DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN

TỔNG QUAN VỀ GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE. CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI ACID NUCLEIC. CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA HỆ THỐNG SỬA CHỮA GENECRISPRCAS SYSTEM

MỤC LỤC MỤC LỤC CHƯƠNG I: GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI .1 1.1 Khái niệm Gene 1.2 Cấu trúc genome 1.3 Dự án genome CHƯƠNG II: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR 2.1 Kỹ thuật pcr (Polymerase Chain Reaction) 2.2 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 2.3 Các ứng dụng kỹ thuật PCR CHƯƠNG III: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI 10 3.1 Điện di 10 3.2 Phương pháp điện di 10 3.3 Điện di DNA gel 12 3.4 Ứng dụng kĩ thuật điên di: 16 CHƯƠNG IV: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE .17 4.1 Giải trình tự ? .17 4.2 Các phương pháp giải trình tự gene .17 4.2.1 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA 17 4.2.2 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA .20 4.2.3 Giải trình tự máy tự động (automated sequencer) .22 4.3 Ứng dụng 26 CHƯƠNG V: CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI ACID NUCLEIC 27 5.1 Phương pháp Southern blot 27 5.2 Phương pháp Northern blot 28 5.2 Lai chỗ .28 5.3 Lai khuẩn lạc 29 5.4 Lai nhiễm sắc thể 29 5.5 Lai tế bào mô 29 5.6 Phạm vi sử dụng phương pháp 30 CHƯƠNG VI: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 31 6.1 DNA tái tổ hợp .31 6.1.1 Khái niệm DNA 31 6.1.2 Khái niệm DNA tái tổ hợp 32 6.2 Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 45 6.3 Kỹ thuật tách dòng (tạo dòng) .48 6.4 Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) .49 6.5 Ngân hàng gen 54 6.6 Ngân hàng cDNA 55 6.6.1 Thiết kế ngân hàng cDNA 55 6.6.2 Sàng lọc ngân hàng cDNA 56 6.7 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp 56 6.7.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc nghiên cứu gene 56 6.7.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với y-dược học 58 6.7.3 Ứng dụng kỹ thuật di truyền chẩn đoán điều trị gene 60 6.7.4 Kỹ thuật di truyền với hình pháp học số vấn đề xã hội khác 61 6.7.5 Kỹ thuật di truyền với sinh vật biến đổi gene (genetically modified organisms = GMOs) 62 CHƯƠNG VII: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA HỆ THỐNG SỬA CHỮA GENE-CRISPR-CAS SYSTEM 65 7.1 Giới thiệu 65 7.2 Cấu trúc CRISPR genome vi khuẩn 65 7.3 Cơ chế hoạt động CRISPR-Cas9 ứng dụng chỉnh sửa hệ gene (genome editing) .68 7.4 Ứng dụng tiềm hệ thống CRISPR/Cas9 73 7.5 Kết luận 73 CHƯƠNG I: GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI 1.1 Khái niệm Gene Gene đoạn ADN mang thơng tin mã hố cho sản phẩm xác định (chuỗi polipeptit hay ARN) 1.2 Cấu trúc genome Genome (hệ gene, gene) thuật ngữ dùng với nghĩa khác sau: - Nguyên liệu di truyền thể: 1) nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn (hoặc loại nhiễm sắc thể loại có mặt, ví dụ: nhiễm sắc thể lớn bé Vibrio cholerae), 2) DNA RNA virion, 3) nhiễm sắc thể với plasmid kết hợp (ví dụ: nhiễm sắc thể hai plasmid nhỏ vi khuẩn Buchnera) - Tất gene (khác nhau) tế bào virion - Bộ nhiễm sắc thể đơn bội genome đơn bội tế bào Chuỗi genome hồn chỉnh (nghĩa trình tự hồn chỉnh nucleotide genome) công bố cho số lồi vi khuẩn Các trình tự khác cơng bố, ví dụ genome cúc dại (Arabidopsis thaliana) genome người Genome chứa toàn thơng tin di truyền chương trình cần thiết cho thể hoạt động Ở sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% genome nằm nhân tế bào phần lại nằm số quan tử ty thể lạp thể Đa số genome vi khuẩn phần genome chứa quan tử thường có kích thước nhỏ dạng vịng khép kín Ngược lại, phần genome nhân thường lớn phân bố nhiễm sắc thể dạng thẳng 1.3 Dự án genome Là dự án xác định cấu trúc di truyền xác genome thể sống, nghĩa trình tự DNA tất gen Dự án genome số sinh vật mơ hình (model organisms) hồn thành sau: - Các genome vi khuẩn Các trình tự hoàn chỉnh genome Escherichia coli xác định theo phương thức tổ hợp/tập hợp (consortium) phòng thí nghiệm Năm 1995, hai trình tự genome hồn chỉnh vi khuẩn Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium hồn thành Lồi M genitalium có genome đơn giản (khoảng 580.067 base), dựa vào vật chủ để vận hành nhiều máy trao đổi chất Loài H influenzae vi khuẩn đặc trưng hơn, có genome khoảng 1.830.121 base với 1.749 gene - Chuỗi genome hoàn chỉnh nấm men Saccharomyces cerevisiae hoàn chỉnh năm 1996, nhờ consortium phịng thí nghiệm Genome chúng dài 12.146.000 base - Các dự án genome động vật như: chuột, cừu, lợn, giun tròn (Caenorhabditis elegans), ruồi giấm (Drosophila melanogaster)…, thực vật như: lúa nước, lúa mì, ngơ, táo, cúc dại…, mà bật số dự án genome người thực - Ngày 12 2001 genome người công bố với khoảng 30.000 gen, nhiều so với dự kiến trước (hàng trăm ngàn gen), gấp hai lần giun tròn ruồi giấm Người ta xác định hệ gen người giống 98% so với tinh tinh có đến 99% giống dân tộc, cá thể Do đó, vấn đề hình thành phát triển nhân cách, số thơng minh phải chủ yếu sở xã hội rèn luyện người để phát triển tiềm sinh học thân - Trình tự genome sinh vật mơ hình có ý nghĩa nghiên cứu chuyên ngành khoa học genome học (genomics) Dựa vào đây, nhà sinh học phân tử phân tích cấu trúc, hoạt động chức gen, làm sáng tỏ vai trò DNA lặp lại, DNA không chứa mã di truyền, DNA nằm gen Điều đặc biệt có ý nghĩa so sánh genome với nhau, hiểu hoạt động genome thể sống, mối quan hệ chúng, đa dạng sinh học mức độ tiến hóa Kết bước đầu so sánh genome loài sinh vật với cho thấy có ba đặc điểm bật: 1) gen phân bố genome không theo qui luật, 2) kích thước genome thay đổi khơng tỷ lệ thuận (tương quan) với tính phức tạp lồi, 3) số lượng nhiễm sắc thể khác loài gần CHƯƠNG II: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR 2.1 Kỹ thuật pcr (Polymerase Chain Reaction) PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen).Kỹ thuật PCR kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA thể sinh vật thành nhiều sao, kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 công ty Cetus 2.2 Nguyên tắc kỹ thuật PCR - Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA - Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt (trích dẫn Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003) - Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau : Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (94 – 95 0C) vòng 30 giây đến phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trị mạch khuôn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer, cho phép primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 55 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Dưới tác động DNA polymerase, nucleotide gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại tính sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 đến 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tức đến hàng tỷ Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999) 2.3 Các ứng dụng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất đời sống xã hội Những ứng dụng kỹ thuật PCR là:Vân tay di truyền: vân tay di truyền kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định người cách so sánh DNA người với mẫu có, ví dụ như, mẫu máu thu từ trường vụ án so sánh di truyền với mẫu máu người tình nghi Có thể cần lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc… Về lý thuyết cần mạch DNA đơn đủ Kiểm tra huyết thống Kỹ thuật pháp y xác định huyết thống, dấu vân tay kí hiệu: (1) Bố; (2) Con; (3) Mẹ Mặc dù kết “dấu vân tay” (trừ cặp song sinh giống hệt nhau), mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ anh chị em ruột, xác định từ hai nhiều dấu vân tay di truyền, sử dụng để thử nghiệm quan hệ cha Một biến thể kỹ thuật sử dụng để xác định mối quan hệ tiến hóa sinh vật, truy tìm dấu vết tội phạm Chẩn đoán bệnh di truyền - Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát bệnh di truyền gen định trình lâu dài khó khăn, rút ngắn đáng kể cách sử dụng phương pháp PCR Mỗi gen câu hỏi dễ dàng khuếch đại qua PCR cách sử dụng loại sơn lót thích hợp sau trình tự để phát đột biến - Bệnh virus, phát phương pháp PCR thông qua khuếch đại DNA virus Phân tích sau nhiễm trùng, từ vài ngày đến vài tháng trước triệu chứng thực tế xảy Chẩn đoán sớm cho bác sĩ dẫn quan trọng điều trị Tách dòng gene Nhân gen không nên nhầm lẫn với nhân tồn sinh vật-mơ tả q trình cô lập gen từ sinh vật sau chèn vào sinh vật khác PCR thường sử dụng để khuếch đại gen, mà sau chèn vào vector (vector phương tiện chèn gen vào thể) plasmid (một phân tử DNA vịng) (Hình 5) DNA sau chuyển thành sinh vật khác nhau, nơi gen sản phẩm nghiên cứu chặt chẽ Thể gen nhân (thể gen có nghĩa để sản xuất protein mà xác định sản xuất) cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men Gây đột biến điểm Đột biến cách để làm thay đổi trình tự nucleotide DNA Có tình quan tâm đến biến đổi (thay đổi) chuỗi ADN định, ví dụ, đánh giá chức gen ống nghiệm tiến hóa protein Đột biến đưa vào trình tự DNA chép theo hai cách khác trình PCR Đột biến trang web hướng cho phép người thử nghiệm để giới thiệu đột biến địa điểm cụ thể sợi DNA đồi thị (với cơng trình ơng trao giải Nobel năm 1980), vào 10/1977 Hebert Boyer (USA) chế tạo thành công hormone từ E coli phương pháp DNA tái tổ hợp Đến 8/1978 Boyer lại người cho sản xuất thành công insulin người từ E coli (hình 10.9) Các thành tựu mở kỷ nguyên phát triển rực rỡ lịch sử công nghệ sinh học, cơng nghệ DNA tái tổ hợp Sau hàng loạt chế phẩm khác hormone tăng trưởng người (human growth hormone = HGH), bò (BGH), lợn (PGH), vaccine interferon phòng chống bệnh nan người y ung thư, viêm gan v.v số bệnh quan trọng gia súc tượng 'lở mồm-long móng' virus gây tất sản xuất từ E coli Đặc biệt là, đời hãng, công ty lớn đầu tư mạnh mẽ cho phát triển kỹ nghệ Nhờ góp phần giải cách có hiệu nhiều vấn đề thực tiễn đặt y học, chăn ni-thú y, nơng nghiệp nói chung Ở nước ta có số cơng trình nghiên cứu vấn đề này, chẳng hạn nghiên cứu sai khác di truyền gene hormon sinh trưởng số giống gà Việt Nam Qua cho thấy intron I gene hormon sinh trưởng giống gà Ri, gà Mía, gà Ác, gà Hồ dài kích thước dự đốn gene hormone sinh trưởng gà Tanaka công bố năm 1992 (Trần Xn Hồn 2004) 61 Hình 6.9: (a) H Boyer (trái) S Cohen; (b) sơ đồ thí nghiệm tạo dòng biểu gene insulin người vi khuẩn E coli Bên cạnh việc sản xuất hormone, vaccine nói trên, người ta cịn sản xuất kháng thể đơn dòng (monocloning antibodies) dùng để: (i) xác định vi khuẩn gây bệnh (như thương hàn chẳng hạn); (ii) xác định mức hormone từ đánh giá chức tuyến nội tiết thay đổi trình tổng hợp hormone khối u gây ra; (iii) phát số protein có ý nghĩa chẩn đốn khối u số tình trạng trước sinh; (iv) phát thuốc bị cấm có máu, kiểm tra nồng độ thuốc máu tổ chức nhằm đảm bảo liều thuốc sử dụng cho khơng vượt q ngưỡng gây độc v.v Nhờ có tính đặc hiệu xác cao sử dụng dễ dàng, việc sản xuất kháng thể đơn dòng tạo nên nhánh phát triển mau lẹ công nghệ sinh học, với việc sản xuất vaccine chúng trở thành phương tiện quan trọng sách y tế cộng đồng nước phát triển xét lâu dài, việc ứng dụng kháng thể đơn dịng có triển vọng chữa nhiều bệnh có khối u ác tính 6.7.3 Ứng dụng kỹ thuật di truyền chẩn đoán điều trị gene Trong chẩn đoán bệnh mức phân tử, thành tựu bật vào năm 1981, lần bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm chẩn đốn trước sinh mức độ 62 gene nhờ phân tích DNA enzyme giới hạn Từ mở hai hướng chẩn đốn gene là: chẩn đốn bất thường bẩm sinh chẩn đoán bất thường DNA soma Một số thành tựu khác đạt theo hướng đầu gồm có: bệnh hemophilia A, rối loạn dưỡng Duchenne, hội chứng X-fragile, bệnh retinoblastoma - dạng ung thư võng mạc Theo hướng sau, người ta áp dụng số dạng ung thư máu lympho Burkitt, lympho nang, bệnh bạch cầu Đáng kể gần đây, người ta xác định nhiều gene gây bệnh quan trọng người, như: gene gây bệnh hóa xơ nang (cystic fibrosis) năm 1990, gene gây bệnh Huntington năm 1993 Liệu pháp gene (gene therapy) phương thức sản xuất điều trị phân tử trị liệu Đây hướng có nhiều triển vọng khó thực có liên quan đến vấn đề phương pháp luận lẫn khía cạnh đạo lý Sự kiện bật vào năm 1990-91, W.F.Anderson, R.M.Blaese Ken Cuver thực thành công ca liệu pháp gene bé gái bốn tuổi mắc bệnh suy giảm miễn dịch phối hợp (SCID) với thiếu hụt adenosine deaminase (ADA), enzyme cần thiết cho sản xuất kháng thể tế bào hệ miễm dịch, gọi hội chứng "bubble-boy" (bệnh gene gần đầu mút vai ngắn nhiễm sắc thể số 20 gây ra) Mặt khác, liệu pháp gene mở triển vọng to lớn chữa trị bệnh phổ biến nhất, tác động tới hàng triệu triệu người hành tinh như: ung thư, SIDA/AIDS, viêm gan virus, bệnh tim mạch, bệnh thối hóa thần kinh (bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh Alzheimer ) hay bệnh mạn tính đa thấp khớp 6.7.4 Kỹ thuật di truyền với hình pháp học số vấn đề xã hội khác Kỹ thuật di truyền ứng dụng hiệu ngành hình pháp học, chẳng hạn cách sử dụng kỹ thuật 'dấu vân DNA' (DNA fingerprinting) thay cho 'dấu vân tay' trước cho phép ngành cảnh sát hình xác định xác tội phạm nhận dạng xác nạn nhân chiến tranh tai nạn gây (hình 63 6.10) Hình 6.10: Dấu vân DNA (DNA finger- printing) giúp nhà nghiên cứu xác định khả nghi trường hợp tội phạm Kiểu vạch ngang biểu thị chất di truyền người Ở mẫu cho thấy băng máu người mang mã số S2 khả nghi trùng khớp với chứng, mẫu máu E(vs) Ở nước ta, thời gian gần đây, kỹ thuật áp dụng cách hiệu ngành hình Bên cạnh có cơng trình phân tích DNA nhận diện tế bào 103 người Việt Kinh kỹ thuật PCR - SSO (Kit Innolipa) Qua phân tích so sánh khoảng cách gene học người Việt Kinh 11 sắc tộc châu Á Đại dương khác, kết luận người Việt Kinh gần với người Thái đến người Manchu (Vũ Triệu An, 1999) 6.7.5 Kỹ thuật di truyền với sinh vật biến đổi gene (genetically modified organisms = GMOs) Đối với ngành chăn ni, cơng nghệ sinh học nói chung cơng nghệ sinh học nói riêng đạt nhiều thành tựu đáng kể, chẳng hạn kỹ thuật chuyển ghép gene áp dụng cho hợp tử phôi gia súc nhằm tăng cường khả chống bệnh cải thiện giống nói chung; kỹ thuật xác định giới tính phơi 64 Hình 6.11 cho thấy khả ứng dụng kỹ thuật cấy ghép gene trứng chuột thụ tinh Sau đem phơi ghép gene cấy vào tử cung chuột làm mẹ khác Kết tạo chuột có lơng dạng khảm mong muốn Điển hình cho thí nghiệm truyền gene động vật vào năm 1982,R.D.Palmiter, R.L.Brinster đồng Đại học Seatle (Philadelphia, USA) cách truyền gene xác định hormone sinh trưởng chuột cống vào trứng thụ tịnh chuột bình thường, cấy trở lại tế bào biến đổi gene vào vịi trứng chuột mang thai Và kết là, tác giả thu dạng chuột nhắt có kích thước lớn gấp 2-3 lần chuột bình thường, gọi chuột khổng lồ Đối với trồng trọt, việc sử dụng phương pháp chuyển ghép gene đạt nhiều thành tựu to lớn Chẳng hạn, hãng Biogen (USA) năm 1984 chuyển thành công plasmid Ti vào tế bào thực vật; hãng Calgene Phytogene (USA, 1984) ghép thành công gene kháng glyphosate để bảo vệ bông; năm 1985 hãng Molecular Genetics (USA) tạo giống ngô cho nhiều tryptophan Năm 1993, kỹ thuật súng bắn gene vào tế bào thực vật người ta đưa gene sản 65 xuất protein diệt sâu vào ngô, kết tạo giống ngô chống chịu cao sâu đục thân Điều thú vị việc tách gene cố định đạm, gene Nif (Nif = nitrogene fixation) từ vi khuẩn nốt sần họ đậu đưa vào gene trồng khác để tạo giống trồng có khả cố định nitơ cho suất cao Trong chọn giống vi sinh vật, người ta thực thành công việc chuyển gene cellulase vào vi khuẩn (J.P.Aubert, France 1/1983), cải biến E coli để sản xuất Laspartat (hãng Tanabe, Japan 1985), ghép gene vào xạ khuẩn S violacconiger để cải tiến việc sản sinh enzyme glucoisomerase (hãng Roquette Cayla, France 1985), ngồi cịn tạo giống vi sinh vật biến đổi gene có khả ăn cặn dầu dùng xử lý phế thải có độc tố nhằm bảo vệ mơi sinh Bên cạnh việc tạo giống nấm men giết chết vi khuẩn xuất bia (hãng Suntory, 1985), tạo chủng nấm men sản xuất insulin interferon (A Kimura, Japan 1986) v.v Nhận thức rõ ý nghĩa tầm quan trọng công nghệ DNA tái tổ hợp cơng nghệ sinh học nói chung phát triển kinh tế-xã hội đất nước ta kỷ XXI, Chính phủ Nghị 18/CP ngày 11/4/1994 "Phương hướng phát triển công nghệ sinh học Việt Nam đến năm 2010" Đây xem bước ngoặt quan trọng cho phát triển công nghệ sinh học nước nhà thời gian qua tới 66 CHƯƠNG VII: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA HỆ THỐNG SỬA CHỮA GENE-CRISPR-CAS SYSTEMa sẻ 7.1 Giới thiệu CRISPR/Cas9 thu hút quan tâm hầu hết nhà khoa học giới lĩnh vực chỉnh sửa gen lĩnh vực sinh học khác CRISPR/Cas9 khám phá từ chế tự vệ vi khuẩn, hệ thống dễ dàng lập trình để cắt chỉnh sửa trình tự DNA lồi khác Do vậy, việc tìm hiểu chế CRISPR/Cas công cụ công nghệ sinh học nhanh chóng sử dụng rộng rãi việc biến đổi DNA gen 7.2 Cấu trúc CRISPR genome vi khuẩn Nghiên cứu cho thấy tổ chức CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat -cụm đoạn lặp xuôi ngược ngắn phân cách đều) genome vi khuẩn đa dạng Một locus (vị trí) CRISPR cấu thành từ đoạn lặp (repeats) dài 21 đến 48 bp xen kẽ trình tự dài 26 đến 72 bp gọi đoạn đệm (spacers) Trong locus kích thước đoạn lặp đoạn đệm ổn định Mỗi vùng CRISPR đặc trưng trình tự đoạn lặp điển hình locus Một locus CRISPR chứa đoạn lặp đoạn đệm, khơng có khung đọc mở (open reading frame) Hình 7.1: Cấu trúc vùng CRISPR 67 Trong vùng CRISPR có trình tự đoạn lặp bảo thủ Hầu hết đoạn lặp có tính palindromic phần (nghĩa phần trình tự xi ngược giống nhau), dẫn đến khả hình thành nên cấu trúc thứ cấp ổn định, bảo thủ cao CRISPR thường nằm nhiễm sắc thể, có trường hợp nằm plasmid Phía thượng nguồn (up-stream) vùng CRISPR leader region (là trình tự đánh dấu bắt đầu CRISPR array; CRISPR array trình tự bao gồm đoạn đệm lặp) dài từ 20 đến 534 bp Vùng CRISPR phiên mã promoter nằm leader region Ngoài ra, ln tìm thấy vài gene kèm CRISPR (CRISPR-associated – Cas, yếu tố kèm với CRISPR)ở vùng lân cận, tạo thành hệ thống CRISPR-Cas (bao gồm locus CRISPR gene Cas lân cận) Một hệ thống CRISPR-Cas thường gồm đến 20 gene cas khác Các gene cas mã hóa họ protein lớn đa dạng có domain điển hình nuclease, helicase, polymerase protein gắn polynucleotide Các gene cas nằm phía thượng nguồn (up-stream) hay hạ nguồn (dow-stream) vùng lặp/đệm Hình 2: Một vùng CRISPR tổng quát 68 Các mũi tên trắng lớn biểu diễn gene cas phía thượng nguồn locus CRISPR L vùng dẫn (leader region), kèm với kích thước Hình thoi đen (trình tự màu đen khung) trình tự lặp CRISPR1 Streptococcus thermophilus strain DGCC7710 Các chữ nhật nhỏ tô màu (các trình tự tơ màu khung) trình tự khác đoạn đệm (spacer) có kích thước tương tự có CRISPR Đặc điểm thường thấy Các đoạn lặp (repeats) Các đoạn đệm (spacers) - Có từ đến 375 đoạn lặp - Có từ đến 374 đoạn đệm vùng (locus) locus - Trình tự đoạn lặp biến đổi - Trình tự biến đổi - Đoạn lặp dài từ 21 đến 48 bp - Đoạn đệm dài từ 26 đến 72 bp Có thể có nhiều vùng CRISPR hệ gene sinh vật prokaryote Số lượng lớn phát 20 locus CRISPR hệ gene Methanococcus jannaschii Các đoạn lặp đệm CRISPR chiếm tới 1% tổng trình tự tồn hệ gene vi khuẩn Có nhiều suy đốn vai trị CRISPR vai trị tái xếp nhiễm sắc thể, điều hòa biểu gene lân cận, sửa chữa DNA… 69 7.3 Cơ chế hoạt động CRISPR-Cas9 ứng dụng chỉnh sửa hệ gene (genome editing) Hình Cơ chế hoạt động CRISPR-Cas9, hệ thống thuộc kiểu II-A Streptococcus SF370 (Bikard and Marraffini, 2013) (a) Tổ chức hệ thống CRISPR-Cas9 Streptococcus pyogenes SF370 Có gene cas hệ thống cas9, cas1, cas2 csn2; genes sau cho liên quan tới tích hợp trình tự spacer vào CRISPR array Sau gene cas CRISPR array chứa bảy đoạn lặp (màu trắng, dài 36 nt) sáu đoạn đệm (tơ màu, dài 30 nucleotide) có trình tự tương ứng với trình tự thực khuẩn thể lồi S pyogenes Phía trước gene Cas gene mã hóa cho đoạn RNA nhỏ gọi trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) có trình tự tương đồng với trình tự đoạn lặp (b) Quá trình xử lý crRNA Vùng CRISPR phiên mã thành đoạn dài (gọi tiền crRNA) chứa đoạn lặp (màu xám) đoạn đệm (các màu khác nhau) Được Cas9 hỗ trợ, tracrRNA tương tác với trình tự lặp để tạo nên RNA sợi kép (double-stranded RNA – dsRNA) mà bị RNA III cắt, tạo 70 crRNA ngắn từ đoạn tiền crRNA dài Các đoạn crRNA xử lý thêm đầu 5’, khiến cho trình tự định hướng cịn dài khoảng 20 nucleotide Mũi tên đen vị trí xảy xử lý RNA (c) Can thiệp đối tượng Cas9 quét toàn DNA sợi kép đối tượng xâm nhập để tìm vùng bắt cặp bổ sung với crRNA tạo đoạn cắt DNA sợi kép cách sử dụng hai domain nuclease riêng rẽ RuvC-like nuclease đầu N (cắt sợi DNA bổ sung), HNH-like nuclease protein (cắt sợi DNA khơng bổ sung) u cầu phải có trình tự NGG (gọi trình tự PAM) phía sau trình tự mục tiêu cắt xảy Các hệ thống khác cần protein Cas khác cho bước xử lý crRNA bước cắt DNA CRISPR-Cas9 khác biệt chỗ cần protein Cas Cas9 (Jinek, M., et al., 2012) Dựa cấu trúc tự nhiên CRISPR-Cas9, nhà nghiên cứu đơn giản hóa hệ thống cách kết hợp tracrRNA crRNA thành RNA định hướng (single guide RNA – sgRNA) Cas9 định hướng sgRNA chứng minh hiệu tương đương với Cas9 định hướng tracrRNA crRNA riêng rẽ Để phục vụ cho mục đích chỉnh sửa gene, thành phần không liên quan vùng dẫn (leader region), gene Cas có vai trị khác, đoạn lặp bị loại bỏ Gene mã hóa cho Cas9, RNA định hướng (sgRNA) chứa trình tự mục tiêu kết hợp vào plasmid biểu nhỏ Khi chuyển plasmid vào tế bào mục tiêu, Cas9 sgRNA biểu đồng thời Chúng kết hợp với tạo thành hệ thống CRISPR-Cas9 đơn giản mà hiệu quả, tạo điểm đứt gãy DNA tế bào chủ vị trí mong muốn 71 Hình 7.4 Các hệ thống CRISPR tự nhiên nhân tạo Các bước xảy với hệ thống CRISPR tự nhiên: Phiên mã tạo tiền crRNA tracrRNA tracrRNA liên kết với crRNA Tạo RNA định hướng từ tiền crRNA nuclease Cas9 trạng thái bất hoạt gắn kết với RNA định hướng để trở thành Cas9 hoạt hóa CRISPR nhân tạo: Phiên mã nên RNA định hướng thành sợi Phiên mã dịch mã tạo nên nuclease Cas9 RNA định hướng gắn với Cas9 hoạt hóa Cas9 (Nguồn: https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/) crRNAs dẫn Cas9 có trình tự protein đặc hiệu, ghi nhận thơng qua phần bổ sung crRNA Enzyme Cas9 nuclease sau đưa vào phá huỷ sợi đôi DNA mục tiêu Điểm đứt gãy sợi kép DNA sửa chữa theo hai hướng: non- 72 homologous end-joining (NHEJ – nối đầu cuối không tương đồng) homologydirected repair (HDR – sửa chữa dựa theo tương đồng) (Overballe-Petersen et al., 2013; Gong et al., 2005) NHEJ thường dẫn tới đột biến chèn xóa đoạn nhỏ, khiến cho gene mục tiêu bị bất hoạt Có thể xóa đoạn gene tương đối lớn dùng hai crRNA, tạo chuyển vị đảo ngược nhiễm sắc thể dùng crRNA định hướng tới hai nhiễm sắc thể khác (Harrison et al., 2014) Nếu có đoạn DNA mẫu (template DNA, hay donor DNA) tương đồng với vị trí mục tiêu DSB sửa chữa chế HDR Phần DNA quanh vị trí đứt gãy thay phần DNA tương ứng DNA mẫu Nếu đột biến chủ ý đưa vào DNA mẫu đoạn DNA sau sửa chữa mang đột biến (Overballe-Petersen et al., 2013; Gong et al., 2005) Nhưng có DNA mẫu nhiều khả không chế HDR, mà NHEJ, xảy ra, dẫn tới tượng chèn/xóa đoạn không mong muốn Một biến thể Cas9 Cas9D10A giúp hạn chế điều Cas9D10A có khả cắt DNA sợi (chứ hai sợi Cas9 thơng thường), khơng kích hoạt chế NHEJ Khi có mặt DNA mẫu việc sửa chữa DNA tiến hành theo chế HDR (Cong et al, 2013) Việc sử dụng nhiều phức hợp Cas9D10A để tạo nên vị trí đứt gãy sợi đơn (nick) cạnh giúp tăng đáng kể đặc hiệu mục tiêu (Ran et al., 2013; Hình 5B) Một biến thể khác Cas9 nuclease-deficient Cas9 (dCas9) (Qi et al., 2013) khơng có khả cắt DNA) Các đột biến xảy với HNH RuvC domain bất hoạt khả cắt DNA, giữ lại khả liên kết với DNA (Jinek et al., 2012; Gasiunas et al., 2012) Một ứng dụng biến thể biến dCas9 thành công cụ hoạt hóa ức chế phiên mã dung hợp dCas9 với domain tác động (hoạt hóa ức chế) Ngồi ra, lợi dụng khả bắt cặp đặc hiệu trình tự 73 dCas9 với DNA để hiển thị trình tự DNA mong muốn genome cách dung hợp dCas9 với protein huỳnh quang (Chen et al., 2013) Hình 7.5 Chỉnh sửa hệ gene hệ thống CRISPR-Cas9 (Gong et al., 2005; Overballe-Petersen et al., 2013; Cong et al., 2013; Qi et al., 2013) A Cas9 nuclease dạng tự nhiên có vị trí đặc hiệu giúp cho hoạt động tách DNA sợi đôi thành hai sợi để sửa chữa đứt gãy Trong trường hợp khơng có mẫu sửa chữa tương đồng, kết nối khơng đồng dẫn đến indels làm gián đoạn chuỗi mục tiêu Ngồi ra, đột biến xác knock-in thực cách cung cấp mẫu sửa chữa đồng thời khai thác đường sửa chữa đồng B Đột biến Cas9 xác định điểm đặc hiệu cho nick-sợi đơn Hai sgRNA đưa vào để sử dụng phá vỡ sợi đơi mà sau hướng đến trì sửa chữa đồng C Cas9 thiếu hụt nuclease kết hợp với vùng khác yếu tố ảnh huởng vị trí đặc hiệu 74 7.4 Ứng dụng tiềm hệ thống CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 có nhiều tiềm cơng cụ điều trị số bệnh có nguy di truyền cao, ung thư, viêm gan B, cholesterol cao… Nhiều ứng dụng đề xuất đến việc thay đổi gen tế bào soma, bên cạnh người ta quan tâm đến việc tác động lên gen tế bào dịng mầm Bởi thay đổi thực tế bào dòng mầm truyền qua nhiều hệ nên có ý nghĩa đạo đức quan trọng Thực chỉnh sửa gen tế bào dòng mầm bất hợp pháp Anh hầu khác Tuy nhiên, việc ứng dụng hệ thống tế bào soma lại cân nhắc thực số trường hợp đặc biệt hay đe dọa đến tính mạng 7.5 Kết luận CRISPR/Cas ngày chứng tỏ tiềm ứng dụng mạnh mẽ Các nhà khoa học tiến hành việc nghiên cứu để sử dụng hệ thống để sửa chữa sai hỏng DNA gen bệnh lý di truyền Một hướng ứng dụng khác nghiên cứu tế bào gốc nhằm biệt hóa tế bào gốc thành nhiều loại tế bào khác nhờ điều chỉnh di truyền DNA gen Ngoài ra, CRISPR/Cas cịn sử dụng việc tạo loại động vật thực vật biến đổi gen với hiệu cao Nhiều kết khả quan ban đầu việc sử dụng hệ thống cơng bố tạp chí uy tín giới 75