Đang tải... (xem toàn văn)
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN RỄ LOÀI NGHỆ TRẮNG (CURCUMA SP.) Ở QUẢNG NGÃI VIỆT NAM LUẬN VĂN KHOA HỌC HÓA HỌC .................................................................................................................... tôi chọn đề tài: Nghiên cứu thành phần hoá học thân rễ loài nghệ trắng (Curcuma sp.) ở Quảng Ngãi Việt Nam nhằm góp phần vào việc phân loại thực vật dựa trên TPHH, bổ sung thêm những nghiên cứu về chi Curcuma nói riêng và họ Zingiberaceae nói chung. Qua đó góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh của loại nghệ này mà người dân đã sử dụng.
BỘ GIÁ DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN THẠC SI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN RỄ LOÀI NGHỆ TRẮNG (CURCUMA SP.) Ở QUẢNG NGÃI - VIỆT NAM LUẬN VĂN KHOA HỌC HÓA HỌC Đà Nẵng năm 20 MỤC LỤC Trang BỘ GIÁ DỤC VÀ ĐÀO TẠO .1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN THẠC SI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN RỄ LOÀI NGHỆ TRẮNG (CURCUMA SP.) Ở QUẢNG NGÃI - VIỆT NAM .1 LUẬN VĂN KHOA HỌC HÓA HỌC Đà Nẵng năm 20 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .3 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài .4 Đối tượng và mục đích nghiên cứu Nội dung và phương pháp nghiên cứu Bố cục luận văn .6 Kết và giá trị thực tiễn luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .7 1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae 1.2 Sơ lược tình hình nghiên cứu mặt hóa học số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu và công dụng loài 1.2.1 Curcuma aromatica Salisb [Nghệ trắng, Uất kim (Trung Quốc), Ngải trắng, Nghệ sùi, Bạch tỵ uất kim] [2], [5],[7], [15], [16] 1.2.3 Curcuma angustifolia Roxb (Nghệ hẹp) 14 1.2.4 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc 14 1.3 Công dụng số chất chiết tách từ nghệ 18 1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học loài Curcuma sp Quảng Ngãi 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 21 2.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật 21 2.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật 21 2.1.2 Thu và xử lý mẫu thực vật 21 2.2 Thu, định lượng, xác định TPHH tinh dầu 21 2.3 Phương pháp chiết, tách và xác định TPHH dịch chiết từ thân rễ 22 2.4 Phân lập và xác định cấu trúc cấu tử tách .24 2.4.1 Phân lập cấu tử 24 2.4.2 Xác định cấu trúc cấu tử tách 25 2.5 Thử hoạt tính sinh học 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Xác định tên khoa học 27 3.2 Tinh dầu thân rễ Nghệ trắng Quảng Ngãi 28 3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu 28 3.2.2 TPHH tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng thu phương pháp chưng cất 28 3.2 TPHH dịch chiết n-hexan thân rễ nghệ trắng .30 3.3 TPHH dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng 33 3.4 Xác định cấu trúc cấu tử tách .34 3.6 Kết thử hoạt tính sinh học ( xem P2, P3 phụ lục) .39 KẾT LUẬN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu C 13 C- NMR H- NMR CTCT CTPT Dm GC GC/MS HPLC MS SKBM SKC TD TPHH TV Tên gọi Curcuma Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Công thức cấu tạo Công thức phân tử Dung mơi Sắc ký khí Sắc ký khí ghép khối phổ Sắc khí lỏng hiệu cao Phổ khối lượng Sắc ký mỏng Sắc ký cột Tinh dầu Thành phần hóa học Thực vật MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hóa học hợp chất thiên nhiên nói chung và hóa học hợp chất tách từ thực vật nói riêng là lĩnh vực thu hút quan tâm nhà Hóa học hữu mà cịn hấp dẫn nhà Dược học, Nông học, Sinh thái học, Môi trường học Trong thảm thực vật đa dạng và phong phú bốn mùa xanh tốt thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa nước ta dược liệu và có tinh dầu dồi dào và có giá trị cao Nguồn tài nguyên quý giá này cần điều tra, nghiên cứu để tạo sở khoa học cho việc sử dụng cách hợp lý và có hiệu Họ Zingiberaceae là thảo dược khơng có độc tính, sử dụng làm gia vị cho nhiều ăn và làm dược liệu điều trị nhiều bệnh Phần lớn chúng cho tinh dầu có mùi thơm, số dùng làm chất thơm hương liệu, mỹ phẩm Ở nước ta Gừng, Riềng và Nghệ là loài cỏ quen thuộc gắn bó với đời sống hàng ngày Chi Nghệ (Curcuma) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là chi có nhiều thuốc có giá trị, là phổ biến nước ta, chúng mọc hoang nhiều nơi, số loài trồng phổ biến để dùng làm gia vị, làm thuốc nhuộm màu và chất chống oxi hóa cho thực phẩm và là vị thuốc dân tộc chữa bệnh gan, mật và đường tiêu hóa Các cơng trình nghiên cứu gần cho thấy nghệ tác dụng tốt tới nhiều hệ thống quan thể chống oxy hóa, điều trị khối u, ung thư, HIV, chống dị ứng, chống thụ thai, có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương chống viêm nhiễm, chữa viêm loét dày, hành tá tràng, ăn không tiêu, nôn mửa, ho Ở địa phương, loài nghệ trắng chủ yếu dùng để chữa vết thương ( giúp mau lành da, liền sẹo), chữa đau bụng, đau dày mà chưa tận dụng, phát huy hết công dụng, ích lợi từ nghệ Theo biết, giới Việt Nam có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu thành phần hóa học (TPHH) và cơng dụng nhiều loài nghệ nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng loài Các nghiên cứu cho thấy loại cây, vùng đất thành phần, hàm lượng là khác và ứng dụng khác Tuy nhiên nghiên cứu loài nghệ TPHH, công dụng số lượng loài nghệ cịn chưa đầy đủ và khơng đồng số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu và rộng loài nghệ có nước, chúng tơi chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hoá học thân rễ loài nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi - Việt Nam" nhằm góp phần vào việc phân loại thực vật dựa TPHH, bổ sung thêm nghiên cứu chi Curcuma nói riêng và họ Zingiberaceae nói chung Qua góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh loại nghệ này mà người dân sử dụng Đối tượng và mục đích nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Tinh dầu và dịch chiết từ thân rễ nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi - Mục đích nghiên cứu: Xác định TPHH tinh dầu và dịch chiết từ thân rễ, phân lập và xác định cấu trúc đến hai cấu tử dịch chiết từ thân rễ nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi, thử hoạt tính sinh học dịch chiết và cấu tử tách Nội dung và phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu: - Xác định tên khoa học loài nghệ trắng Quảng Ngãi - Xác định TPHH tinh dầu bay thân rễ nghệ trắng - Xác định TPHH dịch chiết n-hexan từ thân rễ nghệ trắng - Xác định TPHH dịch chiết etylaxetat từ thân rễ nghệ trắng - Thử hoạt tính sinh học số dịch chiết và cấu tử tách số chủng vi khuẩn - Phân lập và xác định cấu trúc cấu tử từ dịch chiết thân rễ nghệ trắng số dung môi hữu * Phương pháp nghiên cứu: - Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp tách biệt hợp chất tự nhiên, tổng quan tài liệu đặc điểm thực vật, xác định TPHH, công dụng số thuộc chi Nghệ (Curcuma) họ Gừng (Zingiberaceae) - Tách tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước - Xác định TPHH tinh dầu sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC/MS) - Thu dịch chiết sau: + Xử lí mẫu: từ thân rễ tươi gọt vỏ, rửa đem xay, lọc, ép + Sử dụng dung mơi hữu có độ phân cực khác để chiết - Xác định TPHH dịch chiết n-hexan GC/MS - Phân lập cấu tử từ dịch chiết phương pháp sắc ký mỏng (SKBM), sắc ký cột (SKC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), phương pháp kết tinh lại - Xác định cấu trúc cấu tử tách phương pháp phổ: MS, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC, NEOSY Bố cục luận văn - Luận văn gồm 42 trang, có bảng và 11 hình - Ngoài phần mục lục (2 trang), kí hiệu chữ viết tắt (1 trang), bảng biểu hình ảnh (13 trang), phần mở đầu (3 trang), kết luận (2 trang) và tài liệu tham khảo (3 trang, gồm 26 tài liệu), nội dung luận văn chia làm chương: + Chương 1: Tổng quan tài liệu (13 trang) + Chương 2: Thực nghiệm (6 trang) + Chương 3: Kết nghiên cứu và thảo luận (12 trang) Kết và giá trị thực tiễn luận văn Từ kết nghiên cứu, luận văn thu số kết với đóng góp thiết thực sau: - Xác định tên khoa học loài nghệ trắng Quảng Ngãi là Curcuma aromatica Salisb - Xác định hàm lượng tinh dầu và TPHH tinh dầu - Xác định TPHH dịch chiết từ thân rễ dung môi n-hexan, etylaxetat - Tách và xác định cấu trúc hợp chất từ dịch chiết thân rễ nghệ trắng dm: n-hexan - Nghiên cứu hoạt tính sinh học cao n-hexan, cao butanol từ thấy cơng dụng chúng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae Theo tài liệu [7], chi Curcuma gồm tới 40 loài vùng nhiệt đới châu Á, nước ta có 16 loài Theo tài liệu [6], [9] Việt Nam và nước Đơng Dương chi Curcuma gồm 19 loài Theo tài liệu [24] chi Curcuma có đến 97 loài Theo tài liệu [22] chi Curcuma Bangladesh có từ 16-20 loài; Trung Quốc, Ấn Độ và Đơng Dương có từ 20-25 loài, Malaysia có từ 20-30 loài, Nepal có từ 10-15 loài, Philipin có từ 12-15 loài, Thái Lan có từ 30-40 loài và giới có từ 7080 loài Do nhìn chung chưa có thống tài liệu số lượng loài chi Curcuma Curcuma - tiếng Ả Rập là kurkum: nghệ tây, màu vàng nghệ Đặc điểm thực vật chung chi Curcuma, chúng là loài thảo có thân rễ dạng củ, nạc, phân nhánh, có thịt thường có màu, mang củ cuối rễ, có là thân rễ yếu, khơng có rễ phình cuối Lá xếp hai dãy, có cuống có bẹ, phiến hình dải, hình giáo hay trái xoan, hình tim gốc nhiều hay ít, màu lục nhạt, toàn có dạng chuối hoa Cán hoa có gốc, tách biệt với thân có Cụm hoa là bơng mọc đứng, hình trụ, tạo thành bắc lõm xếp sít nhau, thường màu lục, nách bắc có hoa mau tàn, màu vàng hay hồng, có nằm thụt bắc Đài hình ống có răng, tràng hình ống, loe đỉnh, với thùy với môi to trải ra, nhị với nhị dạng cánh, với bao phấn có sừng mảnh và dài Ở bông, bắc bất thụ lại có màu, thường là vàng, hồng đỏ tùy loài Cánh môi thường rộng và ngắn Bầu ô, noãn nhiều, nhụy lép 2, với nhụy dạng sợi, đầu nhụy dạng chén Quả nang có vỏ mỏng, hạt nhiều, có áo hạt 1.2 Sơ lược tình hình nghiên cứu mặt hóa học số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu và công dụng loài Theo chúng tơi biết có nhiều cơng trình nghiên cứu nhiều tác giả nước và giới TPHH và công dụng loài nghệ Các cơng trình nghiên cứu cho thấy TPHH tinh dầu loại nghệ chủ yếu là sesquiterpen và dẫn xuất chúng, monoterpen chiếm phần nhỏ nhiều [12] Dưới đây, tổng hợp đặc điểm thực vật, số kết nghiên cứu TPHH và phương pháp nghiên cứu công dụng số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Curcuma aromatica Salisb [Nghệ trắng, Uất kim (Trung Quốc), Ngải trắng, Nghệ sùi, Bạch tỵ uất kim] [2], [5],[7], [15], [16] * Đặc điểm thực vật Cây thảo cao đến 1m, có thân rễ to và củ hình trụ, toả hình bàn tay, màu vàng và thơm Lá thn hình mũi mác rộng, có lơng nhung mặt dưới, dài 30-60cm, rộng 10-20cm; cuống ngắn, bẹ ôm lấy và tạo thành thân Cán hoa mọc từ rễ, bên cạnh và thường xuất trước lá, dài tới 20cm Cụm hoa hình trụ, dày hoa, dài tới 20cm, rộng 7cm; bắc màu lục, lợp lên nhau, kèm theo 3-4 hoa liên tiếp, hình mũi mác - trái xoan; bắc không sinh sản, màu hồng hồng Phân bố Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia Ở nước ta, mọc hoang và trồng vườn gia đình vùng núi Cây mọc tán rừng, hoa vào tháng 4-6 [7] * Về mặt hóa học Theo tác giả Lương Sĩ Bỉnh, tinh dầu thân rễ Curcuma aromatica Salisb Việt Nam phân tích GC/MS kết thu được: 1,8–cineol (1,55%); terpinolen (2,12%), β–elemen (1,52%), humulen (2,56%), curzerenon (38,78%), germacron (11,22%)… [1], [15] TPHH phần chiết ete dầu hỏa (petroleum ether) và etyl axetat thân rễ nghệ trắng thu hoạch tháng 11 năm 1996 Sóc Sơn, Hà Nội theo tài liệu [9] cho thấy chủ yếu là sesquiterpenoic, thành phần có hàm lượng lớn là sesquiterpenoic có khung germacran Ở phần chiết ete dầu hỏa định danh 20 cấu tử, cấu tử furanodien (4,7%), furanodienon và curzerenon (30,7%), (E,E)-germacron (8,2%), neocurdion (5,0%), zederon (6,2%) Ở phần chiết etyl axetat định danh 15 cấu tử cấu tử gồm furanodien (4,7%), furanodienon và curzerenon (20,7%), (E,E)-germacron (4,2%), neocurdion (3,0%), zederon (14,9%) Các cấu tử tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb trồng Nhật Bản và Ấn Độ phân tích phương pháp GC và GC/MS Các loại tinh dầu này khác hẳn Các cấu tử tinh dầu Nhật Bản là curdion, germacron, 1,8-cineol, (45,5S)-germacron-4,5-epoxid, β-elemen và linalool Trong cấu tử tinh dầu Ấn Độ là β-curcumen, ar-curcumen, xanthorhizol, germacron, campho và curzerenon [10] Thành phần tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb mọc Thái Lan là camphor (26,94%), α-curcumen (23,18%) và xanthorhizol (18,70%) [17] Các hợp chất có tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb Indonesia gồm α -curcumen (18,6%), β-curcumen (25,5%), xanthorhizol (25,7%) [7] * Công dụng Nghệ trắng có tác dụng làm liền sẹo, chữa trị vết thương, vết bỏng và bệnh dày, hệ tiêu hóa tương tự nghệ vàng Trong dân gian, thân rễ Curcuma aromatica Salisb dùng phối hợp với loài nghệ khác làm thuốc điều kinh, chữa tê thấp; thường ngâm rượu với số loại nghệ khác để xoa bóp chữa thấp khớp Người ta ăn nghệ trắng trộn với mật ong đường để điều trị bệnh tim mạch, điều hòa nhịp tim Ở Trung Quốc, thân rễ nghệ trắng dùng để trị bệnh tức ngực, trướng bụng, nôn máu, chảy máu cam, tiểu tiện máu, viêm gan mạn, xơ gan, hoàng đản, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh và động kinh Ở Nhật Bản, thân rễ dùng làm thuốc để tăng tiết mật, kích thích tiêu hóa 1.2.2 Curcuma aeruginosa Roxb (Nghệ xanh, Nghệ ten đồng, Nga truật (Trung Quốc), zédoaire (Pháp), zedoray (Anh) ) [6], [8] * Đặc điểm thực vật Cây thảo cao đến 2m Thân rễ to, hình trái xoan, phân nhánh, màu lục xám Lá hình giáo rộng, khơng lông, dài 30-70cm hơn, rộng 9-13cm, dọc theo gân có dải màu đỏ nhạt; bẹ dài khơng lơng; khơng có cuống hoa Cán hoa bên; bơng hình trụ, chóp màu hồng đẹp 3.2 TPHH dịch chiết n-hexan thân rễ nghệ trắng * Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng thấy xuất 13 cấu tử, gồm Camphor (1.560%), delta.1-Testosterone (45.218%), β- Elemene (5.970%), Borneol (1.423%), Germacrene B (1.889%), Germacron (2.722%), Longiverbenone (12.988%); Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropenyl, trans-(20.028%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1-Testosterone Bảng 3.3 TPHH dịch chiết n - hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu Tỷ lệ % 11,282 1.560 11,552 1.423 15,020 1.056 15,918 5.970 16,450 1.673 16,574 1.889 17,614 1.414 17,718 20.028 10 11 12 20,081 22,578 24,548 25,627 45.218 2.722 12.988 1.793 Cấu tử (1R,4R)-(+)Camphor Borneol δ-Elemene β- Elemene α-Bisabolene Germacrene B (+)-β-Selinene Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6dimethyl-5-isopropenyl, trans.delta.1-Testosterone Germacron Longiverbenone Acetic acid, 6-(1-hydroxymethyl-vinyl)-4,8adimethyl-3-oxo-1,2,3,5,6,7,8,8a- 13 25,691 2.266 octahydronaphthalen-2-yl-ester Pyrano[4,3-a]phenanthren-8-ol-3-one, 1,4,4a,4b,5,6,7,8,9,9a,9b,10,11,11a-tetradecahydro10a,12a-dimethyl-1-[3-furanyl] Hình 3.3 sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n - hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng * Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n - hexan bã thân rễ nghệ trắng thấy xuất 14 cấu tử, gồm (-)-.beta.-Elemene (11.462%), Camphor (2.283%), delta.1-Testosterone (31.360%), Longiverbenone (17.978%), delta.-Elemene (3.596%), Germacrene D (4.243%); Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5isopropenyl-,trans (14.186%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1-Testosterone Bảng 3.4 TPHH dịch chiết n - hexan từ bã thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu Tỷ lệ % 11.283 2.283 11.553 2.162 11.750 1.177 15.022 3.596 10 15.919 16.439 16.576 17.496 17.616 17.720 11.462 2.258 1.029 4.243 2.432 14.186 11 12 13 14 19.082 20.084 22.583 24.550 2.534 31.360 3.301 17.978 Cấu tử (+)-Camphor Isoborneol Borneol, (1S,2R,4S)-(-)Delta.-Elemene or 3-Isopropenyl-1-isopropyl-4methyl-4-vinyl-1-cyclohexan (-)-.beta.-Elemene Beta.-Caryophyllen Germacrene B Germacrene D Eudesma-4(14),11-diene Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6dimethyl-5-isopropenyl-,trans gamma.-Elemene Delta.1-Testosterone Germacrone Longiverbenone Hình 3.4 Sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan từ bã thân rễ nghệ trắng *Nhận xét: Trong TPHH dịch chiết n- hexan từ bã thân rễ nghệ trắng thấy xuất cấu tử delta.1-Testosterone với hàm lượng lớn Trong thể sống, lượng nhỏ delta.1-Testosterone có khả kích thích tăng trưởng tuyến tiền liệt, túi tinh .delta.1-Testosterone làm tăng trọng lượng gan [32] 3.3 TPHH dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng thấy xuất cấu tử, gồm 3-cyclopentene-1-acetaldehyde-2,2,3-trimetyl (3.06%),.delta.1-testosterone(21.79%),1-heptatriacotanol(4.71%), isovelleral (41.11%), 2-pentanone, 3-benzyliden (3.42%), Germacrone (6.68%), Isolongifolen-5-one (19.23%); Như cấu tử chiếm nhiều là isovelleral Bảng 3.5 Thành phần hóa học dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu 28,324 30,996 33,159 34,983 35,391 37,759 41,832 Tỷ lệ % 3,06 21,79 6,68 4,71 41,11 3,42 19,23 Cấu tử 3-cyclopentene-1-acetaldehyde-2,2,3-trimetyl delta.1-testosterone Germacrone 1-heptatriacotanol Isovelleral 2-pentanone, 3-benzyliden Isolongifolen-5-one Hình 3.5 Sắc ký đồ GC/MS dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng 3.4 Xác định cấu trúc cấu tử tách Cấu tử tách từ dịch chiết n-hexan tưø bã thân rễ nghệ trắng THONG-NT là chất rắn vơ định hình, màu trắng ngà, tan tương đối tốt etyl axetat, tan n-hexan nhiệt độ phịng, tan nhiều n-hexan đun nóng, khơng màu UV 254nm, SKBM cho Rf=0,53 với hệ dm n-hexan: etyl axetat = : 2, với thuốc thử vanilin: MeOH: CH3COOH cho màu vàng nâu Phổ khối ESI-MS (+) cho mảnh ion giả phân tử m/z = 247,2 Các phổ 13C, DEPT 90, 135 cho phép khẳng định phân tử THONG-NT có nhóm metyl δ 10,2; 15,1; 15,7; nhóm metilen δ 24,6; 38,0; 41,9; nhóm metin δ 66,5; 131,2; 138,0 và cacbon bậc IV số có nhóm cacbonyl 192,2 Trong phổ 1H-NMR xuất tín hiệu proton metyl δ 1,34; 1,60; 2,11 và proton nhóm metilen khoảng 1,29-3,75 Ngoài ra, quan sát tín hiệu singlet proton metin 3,81; doublet tù proton olefin 5,48 và singlet khác 7,09 ppm Từ kiện phổ này, khẳng định chất rắn THONG-NT có cơng thức phân tử C15H18O3 Cấu trúc hoàn chỉnh hợp chất xác định dựa việc phân tử liệu phổ 2D-NMR mà chủ yếu là phổ HMBC, COSYGP, NOESY Trong phổ COSY, proton olefin (H-1) có tương tác rõ ràng với proton nhóm metilen (H-2a, 2b) và với proton metyl 1,60 (H-15) Proton metilen 2,52 (H-2a) có tương tác COSY với proton nhóm metilen khác 1,29 (H-3b) Điều này chứng tỏ nhóm metilen liên kết trực tiếp với và liên kết với ngun tử có chứa nối đơi khác theo kiểu –CH2-CH2-CH= Sự có mặt nhóm metin (δ H 3,81 (H-5); δC 66,5 (C-5)) và cacbon bậc IV δC 63,9 (C-4) xác nhận tồn nhóm epoxi phân tử H-5 có tương tác HMBC với C-4 và C-6 nhóm cacbonyl Proton metyl 1,34 (H-14) có tương tác HMBC với C-3, C4, C5 C-14 phải gắn trực tiếp vào C-4 Hai proton metilen 3,70; 3,75 (H-9) có tương tác với cacbon bậc IV 122,2 (C-7); 157,1 (C-8); 131,0 (C-10); cacbon metin 131,2 (C-1) và nhóm metyl 15,7 (C-15) Ngoài proton nhóm metyl H- 15 1,60 có tương tác HMBC với C-1, 8, 9, 10 C-15 phải đính vào C-10 Proton 7,09 (H-12) có tương tác HMBC với C-7, Căn độ dịch chuyển C-8, C-12 và H-12 suy đốn C-8 và C-12 liên kết trực tiếp với nguyên tử O Mặt khác, proton nhóm metyl cuối 2,11 (H-13) liên hệ với C-7, 8, 11, 12 chứng tỏ C-13 phải đính trực tiếp vào C-11 Tương tác COSY, NOESY H-12 và H-13 xác nhận điều này H-1 có tương tác NOESY với H-2, H-15 có tương tác với H-2a, 9b Nhưng H-1 với H-15 khơng có tương tác phổ NOESY chứng tỏ nối đơi C1=C10 có cấu hình (Z) H-5 tương tác NOESY với H-3b H-14 tương tác H-2a cho phép xác định cấu hình nguyên tử cacbon bất đối xứng C4, là (4S, 5R) Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR THONG-NT N0 δaC (ppm) 131,2 (d) 24,6 (t) 38,0 (t) 63,9 (s) 66,5 (d) 192,2 (s) 122,2 (s) 157,1 (s) δbH (ppm) COSY NOESY (H→C) (H→H) H-2a, 2b, (H→H) H-2a, 2b, 5,48 (1H; brd; 11,5 Hz) C-9, 15 2,52 (1H; dq; 3,5; 12 Hz) (H-2a) 2,23 (1H; brd; 12,5 Hz) (H-2b) 2,30 (1H; td; 3,5; 13 Hz) (H-3a) 1,29 (1H; dt; 4; 13,5 Hz) (H-3b) C-1, 3, 10 C-1, 10 C-1, 4, C-2, 14 3,81 (1H; s) C-3, 4, 3,75 (1H; d; 16,5 Hz) (H-9a) HMBC 41,9 (t) 3,70 (1H; t; 16,5 Hz) (H-9b) 10 11 12 131,0 (s) 123,2 (s) 138,0 (d) 7,09 (1H; s) 13 10,2 (q) 2,11 (3H; s) 14 15 15,1 (q) 15,7 (q) 1,34 (3H; s) 1,60 (3H; s) C-1, 7, 8, 10, 15 C-1, 7, 8, 10, 15 C-7, 8, 11 C-7, 8, 11, 12 C-3, 4, C-1, 8, 9, 10 9b, 15 9a, 9b H-1, 2b, 3b H-2b, 14, 15 H-1, 2a H-1, 2a H-3b H-3b H-2a, 3a H-1, 3a, H-3b H-9b, 15 H-1, 9b H-1, 9a, 15 H-1, 9a, 15 H-13 H-13 H-12 H-12 H-1, 9a, 9b H-2a H-2a, 9b a đo CDCl3, 125 MHz; b đo CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội H H H H O H H3C H H C H H O H3 C CH3 O Hình 3.6 Các tương tác HMBC THONG-NT (Zederone) H H H H O H H3C H H H H C O H3C COSY O CH3 NOESY Hình 3.7 Các tương tác COSY, NOESY THONG-NT (Zederone) Ngoài ra, liệu phổ chất rắn THONG-NT phù hợp với liệu phổ Zederone công bố [21] Bảng 3.7 So sánh liệu phổ NMR THONG-NT với ZEDERONE [21] a N0 δ C (ppm) 131,2 (d) 24,6 (t) 38,0 (t) 63,9 (s) 66,5 (d) 192,2 (s) 122,2 (s) 157,1 (s) 41,9 (t) 10 11 12 13 14 15 131,0 (s) 123,2 (s) 138,0 (d) 10,2 (q) 15,1 (q) 15,7 (q) NT4869 ZEDERONE b a δ H (ppm) δ C (ppm) δbH (ppm) 5,48 (1H; brd; 11,5 Hz) 131,4 (d) 5,49 (1H; dd; 12; Hz) 2,52 (1H; dq; 3,5; 12 Hz) (H-2a) 2,53 (1H; m) 24,9 (t) 2,23 (1H; brd; 12,5 Hz) (H-2b) 2,25 (1H; m) 2,30 (1H; td; 3,5; 13 Hz) (H-3a) 2,31 (1H; dt; 13; 3,5 Hz) 38,2 (t) 1,29 (1H; dt; 4; 13,5 Hz) (H-3b) 1,29 (1H; m) 64,2 (s) 3,81 (1H; s) 66,8 (d) 3,81 (1H; s) 192,4 (s) 122,5 (s) 157,3 (s) 3,75 (1H; d; 16,5 Hz) (H-9a) 3,77 (1H; d; 16,0 Hz) 42,1 (t) 3,70 (1H; t; 16,5 Hz) (H-9b) 3,69 (1H; d; 16,0 Hz) 131,3 (s) 123,5 (s) 7,09 (1H; s) 138,3 (d) 7,10 (1H; s) 2,11 (3H; s) 10,5 (q) 2,12 (3H; s) 1,34 (3H; s) 15,4 (q) 1,34 (3H; s) 1,60 (3H; s) 16,0 (q) 1,61 (3H; s) a đo CDCl3, 125 MHz; b đo CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội Kết hợp tất lập luận trên, khẳng định chất rắn phân lập là Zederone O 10 15 12 O 14 O 11 13 Hình 3.8 Cấu trúc chất THONG-NT (Zederone) Kết luận này phù hợp với tài liệu nghiên cứu tác giả Lương Sĩ Bỉnh [1] , [15] và tài liệu nghiên cứu nước ngoài [21] 3.6 Kết thử hoạt tính sinh học ( xem P2, P3 phụ lục) - Các chủng kiểm định hoạt hóa và pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland tiến hành thí nghiệm - Kết đọc sau ủ phiến thí nghiệm tủ ấm 37 oC/24 cho vi khuẩn và 30oC/48 nấm sợi và nấm men Kết dương tính là nồng độ mà khơng có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này môi trường thạch đĩa để kiểm tra có giá trị CFU