trí nhớ, nhận thức chuột nhắt chưa trưởng thành, nghiên cứu sử dụng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch để đánh giá phát sinh thần kinh thùy hải mã Nhuộm hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) kĩ thuật nhằm phát kháng nguyên (protein) tế bào dựa nguyên tắc sử dụng kháng thể gắn đặc hiệu vào kháng nguyên mong muốn mơ sinh học Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch sử dụng phổ biến nghiên cứu để tìm hiểu vị trí phân bố dấu (marker) sinh học protein biểu khác phần tế bào [44] 31 Sự tăng sinh, hay trình phân chia tế bào gốc thần kinh xác định cách gắn chất đánh dấu vào tế bào dựa vào đặc điểm tế bào pha khác chu kì tế bào (Hình 4.1) Ngày nay, Ki67 BrdU hai dấu sử dụng phổ biến để xác định tế bào phân chia Trong đó, Ki67 protein bắt đầu biểu tế bào từ tế bào trải qua pha G1, BrdU gắn vào tế bào tế bào trải qua pha tổng hợp ADN (pha S) Nghiên cứu sử dụng chất đánh dấu BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridin), hợp chất hóa học có cấu trúc tương tự thymidin (một bốn nucleosid chuỗi ADN) BrdU, sau sử dụng đường uống đường tiêm, có cấu trúc tương tự thimidin nên tạo liên kết tế bào vị trí thymidin tế bào trải qua q trình nhân đơi ADN pha S Các tế bào gốc thần kinh phân chia gắn BrdU sau nhuộm với kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp có gắn chất phát huỳnh quang để dễ dàng quan sát kính hiển vi phát huỳnh quang [36] Hình 4.1 Chu kì tế bào Trong q trình biệt hóa phát triển từ tế bào gốc thần kinh thành tế bào thần kinh trưởng thành, tế bào dần biểu dấu protein thần kinh (protein marker) khác Việc đánh giá mức độ biệt hóa từ tế bào gốc thần kinh thành tế bào thần kinh chủ yếu dựa kĩ thuật đánh dấu dấu protein, ví dụ doublecortin (DCX) bắt đầu biểu từ nguyên bào thần kinh hình thành biến tế bào thần kinh trưởng thành sử dụng làm dấu đánh giá tế bào thần kinh chưa trưởng 32 thành; hay NeuN, dấu protein nhân tế bào thần kinh, đặc trưng cho xuất tế bào thần kinh trưởng thành (Hình 4.2) [14] Thí nghiệm nhuộm hóa mơ miễn dịch vào ngày 28 thực nhằm đánh giá khả biệt hóa từ tế bào gốc thần kinh thành tế bào thần kinh trưởng thành sau sử dụng BME, dấu protein tế bào thần kinh trưởng thành NeuN lựa chọn Đồng thời, để phân biệt loại trừ tế bào thần kinh trưởng thành tồn từ trước sử dụng BME, nghiên cứu sử dụng phương pháp nhuộm kép, đánh dấu BrdU NeuN Sau nhuộm, tế bào dương tính với BrdU NeuN tế bào thần kinh trưởng thành vừa biệt hóa từ tế bào gốc thần kinh tăng sinh Hình 4.2 Các protein biểu trình phát triển tế bào thần kinh [14] 4.3 Bàn luận kết nghiên cứu 4.3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thông qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến Kết thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến đối tượng chuột tuần tuổi (độ tuổi chưa trưởng thành) cho thấy sau sử dụng BME vòng ngày, chuột dành nhiều thời gian để khám phá cánh (p < 0,05 so sánh với lô chứng sinh lý), thể tăng đáng kể khả ghi nhớ phụ thuộc khơng gian so với nhóm chuột đối chứng Tuy nhiên, cải thiện trí nhớ khơng gian khơng xảy kéo dài thời gian sử dụng BME lên 28 ngày (đến chuột bước vào tuổi trưởng thành) (p > 0,05 so sánh với lô chứng) Kết tương đồng với kết từ thử nghiệm lâm sàng thực đối tượng trẻ từ 7-12 tuổi, việc bổ sung BME vào chế độ dinh dưỡng vòng 60 ngày giúp làm tăng khả ghi nhớ, làm việc có liên quan đến 33 không gian, sử dụng 121 ngày không làm thay đổi đáng kể chức [34] Ngoài ra, nghiên cứu khác Vollala cộng cho thấy việc sử dụng BME chuột sơ sinh có tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian dù thời gian sử dụng tuần hay kéo dài lên đến tuần [56] Vì vậy, giả thuyết đề tác dụng cải thiện khả ghi nhớ, nhận thức liên quan đến không gian BME phụ thuộc vào độ tuổi đối tượng chuột sử dụng hiệu với chuột chưa trưởng thành Để kiểm chứng giả thuyết này, thử nghiệm tiếp tục tiến hành chuột tuần tuổi chuột tuần tuổi, sử dụng BME đường uống với liều 50 mg/kg ngày vòng ngày Kết cho thấy chuột tuần tuổi (chưa trưởng thành), lô sử dụng BME dành nhiều thời gian khám phá cánh so với lô chứng thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (p < 0,05) Ngược lại, chuột tuần tuổi (trưởng thành) lại không cho thấy khác biệt tỉ lệ thời gian khám phá cánh lô dùng BME lô chứng (p > 0,05) Điều chứng tỏ BME thể tác dụng cải thiện trí nhớ liên quan đến khơng gian sử dụng đối tượng chuột chưa trưởng thành Đặc biệt, sử dụng chuột tuần tuổi, tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian BME trì sau tuần kể từ ngày ngưng sử dụng BME Kết cho thấy việc sử dụng BME giai đoạn vị thành niên tạo cải thiện dài hạn lên chức ghi nhớ, nhận thức chuột Nguyên nhân dẫn đến tác dụng cải thiện trí nhớ, nhận thức sử dụng BME khoảng thời gian dài, thể không thay đổi thời gian chuột khám phá cánh lơ sử dụng BME vịng tuần so với lơ chứng chưa giải thích, nhiên, khả độc tính BME loại trừ nhiều nghiên cứu giới chứng minh BME sử dụng đường uống chuột thường khơng gây độc tính Nghiên cứu Allan cộng sử dụng BME liều 50 mg/kg vòng 30 ngày khơng gây tử vong hay tác dụng không mong muốn liên quan đến thuốc [4] 4.3.2 Đánh giá tác dụng tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh thơng qua phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Kết từ thí nghiệm nhuộm hóa mơ miễn dịch cho thấy việc sử dụng BME với liều 50 mg/kg ngày vòng ngày giúp làm tăng số lượng tế bào gốc phân chia, thể tăng số lượng tế bào dương tính với BrdU lớp tế bào hạt, vùng 34 cận tế bào hạt toàn vùng hồi thùy hải mã (p < 0,05 so sánh với lơ chứng) Điều chứng tỏ BME có tác dụng thúc đẩy tăng sinh tế bào gốc thần kinh hồi thùy hải mã Ngoài ra, thí nghiệm thực vào ngày thứ 28 cho thấy tác dụng đẩy mạnh phát sinh thần kinh BME tác dụng dài hạn, mà BME làm tăng cường q trình biệt hóa tế bào gốc thần kinh sinh thành tế bào thần kinh trưởng thành sau tuần kể từ ngày ngừng sử dụng thuốc, thể qua tăng khoảng lần số lượng tế bào dương tính với BrdU NeuN hồi thùy hải mã lô sử dụng BME so với lô chứng (p < 0,05) Thùy hải mã số khu vực não mà phát sinh thần kinh diễn sau sinh tiếp diễn tuổi trưởng thành Rất nhiều nghiên cứu giới chứng minh phát sinh thần kinh thùy hải mã đóng vai trị quan trọng chức sinh lý ghi nhớ, nhận thức Ở Việt Nam, nghiên cứu tác giả Phạm Thị Nguyệt Hằng sử dụng mơ hình gây độc tế bào thần kinh chuột trimethyltin BME có tác dụng cải thiện khả ghi nhớ chuột nhờ chế bảo vệ tế bào thần kinh đồng thời, làm tăng cường phát sinh thần kinh thùy hải mã [42] Kết nghiên cứu chứng minh BME có tác dụng thúc đẩy trình tăng sinh tế bào gốc thần kinh biệt hóa tế bào gốc thành tế bào thần kinh trưởng thành thùy hải mã chuột nhắt chưa trưởng thành Điều gợi ý BME có khả đẩy mạnh phát sinh thần kinh, từ tạo cải thiện khả ghi nhớ, nhận thức chuột thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến Quá trình phát sinh thần kinh chứng minh có liên quan đến đường tín hiệu thần kinh Con đường tín hiệu chuỗi phản ứng phân tử hóa học xảy bên tế bào nhằm kiểm soát trình phát triển tế bào, bao gồm tăng sinh, biệt hóa hay chết tế bào Cơ chế phân tử tạo nên tác dụng thúc đẩy trình tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh BME chuột nhắt chưa trưởng thành khỏe mạnh đến chưa khai thác rõ Tuy nhiên, thí nghiệm in vitro ni cấy lát cắt thùy hải mã tác giả Lê Thị Xoan cộng năm 2015, sử dụng mơ hình gây tổn thương tế bào thần kinh cách tạo thiếu hụt oxy glucose cho tế bào (OGD) chứng minh hoạt chất bacopasid I có BME có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh thông qua việc thúc đẩy dẫn truyền qua đường tín hiệu PKC PI3K/Akt [29] Mặt khác, số nghiên cứu giới đẩy mạnh, kích hoạt đường tín hiệu PI3K/Akt dẫn đến tăng cường q trình tăng sinh biệt hóa tế 35 bào thần kinh thùy hải mã não chuột [21] Những chứng gợi ý chế phân tử tạo nên tác dụng thúc đẩy phát sinh thần kinh BME chuột nhắt trắng chưa trưởng thành có liên quan đến đường tín hiệu PI3K/Akt Tuy vậy, để kiểm chứng giả thuyết này, cần có nghiên cứu sâu tác dụng BME lên đường tín hiệu thần kinh chuột chưa trưởng thành, từ xác định chế phân tử qua BME thể tác dụng đối tượng Ở tuổi vị thành niên, trình phát sinh thần kinh diễn mạnh mẽ nhiều so với độ tuổi trưởng thành [15] Do đó, giai đoạn mà não nhạy cảm dễ bị tổn thương yếu tố cơng, từ dẫn đến rối loạn, bất thường lâu dài ghi nhớ, nhận thức Tuy nhiên, phát sinh thần kinh diễn mạnh mẽ tuổi vị thành niên gợi ý giai đoạn triển vọng để thực biện pháp can thiệp, thúc đẩy phát triển não nhằm chủ động nâng cao chức não phòng ngừa tổn thương xảy đến Kết nghiên cứu cho thấy BME sử dụng đối tượng chuột nhắt chưa trưởng thành giúp đẩy mạnh phát sinh thần kinh không giai đoạn vị thành niên mà đặc biệt, tác dụng tiếp tục kéo dài đến chuột bước vào độ tuổi trưởng thành Kết góp phần củng cố cho ý tưởng sử dụng BME giai đoạn vị thành niên có khả dự phòng tổn thương não rối loạn, bệnh lý liên quan đến suy giảm trí nhớ, nhận thức 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết đạt được, rút kết luận sau: - BME sử dụng với liều 50 mg/kg vịng ngày có tác dụng cải thiện trí nhớ chuột nhắt trắng chưa trưởng thành, kết luận dựa việc đánh giá hành vi chuột thông qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến - BME sử dụng với liều 50 mg/kg vịng ngày có tác dụng thúc đẩy phát sinh thần kinh, bao gồm trình tăng sinh biệt hóa tế bào thần kinh hồi thùy hãi mã chuột nhắt trắng chưa trưởng thành Đây yếu tố quan trọng chế cải thiện trí nhớ Rau đắng biển chuột nhắt trắng chưa trưởng thành KIẾN NGHỊ Để tìm hiểu sâu tác dụng chế tác dụng Rau đắng biển chức ghi nhớ/nhận thức chuột nhắt chưa trưởng thành nhằm mở rộng ứng dụng đề tài, xin đưa số đề xuất cho hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu sâu thành phần hóa học Rau đắng biển để xác định thành phần thể tác dụng cải thiện trí nhớ thúc đẩy tăng sinh, biệt hóa tế bào thần kinh Rau đắng biển đối tượng chuột nhắt chưa trưởng thành - Nghiên cứu, xác định chế phân tử qua Rau đắng biển thể tác dụng thúc đẩy trình phát sinh thần kinh chuột nhắt chưa trưởng thành 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung (2003), Cây Thuốc Động Vật Làm Thuốc (Tập II), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.668-670 Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, tr.761-762 Trường Đại học Y Hà Nội (2005), Sinh lý học (Tập II), Nhà xuất Y học, tr.356 Tiếng Anh Allan J Joshua, Damodaran A, et al (2007), "Safety evaluation of a standardized phytochemical composition extracted from Bacopa monnieri in Sprague–Dawley rats", Food and Chemical Toxicology, 45(10), pp.1928-1937 Baumrind Diana (1987), "A developmental perspective on adolescent risk taking in contemporary America", New directions for child and adolescent development, 1987(37), pp.93-125 Bhattacharya SK, Bhattacharya A, et al (2000), "Antioxidant activity of Bacopa monniera in rat frontal cortex, striatum and hippocampus", Phytotherapy Research, 14(3), pp.174-179 Bhattacharya SK, Ghosal S (1998), "Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera: an experimental study", Phytomedicine, 5(2), pp.77-82 Brown Sandra A, Tapert Susan F, et al (2000), "Neurocognitive functioning of adolescents: Effects of protracted alcohol use", Alcoholism: clinical and experimental research, 24(2), pp.164-171 Buchanan Christy M, Eccles Jacquelynne S, et al (1992), "Are adolescents the victims of raging hormones? Evidence for activational effects of hormones on moods and behavior at adolescence", Psychological bulletin, 111(1), pp.62 10 Cameron Heather A, Mckay Ronald DG (2001), "Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus", Journal of Comparative Neurology, 435(4), pp.406-417 11 Chakravarty Ajit K, Sarkar Tapas, et al (2001), "Bacopaside I and II: two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 58(4), pp.553-556 12 Chakravarty Ajit Kumar, Garai Saraswati, et al (2003), "Bacopasides III—V: Three new triterpenoid glycosides from Bacopa monniera", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 51(2), pp.215-217 13 Cognato Giana de P, Bortolotto Josiane W, et al (2012), "Y-Maze memory task in zebrafish (Danio rerio): the role of glutamatergic and cholinergic systems on the acquisition and consolidation periods", Neurobiology of learning and memory, 98(4), pp.321-328 14 Couillard‐Despres Sebastien Winner Beate (2005), "Doublecortin expression levels in adult brain reflect neurogenesis", European Journal of Neuroscience, 21(1), pp.1-14 15 Cowen Daniel S, Takase Luiz F, et al (2008), "Age-dependent decline in hippocampal neurogenesis is not altered by chronic treatment with fluoxetine", Brain research, 1228, pp.14-19 16 Crews Fulton T, Mdzinarishvili A, et al (2006), "Neurogenesis in adolescent brain is potently inhibited by ethanol", Neuroscience, 137(2), pp.437-445 17 de Quervain Dominique J-F, Roozendaal Benno, et al (1998), "Stress and glucocorticoids impair retrieval of long-term spatial memory", Nature, pp 18 Drapeau Elodie, Mayo Willy, et al (2003), "Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis", Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(24), pp.14385-14390 19 Eiland Lisa, Romeo Russell D (2013), "Stress and the developing adolescent brain", Neuroscience, 249, pp.162-171 20 Garai Saraswati, Mahato Shashi B, et al (1996), "Dammarane-type triterpenoid saponins from Bacopa monniera", Phytochemistry, 42(3), pp.815-820 21 Garza Jacob C, Guo Ming, et al (2008), "Leptin increases adult hippocampal neurogenesis in vivo and in vitro", Journal of Biological Chemistry, 283(26), pp.18238-18247 22 Gould Elizabeth, Tanapat Patima, et al (1998), "Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress", Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(6), pp.3168-3171 23 He Jun, Crews Fulton T (2007), "Neurogenesis decreases during brain maturation from adolescence to adulthood", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 86(2), pp.327-333 24 Hou Chia-Chung, Lin Shwu-Jiuan, et al (2002), "Bacopaside III, bacopasaponin G, and bacopasides A, B, and C from Bacopa monniera", Journal of natural products, 65(12), pp.1759-1763 25 Isgor Ceylan, Kabbaj Mohamed, et al (2004), "Delayed effects of chronic variable stress during peripubertal‐juvenile period on hippocampal morphology and on cognitive and stress axis functions in rats", Hippocampus, 14(5), pp.636648 26 Kempermann G, Gage FH (2002), "Genetic determinants of adult hippocampal neurogenesis correlate with acquisition, but not probe trial performance, in the water maze task", European Journal of Neuroscience, 16(1), pp.129-136 27 Kempermann Gerd, Kuhn H Georg, et al (1997), "More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment", Nature, 386(6624), pp.493-495 28 Larson Reed W, Gillman Sally A, et al (1997), "Divergent experiences of family leisure: Fathers, mothers, and young adolescents", Journal of Leisure research, 29(1), pp.78-97 29 Le Xoan Thi, Pham Hang Thi Nguyet, et al (2015), "Protective effects of Bacopa monnieri on ischemia-induced cognitive deficits in mice: the possible contribution of bacopaside I and underlying mechanism", Journal of ethnopharmacology, 164, pp.37-45 30 Limpeanchob Nanteetip, Jaipan Somkiet, et al (2008), "Neuroprotective effect of Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture", Journal of ethnopharmacology, 120(1), pp.112-117 31 Manganas Louis N, Zhang Xueying, et al (2007), "Magnetic resonance spectroscopy identifies neural progenitor cells in the live human brain", Science, 318(5852), pp.980-985 32 Martis Gladys, Rao A, et al (1992), "Neuropharmacological activity of Herpestis monniera", Fitoterapia, 43(5), pp.399-404 33 McCormick Cheryl M, Thomas Catherine M, et al (2012), "Social instability stress in adolescent male rats alters hippocampal neurogenesis and produces deficits in spatial location memory in adulthood", Hippocampus, 22(6), pp.13001312 34 Mitra-Ganguli Tora, Kalita Soumik, et al (2017), "A randomized, double-blind study assessing changes in cognitive function in Indian school children receiving a combination of Bacopa monnieri and micronutrient supplementation vs placebo", Frontiers in pharmacology, 8, pp.678 35 Morris Stephanie A, Eaves David W, et al (2010), "Alcohol inhibition of neurogenesis: a mechanism of hippocampal neurodegeneration in an adolescent alcohol abuse model", Hippocampus, 20(5), pp.596-607 36 Nixon Kimberly, Morris Stephanie A, et al (2010), "Roles of neural stem cells and adult neurogenesis in adolescent alcohol use disorders", Alcohol, 44(1), pp.39-56 37 O’Malley Patrick M, Johnston Lloyd D, et al (1998), "Alcohol use among adolescents", Alcohol health and research world, 22(2), pp.85 38 Osborne Guy L, Butler Arthur C (1983), "Enduring effects of periadolescent alcohol exposure on passive avoidance performance in rats", Physiological Psychology, 11(3), pp.205-208 39 Paulose CS, Chathu Finla, et al (2008), "Neuroprotective role of Bacopa monnieri extract in epilepsy and effect of glucose supplementation during hypoxia: glutamate receptor gene expression", Neurochemical Research, 33(9), pp.1663-1671 40 Paxinos George, Franklin Keith BJ (2019), Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic coordinates, Academic press, pp 41 Petersen Anne C, Silbereisen Rainer K, et al (1996), "Adolescent development: A global perspective", Social problems and social contexts in adolescence, pp.337 42 Pham Hang Thi Nguyet, Phan Sinh Viet, et al (2019), "Bacopa monnieri (L.) Ameliorates Cognitive Deficits Caused in a Trimethyltin-Induced Neurotoxicity Model Mice", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 42(8), pp.1384-1393 43 Preilowski B (2009), "Remembering an amnesic patient (and half a century of memory research)", Fortschritte der Neurologie-Psychiatrie, 77(10), pp.568576 44 Ramos-Vara JA, Miller MA (2014), "When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry—the red, brown, and blue technique", Veterinary pathology, 51(1), pp.42-87 45 Rastogi Subha, Pal Raghwendra, et al (1994), "Bacoside A3 A triterpenoid saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 36(1), pp.133-137 46 Roodenrys Steven, Booth Dianne, et al (2002), "Chronic effects of Brahmi (Bacopa monnieri) on human memory", Neuropsychopharmacology, 27(2), pp.279-281 47 Sairam K, Dorababu M, et al (2002), "Antidepressant activity of standardized extract of Bacopa monniera in experimental models of depression in rats", Phytomedicine, 9(3), pp.207-211 48 Shanmugasundaram ERB, Akbar GK Mohammed, et al (1991), "Brahmighritham, an Ayurvedic herbal formula for the control of epilepsy", Journal of ethnopharmacology, 33(3), pp.269-276 49 Singh HK, Dhawan BN (1997), "Neuropsychopharmacological effects of the Ayurvedic nootropic Bacopa monniera Linn.(Brahmi)", Indian Journal of Pharmacology, 29(5), pp.359 50 Spear Linda P (2000), "The adolescent brain and age-related behavioral manifestations", Neuroscience & biobehavioral reviews, 24(4), pp.417-463 51 Spear Linda Patia, Brake Stephen C (1983), "Periadolescence: age‐dependent behavior and psychopharmacological responsivity in rats", Developmental Psychobiology: The Journal of the International Society for Developmental Psychobiology, 16(2), pp.83-109 52 Stough Con, Lloyd J, et al (2001), "The chronic effects of an extract of Bacopa monniera (Brahmi) on cognitive function in healthy human subjects", Psychopharmacology, 156(4), pp.481-484 53 Taffe Michael A, Kotzebue Roxanne W, et al (2010), "Long-lasting reduction in hippocampal neurogenesis by alcohol consumption in adolescent nonhuman primates", Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(24), pp.1110411109 54 Tripathi Yamini B, Chaurasia Savitha, et al (1996), "Bacopa monniera Linn as an antioxidant: mechanism of action", Indian Journal of Experimental Biology, 34(6), pp.523-526 55 Vollala Venkata Ramana, Upadhya Subramanya, et al (2010), "Effect of Bacopa monniera Linn.(brahmi) extract on learning and memory in rats: A behavioral study", Journal of Veterinary Behavior, 5(2), pp.69-74 56 Vollala VR, Upadhya S, et al (2011), "Learning and memory-enhancing effect of Bacopa monniera in neonatal rats", Bratislavske lekarske listy, 112(12), pp.663-669 57 Watanabe Yoshifumi, Gould Elizabeth, et al (1992), "Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons", Brain research, 588(2), pp.341-345 58 Yamada Marina, Hayashida Miki, et al (2011), "Ameliorative effects of yokukansan on learning and memory deficits in olfactory bulbectomized mice", Journal of ethnopharmacology, 135(3), pp.737-746 59 Yoneyama Masanori, Tanaka Masayuki, et al (2015), "Beneficial effect of cilostazol‐mediated neuronal repair following trimethyltin‐induced neuronal loss in the dentate gyrus", Journal of neuroscience research, 93(1), pp.56-66 60 Vega Julian Tadeo Felipe (2018), "Circuito bulbo olfatório-hipocampo dorsal e seus impactos na memória social de longa duraỗóo", pp 61 Das Amitava, Shanker Girja, et al (2002), "A comparative study in rodents of standardized extracts of Bacopa monniera and Ginkgo biloba: anticholinesterase and cognitive enhancing activities", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 73(4), pp.893-900 62 Vohora Divya, Pal SN, et al (2000), "Protection from phenytoin-induced cognitive deficit by Bacopa monniera, a reputed Indian nootropic plant", Journal of ethnopharmacology, 71(3), pp.383-390 ... giảm trí nhớ, đề tài ? ?Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) chuột nhắt trắng chưa trưởng thành? ?? thực với hai mục tiêu sau: Nghiên cứu tác dụng cải thiện. .. trọng chế cải thiện trí nhớ Rau đắng biển chuột nhắt trắng chưa trưởng thành KIẾN NGHỊ Để tìm hiểu sâu tác dụng chế tác dụng Rau đắng biển chức ghi nhớ/ nhận thức chuột nhắt chưa trưởng thành nhằm... NGUYỄN HOÀNG MAI MÃ SINH VIÊN: 1501315 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI (L) WETTST) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG CHƯA TRƯỞNG THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người