Bước đầu nghiên cứu quá trình lên men sản xuất màng cellulose sinh học từ phế phầm xơ mít

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 NGHÀNH: KHOA HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU Q TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT MÀNG CELLULOSE SINH HỌC TỪ PHẾ PHẨM XƠ MÍT THUỘC NHĨM NGÀNH KHOA HỌC: KHOA TÀI NGUN MƠI TRƯỜNG Bình Dương, 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 NGHÀNH: KHOA HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT MÀNG CELLULOSE SINH HỌC TỪ PHẾ PHẨM XƠ MÍT THUỘC NHĨM NGÀNH KHOA HỌC: KHOA TÀI NGUN MƠI TRƯỜNG Sinh viên thực hiện: Trần Thị Thanh Mỷ Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp: C14SH02 khoa: Tài nguyên môi trường Năm thứ: /Số năm đào tạo: Ngành học: Sư phạm sinh học Người hướng dẫn: Ths Phan Văn Thuần Bình Dương, 2016 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: “Bước đầu nghiên cứu trình lên men sản xuất màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ mít” - Sinh viên thực hiện: Lê Thị Trang - Hoàng Thị Thắm - Lê Thị Hà Mỹ - Trần Thị Thanh Mỷ - Lớp: C14SH02 - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường - Năm thứ: - Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: Th.S Phan Văn Thuần Mục tiêu đề tài: - Nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường lên men tạo màng cellulose Tạo màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ mít Tính sáng tạo: - Tận dụng phế phẩm xơ mít làm nguyên liệu để lên men tạo màng cellulose sinh học - Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho q trình lên men tạo màng cellulose sinh học Kết nghiên cứu: Kết thu màng cellulose từ kết nghiên cứu sau: -Đã tiến hành trình phân lập, nhân sinh khối, giữ giống thành công với chủng A xilynum phịng thí nghiệm -Dịch chiết xơ mít bổ sung vào mơi trường lên men nhằm giảm hàm lượng đường glucose tiến tới thay nước dừa, nguyên liệu làm tăng chi phí sản phẩm Kết hợp %V dịch chiết xơ mít nồng độ thích hợp làm tăng hiệu suất tạo màng -Tất môi trường diện dịch chiết xơ mít cho kết tạo màng cellulose, lớn so với môi trường đối chứng không bổ sung dịch chiết xơ mít -Giữa mít thái mít tố nữ, dịch chiết mít thái cho hiệu tạo màng tốt hơn, môi trường tốt MT lên men + 10g/L Glu + 20% dịch chiết, sau ngày lên men thu màng ướt đạt trọng lượng 4.31 g/100ml, màng khơ đạt trọng lượng 0.58g/100ml Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, khả áp dụng đề tài: - Tận dụng hiệu phế phẩm khơng cịn sử dụng giảm tải chất thải môi trường - Giảm chi phí nguyên liệu tạo sản phẩm màng cellulose vi khuẩn - Bước đầu nghiên cứu trình lên men sản xuất màng cellulose vi khuẩn từ phế phẩm xơ mít tiền đề mong đợi vật liệu hóa sinh với ứng dụng có giá trị tiếp tục nghiên cứu Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài: Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (Ký, họ tên) Trần Thị Thanh Mỷ Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài Tôi đánh giá cao kết nghiên cứu đề tài Trong thời gian nghiên cứu nhóm sinh viên làm việc nghiêm túc hoàn thành nội dung lớn Nghiên cứu tỉ lệ % dịch chiết xơ mít lên suất trình tạo màng cellulose Nghiên cứu thời gian thích hợp để thu nhận màng cellulose suất lớn Nghiên cứu trình thu nhận xử lý sản phẩm tốt Tuy kết thu màng cellulose với độ dai, độ kết tinh, hiệu suất chưa cao tiếp tục nghiên cứu Xác nhận lãnh đạo khoa (ký, họ tên) Ngày tháng năm Người hướng dẫn (ký, họ tên) Phan Văn UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Họ tên: TRẦN THỊ THANH MỶ Ảnh Sinh ngày: 25/02/1995 4x6 Nơi sinh: Ninh Thuận Lớp: C14SH02 - Khóa: 2014 - 2017 Khoa: Tài Ngun Mơi Trường Địa liên hệ: 586 Lê Hồng Phong - phường Phú Hòa - TP Thủ Dầu Một - tỉnh Bình Dương Điện thoại: 01677255520 - Email: thanhmy00789@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP * Năm thứ 1: Ngành học: Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học tự nhiên Kết xếp loại học tập: TB Khá * Năm thứ 2: Ngành học : Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết xếp loại học tập: TB Khá Ngày tháng năm Xác nhận lãnh đạo khoa Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH • DANH MỤC BẢNG • DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện ni cấy có khuấy đảo) - A xylinum: Acetobacter xylinum - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants - chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose - cfu: cololy-forming units - khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance - PGI: Phosphoglucoisomerase - PGM: Phosphoglucomutase - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận điều kiện nuôi cấy tĩnh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract - cao nấm men 10 Về thời gian thu nhận màng: ngày, ngày, ngày, ngày Số lần thí nghiệm: loại mít x loại dịch chiết x lần lặp lại x mức % dịch chiết x mức thời gian = 120 lần thí nghiệm Mơi trường Hestrin Schramm (HS) giữ giống (1L): + Nước cất 1L + Glucose 20g/L + Cao nấm men 5g/L + Peptone 5g/L + Na2HPO4 2.7g/L + Acid citric 1.15 g/L + Aga 20 g/L + NaOH dùng chỉnh pH 6.0 + KhSửơ tđrùồn qgu 1y 2t1rìonCh ttrhn ngg 1h5i phút ■ỵ r rx • Ạ • * _•Ạ _ Điều kiện giữ giống: Giữ giống ống thạch nghiêng, nhiệt độ 4oC, cấy chuyền sau 30 ngày Giống Gluconaceto bacter xylinus thạch nghiêng Tăng sinh cấp Môi trường tăng sinh (1Lit): + Nước dừa già 1L + Glucose 20 g/L + (NH4)2SO4 g/L + (NH4)2HPO4 g/L + Acid acetic dùng điều chỉnh pH 5.0 + Khử trùng 121oC 15 phút Ạ _ -ĩ rx • Ạ • * *• _Ạ Điều kiện nuôi cấy: + Nhiệt độ 300C, thời gian tăng sinh ngày + Tỷ lệ giống: 10% + Ni cấy tĩnh, hiếu khí, khơng sục oxy, không ánh sáng Môi trường lên men Môi trường lên men gồm thành phần sau: + Dịch chiết xơ mít + Glucose, DAP, SA + (NH4)2SO4 + (NH4)2HPO4 Tăng sinh cấp Khay lên men Bảo quản nơi khô Tăng sinh cấp Lên men tĩnh (cấy chuyền giữ giống cho lần lên men sau) Màng khô Màng ướt 1.5 2.2 Nội dung nghiên cứu tiến độ thực hiện: 1.5.1 Nội dung nghiên cứu: a Nghiên cứu tỉ lệ % dịch chiết xơ mít lên suất trình tạo màng cellulose b Nghiên cứu thời gian thích hợp để thu nhận màng cellulose suất lớn c Nghiên cứu trình thu nhận xử lý sản phẩm tốt 1.5.2 Tiến độ thực hiện: STT Các nội dung, công việc thực Sản phẩm Thời gian Thu giống giữ giống Giống Gluconacetobacter xylinus tháng Nhân giống tăng sinh khối Giống Gluconacetobacter xylinus số lượng lớn tháng Màng cellulose tháng Lên men giống, tạo màng cellulose, đánh giá chất lượng màng cellulose Người thực Viết báo cáo, tổng hợp số liệu, tổng kết CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1.6 Thuần khiết giống nhân giống khiết 1.6.1 Tuyển chọn khuẩn lạc Từ giống chai Gluconacetobacter xylinus từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM pha lỗng: dùng 1ml giống hịa tan 99ml nước cất vơ trùng, tiếp tục pha lỗng qua ống nghiệm cách lấy 1ml dung dịch chuyển vào ống nghiệm chứa 9ml nước vơ trùng, tiếp tục pha lỗng qua ống nghiệm thứ đến thứ 10 Lấy 1ml ống nghiệm trang lên đĩa petri chứa môi trường HS với thành phần sau: + Nước cất 1L + Glucose 20g/L + Cao nấm men 5g/L + Peptone 5g/L + Na2HPO4 2.7g/L + Acid citric 1.15 g/L + Aga 20 g/L + NaOH dùng chỉnh pH 6.0 + Khử trùng 121oC 15 phút môi trường thạch đĩa Ủ giống nhiệt độ phòng ngày Sau ngày nuôi cấy xuất khuẩn lạc đĩa Kết quan sát đại thể vi thể khuẩn lạc sau: Quan sát đại thể Sau phân lập, tế bào tách riêng rẽ phát triển thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc có dạng trịn lồi, nhầy trơn bóng, rìa mép khuẩn lạc nhẵn, màu trắng đục Sau ngày ni cấy, đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm Hình 3.1: Ảnh khuẩn lạc giống A xylimum 1.6.2 Quan sát vi thể: Sau chọn khuẩn lạc điển hình, tiến hành cấy lên mơi trường tăng sinh cấp với thành phần sau: + Nước dừa già 1L + Glucose 20 g/L + (NH4)2SO4 g/L + (NH4)2HPO4 g/L + Acid acetic dùng điều chỉnh pH 5.0 + Khử trùng 121oC 15 phút Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 300C, thời gian tăng sinh + ngày + Tỷ lệ giống: 10% Tiếp tục tiến hành nhuộm Gram, quan sát tế bào vi khuẩn vật kính X40 thu kết sau: Bảng 3.1: Kết quan sát vi thể A xylinum Chỉ tiêu Kết Hình dạng Hình que, xếp riêng lẻ thành chuỗi dài Nhuộm Gram Gram âm (G-) Hình 3.2: Quan sát vi thể vi khuẩn A xylinum Tiếp tục môi trường tăng sinh cấp I, tiến hành tăng sinh môi trường cấp II, cấp III Hình 3.3: Giống A xylinum mơi trường tăng sinh Như từ giống chai sẵn có chúng tơi khuyết giống A xylinum tiến hành giữ giống môi trường lỏng (môi trường III) 1.7 Chuẩn bị ngun liệu dịch chiết xơ mít cho mơi trường lên men Xơ mít từ giống: - Giống mít thái: Artocarpus heterophyllus - Giống mít tố nữ: Artocarpus interger Được thu thập từ tiểu thương bán mít, tách phân loại, xay nhỏ Chiết lấy dịch xơ mít: Kg xơ mít xay nhỏ, bổ sung lít nước cất, hịa tan, lọc để thu dịch chiết lần Để dịch chiết xơ mít ngồi tự nhiên 72h, tiếp tục lọc thêm lần bảo quản tủ lạnh âm sâu Quá trình tạo dịch chiết xơ mít, với mít thái có mùi thơm màu vàng đậm, hàm lượng dinh dưỡng cao, trọng lượng xơ mít/trái lớn, lượng dịch chiết thu nhiều Cịn mít tố nữ khơ, trọng lượng xơ mít/trái nhỏ, lượng dịch chiết thu nhiều, màu vàng nhạt 37 Hình 3.4: Hình ảnh dịch chiết xơ mít 1.8 Lên men tạo màng cellulose Mơi trường lên men gồm thành phần sau: + Glucose với mức: 10 g/L, 15g/L, 18.34 g/L, 20g/L + (NH4)2SO4 : 3.5 g/L + (NH4)2HPO4 : 1.9 g/L I d A ^7 _ /T MDA thái Mít tố nữ + Nước dừa già: 1L + Nhiệt độ lên men: 290C + pH: 5.4 + Môi trường: 72.55 ml + Tỉ lệ giống: 10% Bổ sung dịch chiết xơ mít thái với hàm lượng khác từ 10 - 50% vào môi trường lên men tạo màng cellulose Kết lên men sau ngày nuôi cấy sau: Bảng 3.2: Khối lượng màng cellulose thu sau ngày ni cấy mít thái: Mơi trường Thời gian lên men (ngày) Thời gian xuất màng 10g/L Glu + 10% dịch chiết 47 Trọng lượng tươi màng 3.04 Trọng lượng khô màng 0.42 10g/L Glu + 20% dịch chiết 4.31 10g/L Glu + 30% dịch chiết 2.55 10g/L Glu + 40% dịch chiết 2.44 48 0.58 0.23 0.39 10g/L Glu + 50% dịch chiết 2.50 0.40 15g/L Glu + 10% dịch chiết 15g/L Glu + 20% dịch chiết 15g/L Glu + 30% dịch chiết 15g/L Glu + 40% dịch chiết 15g/L Glu + 50% dịch chiết 2.48 0.34 2.41 0.29 2.19 0.29 1.18 0.16 1.08 0.15 18.4g/L Glu + 10% dịch chiết 1.65 0.19 18.4g/L Glu + 20% dịch chiết 18.4g/L Glu + 30% dịch chiết 18.4g/L Glu + 40% dịch chiết 18.4g/L Glu + 50% dịch chiết 20g/L Glu 1.76 0.25 0.56 0.04 0.08 0.01 0.79 0.03 0.23 0.01 Qua bảng số liệu nhận thấy, tất môi trường có khả tạo màng cellulose kể mơi trường khơng bổ sung dịch chiết xơ mít thái, hiệu suất tạo màng cellulose có biến thiên theo nồng độ dịch chiết xơ mít Nếu hàm lượng dịch chiết xơ mít thấp q hay cao q cho hiệu suất thấp Ở môi trường lên men bổ sung 10g/L Glu + 20% dịch chiết cho kết tốt với trọng lượng tươi thu trung bình 4.31 g/100ml mơi trường, trọng lượng khơ thu trung bình 0.58 g/100ml mơi trường 49 Hình 3.5: Ảnh màng cellulose sau trình lên men Bổ sung dịch chiết xơ mít tố nữ với hàm lượng khác từ 10 - 50% vào môi trường lên men tạo màng cellulose Kết lên men sau ngày nuôi cấy sau: Bảng 3.3: Khối lượng màng cellulose thu sau ngày ni cấy mít tố nữ: Môi trường Thời gian lên men (ngày) Thời gian xuất Trọng lượng Trọng lượng màng tươi màng khô màng 10g/L Glu + 10% dịch chiết 2.10 0.28 10g/L Glu + 20% dịch chiết 1.42 0.20 10g/L Glu + 30% dịch chiết 1.20 0.14 10g/L Glu + 40% dịch chiết 1.15 0.14 10g/L Glu + 50% dịch chiết 1.08 0.10 15g/L Glu + 10% dịch chiết 0.87 0.09 15g/L Glu + 20% dịch chiết 0.93 0.14 15g/L Glu + 2.76 0.39 50 30% dịch chiết 15g/L Glu + 40% dịch chiết 0.72 0.09 10g/L Glu + 50% dịch chiết 0.55 0.03 18.4g/L Glu + 10% dịch chiết 0.69 0.08 18.4g/L Glu + 20% dịch chiết 0.77 0.11 18.4g/L Glu + 30% dịch chiết 2.73 0.36 18.4g/L Glu + 40% dịch chiết 0.51 0.05 18.4g/L Glu + 50% dịch chiết 0.79 0.03 0.23 0.01 20g/L Glu Qua bảng số liệu nhận thấy, tất mơi trường có khả tạo màng cellulose kể mơi trường khơng bổ sung dịch chiết xơ mít tố nữ, hiệu suất tạo màng cellulose có biến thiên theo nồng độ dịch chiết xơ mít Nếu hàm lượng dịch chiết xơ mít thấp hay cao cho hiệu suất thấp Ở mơi trường lên men bổ sung 15g/L Glu + 30% dịch chiết cho kết tốt với trọng lượng tươi thu trung bình 2.76 g/100ml mơi trường, trọng lượng khơ thu trung bình 0.39 g/100ml mơi trường 1.9 So sánh hiệu suất lên men tạo màng cellulose mít thái tố nữ Quá trình lên men bổ sung Glucose dịch chiết xơ mít thái tố nữ mức khác từ 10 - 50% Sau ngày nhận thấy xuất lớp màng mỏng bề mặt Sau ngày nuôi cấy thu kết sau: Bảng 3.4 Biểu đồ so sánh hiệu suất tạo màng 51 Khi so sánh với tất môi trường bổ sung %V dịch chiết xơ mít mít thái mít tố nữ, kết có khác biệt hai loại mít, thơng thường mít thái cho trọng lượng tươi trọng lượng khơ màng lớn mít tố nữ Kết hồn tồn phù hợp với tính chất loại xơ mít CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ •• Kết luận: - Đã tiến hành q trình phân lập, nhân sinh khối, giữ giống thành công với chủng A xilynum phịng thí nghiệm - Dịch chiết xơ mít bổ sung vào mơi trường lên men nhằm giảm hàm lượng đường glucose tiến tới thay nước dừa, nguyên liệu làm tăng chi phí sản phẩm Kết hợp %V dịch chiết xơ mít nồng độ tích hợp làm tăng hiệu suất tạo màng 52 - Tất môi trường diện dịch chiết xơ mít cho kết tạo màng cellulose, lớn so với môi trường đối chứng không bổ sung dịch chiết xơ mít - Giữa mít thái mít tố nữ, dịch chiết mít thái cho hiệu tạo màng tốt hơn, môi trường tốt MT lên men + 10g/L Glu + 20% dịch chiết, sau ngày lên men thu màng ướt đạt trọng lượng 4.31 g/100ml, màng khô đạt trọng lượng 0.58g/100ml Kiến nghị: Kết thu màng cellulose với độ dai, độ kết tinh, hiệu suất chưa cao tiếp tục nghiên cứu môi trường, nồng độ giống, điều kiện lên men để thu màng cellulose đạt yêu cầu TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nước: Đỗ Việt Hà (2014) Nghiên cứu ứng dụng công nghê vi sinh để sản xuất màng cellulose sinh học Đề tài cấp bộ, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Nguyễn Thị Diễm Chi, Hoàng Tuyền Yến Linh Nguyễn Vũ Thanh (2002) Nghiên cứu nuôi cấy Acetobacter xylinum làm màng sinh học trị tổn thương da Y học Tp.HCM 6: 139-141 Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân (2012) Màng sinh học trị bỏng, Tạp chí khoa học Cơng nghệ, 50(4), 453-462 Nguyễn Thúy Hương (2006) Tuyển chọn cải thiện chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất ứng dụng quy mô pilot Luận án tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương ( 2008b) Nghiên cứu sử dụng mơi trường mật rỉ, nước mía, nước trái sản xuất màng BC phịng thí nghiệm khay 25x33mm Tạp chí giáo dục Lê Văn Việt Mẫn & Lại Mai Hương (2006) Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm Nhà xuất Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Cảnh (2004) Quy hoạch thực nghiệm Nhà xuất Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh 53 ... tài: - Nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường lên men tạo màng cellulose Tạo màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ mít Tính sáng tạo: - Tận dụng phế phẩm xơ mít làm nguyên liệu để lên men tạo màng cellulose. .. Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: ? ?Bước đầu nghiên cứu trình lên men sản xuất màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ mít? ?? - Sinh viên thực hiện: Lê... cellulose sinh học - Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho trình lên men tạo màng cellulose sinh học Kết nghiên cứu: Kết thu màng cellulose từ kết nghiên cứu sau: -Đã tiến hành trình phân lập, nhân sinh