Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen

PGS.TS Khuất Hữu Thanh CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THUẬT GEN ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Lời nói đầu Trong năm gần sinh học đại kỹ thuật nghiên cứu sinh học không ngừng phát triển, sở cho ứng dụng nông nghiệp, y học bảo vệ sức khoẻ người Di truyền phân tử kỹ thuật gen chuyên ngành sâu cần thiết cho nhà sinh học, kỹ sư công nghệ sinh học Công nghệ sinh học đại mà tảng di truyền phân tử kỹ thuật gen ngày có nhiều ứng dụng thực tiễn sản xuất phục vụ đời sống người Các thành tựu giải mã gen người, gen lúa, gen chuột, nhân động vật mở thời kỳ giúp người hiểu biết, chữa khỏi số bệnh nan y, nâng cao sức khoẻ đời sống người Để đáp ứng nhu cầu học tập sinh viên, biên soạn giáo trình Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, nhằm mục đích cung cấp kiến thức lĩnh vực di truyền học, di truyền phân tử, nguyên lý kỹ thuật gen sở khoa học số ứng dụng di truyền phân tử kỹ thuật gen thực tiễn Giáo trình biên soạn sở phân phối chương trình Giáo dục & Đào tạo phê duyệt chương trình giảng dạy khối Thực phẩm - Sinh học Trường Đại học kỹ thuật (1997) Giáo trình dùng làm tài liệu học tập tham khảo cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm thuộc Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Bách CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN khoa Hà Nội, Viện Đại học mở Hà Nội Trường Đại học khác Đại học Quốc Gia, Đại học Nông nghiệp Chúng xin chân thành cám ơn GS TS Nhà giáo Nhân dân Phan Cự Nhân, PGS Lê Ngọc Tú sửa chữa đóng góp ý kiến quí báu Xin chân thành cám ơn đồng nghiệp Phòng nghiên cứu Vi sinh Kỹ thuật di truyền Trường Đại học Bách khoa Hà nội, động viên giúp đỡ, tạo điều kiện hoàn thành giáo trình Trong trình biên soạn giáo trình, cố gắng cập nhật kiến thức đại, bám sát mục đích tính đặc thù môn học, nhiên tránh khỏi thiếu sót Chúng mong muốn nhận nhiều ý kiến đóng góp bạn đọc đồng nghiệp để giáo trình ngày hoàn chỉnh Xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp bạn đọc PGS.TS Khuất Hữu Thanh CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Mục lục Trang Lời nói đầu Mục lục Chương 1: Vật chất di truyền 12 I Lược sử nghiên cứu thành tựu chủ yếu Di truyền học Kỹ thuật gen II Acid nucleic vật chất mang thông tin di truyền 12 15 Thí nghiệm Griffith 15 Thí nghiệm Hershey - Chase 17 III Cấu trúc acid nucleic 18 Thành phần cấu tạo 18 Acid deoxyribonucleic (DNA) 20 Acid ribonucleic (RNA) 25 IV Tính chất biến tính hồi tính DNA 27 V Xu hướng tiến hoá phân tử vật chất di truyền 29 IV Vật chất di truyền số nhóm sinh vật 30 Vật chất di truyền virus 30 Vật chất di truyền sinh vật prokaryote 31 Vật chất di truyền sinh vật eukaryote 32 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Chương 2: Cấu trúc, hoạt động biểu GEN 34 I Cấu trúc gen 34 Vùng điều khiển gen 34 Vùng mang mã di truyền 39 Vùng kết thúc gen 43 II Tái gen 43 Tái DNA kiểu Okazaki 44 Tái DNA kiểu vòng xoay 48 Tái DNA sợi đơn tái RNA virus 50 Tái DNA eukaryote 51 Cơ chế tự sửa chữa tái gen 53 III Phiên mã tổng hợp RNA 54 Phiên mã tổng hợp mRNA prokaryote 54 Phiên mã tổng hợp mRNA eukaryote 59 Phiên mã tổng hợp rRNA 65 Phiên mã tổng hợp tRNA 66 IV Dịch mã 67 Mã di truyền 67 Quá trình dịch mã 70 V Điều hoà hoạt động biểu gen 74 Điều hoà hoạt động biểu gen virus 74 Điều hoà hoạt động biểu gen vi khuẩn 76 Điều hoà hoạt động biểu gen eukaryote 80 VI Cấu trúc gen (genome) 38 41 42 44 45 48 49 51 53 54 55 83 DNA lặp lại 83 Các yếu tố di truyền vận động TGE gen nhảy 84 57 57 61 62 63 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Sự phân hoá gen gen eukaryote Chương 3: Di truyền vi sinh vật 87 88 A Di truyền học Virus 88 I Đặc điểm cấu tạo gen virus 89 II Chu trình lây nhiễm virus 93 Chu trình lây nhiễm virus tan 93 Chu trình lây nhiễm virus tiềm tan 95 III Tái tổ hợp di truyền virus 97 IV Tái vật chất di truyền virus phage 98 Tái vật chất di truyền virus DNA 98 Tái vật chất di truyền virus RNA 101 B Di truyền học vi khuẩn 103 I Đặc điểm cấu tạo gen vi khuẩn 103 II Biến nạp 104 Thí nghiệm biến nạp vi khuẩn S pneumoniae 104 Cơ chế biến nạp 106 III Tải nạp 108 Tải nạp chung 108 Tải nạp đặc hiệu 109 IV Giao nạp 111 Khái niệm giao nạp đột biến khuyết dưỡng 111 Cơ chế giao nạp 112 Lập đồ gen vi khuẩn E coli giao nạp 115 C Di truyền học vi nấm 116 I Chu trình sống vi nấm 116 76 76 77 77 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Chu trình sống nấm men Chu trình sống Neurospora crassa 116 II Phân tích di truyền giảm phân 118 Chương IV: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 120 I Tách chiết acid nucleic 120 Tách chiết DNA 120 Tách chiết RNA 122 Phương pháp định tính, định lượng acid nucleic 123 II Vector tách dòng (vector cloning) 124 Đặc điểm vector tách dòng 124 Các loại vector tách dòng 125 III Enzym giới hạn số enzym thường sử dụng kỹ thuật gen 134 Enzyme giới hạn 134 Một số enzym thường sử dụng kỹ thuật gen 139 IV DNA tái tổ hợp tách dòng gen 142 Tách dòng gen 148 Ngân hàng cDNA 150 Ngân hàng gen Chương V: Một số Phương pháp 153 sử dụng kỹ thuật gen I Phương pháp nhân gen PCR Các bước tiến hành PCR 153 153 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR II Phương pháp giải trình tự gen 157 158 Giải trình tự gen theo phương pháp hoá học 158 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy 161 Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 164 III Các phương pháp lai phân tử 166 Phương pháp Southern blot 166 Phương pháp Northern blot 167 Lai chỗ 167 IV Một số kỹ thuật ứng dụng PCR phân loại phân tử xác định tính đa dạng di truyền sinh vật 112 170 Kỹ thuật RAPD 170 Kỹ thuật RFLP 171 Kỹ thuật AFLP 174 Kỹ thuật SSR 175 V Nguyên lý kỹ thuật chuyển gen ứng dụng 176 Chuyển gen trực tiếp 177 Chuyển gen gián tiếp 180 Chương VI: Di truyền nhiễm sắc thể 187 I Nhiễm sắc thể 187 Cấu trúc nhiễm sắc thể 187 Cơ chế ổn định nhiễm sắc thể 189 II Quy luật di truyền Mendel 192 Một số thuật ngữ 192 Các quy luật di truyền Mendel 192 Tính đa hiệu gen 193 112 113 114 116 117 119 124 124 125 125 126 127 128 128 129 130 131 133 134 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN III Sự di truyền tương tác gen 10 193 Quy luật di truyền tương tác bổ trợ 194 Quy luật di truyền tương tác át chế 195 Quy luật di truyền tương tác cộng gộp 196 IV Sự di truyền liên kết gen 197 Liên kết gen hoàn toàn 197 Hoán vị gen 198 Bản đồ di truyền nhiễm sắc thể 200 Chương VII: Di truyền nhiễm Sắc thể 202 I Di truyền ti thể 202 II Di truyền lạp thể 204 III Đặc điểm di truyền nhiễm sắc thể 205 Chương VIII: đột biến 208 I Khái niệm biến dị đột biến 208 II Nhân tố đột biến chế gây đột biến 209 Tia xạ không gây ion hoá 210 Tia xạ ion hoá 211 Nhiệt độ nhân tố gây đột biến 215 Tác nhân hoá học gây đột biến 216 III Cơ chế phân tử đột biến 221 IV Quá trình tự sửa chữa đột biến 224 V Đột biến nhân tạo tạo giống gây đột biến 224 Phương pháp gây đột biến nhân tạo trồng 225 Đột biến nhân tạo động vật 227 141 142 145 147 148 149 150 151 151 152 152 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 11 Chương IX: Các Phương pháp chọn giống 228 I Khái niệm chọn giống 228 II Các phương pháp chọn lọc 228 Chọn lọc hàng loạt 228 Chọn lọc cá thể 229 Chọn lọc hỗn hợp 230 Ưu lai chọn lọc 230 Đa bội thể chọn lọc 231 Kỹ thuật gen chọn lọc 232 Chương X: Kỹ thuật gen ứng dụng 235 I 235 Kỹ thuật gen ứng dụng sản xuất nông nghiệp II Kỹ thuật gen sản xuất vaccin 239 III Kỹ thuật gen sản xuất chất có hoạt tính sinh học 241 Sản xuất Insulin 241 Sản xuất Interferon 243 Sản xuất kích tố hormon sinh trưởng người 244 Tổng hợp Somatostatin 245 VI Liệu pháp gen 246 Liệu pháp gen chữa bệnh di truyền 247 Liệu pháp gen điều trị bệnh AIDS 249 IV Kỹ thuật gen ứng dụng chuẩn đoán bệnh di truyền 250 Tài liệu tham khảo 251 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 238 phát thêm số gen Cry không phổ biến ký hiệu từ CryVII đến Cry XX Nhóm gen CryI nghiên cứu kỹ nhất, gen CryI mã hoá protein tinh thể độc, có trọng lượng phân tử 130 - 138 kDa, gồm nhóm phụ ký hiệu từ CryIA → CryI H, nhóm phụ có số gen Ví dụ, gen CryIA gồm gen CryIA(a), CryIA(b) CryIA(c) Các thí nghiệm chuyển gen Cry II A(a) vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào trồng làm xuất nhiều protein có độc tính với côn trùng thân, Công ty Monsanto (Mỹ) sử dụng kỹ thuật gen làm thay đổi phần cấu trúc gen Cry I A tạo gen mới, gen mã hoá độc tính cao có khả diệt côn trùng mạnh Thay đổi trình tự gen Cry I A (b), Cry I A (c) tạo protein độc tố có hoạt tính kháng côn trùng cao từ 10 100 lần so với gen cry I A(b) cry I A(c) tự nhiên Baculovirus virus gây nhiễm 600 loài côn trùng khác thuộc bộ: Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera Coleoptera, không gây nhiễm cho người, động vật có vú động vật thực vật Các nhà khoa học Cộng hoà liên bang Nga tạo baculovirus tái tổ hợp cách gắn gen Cry I A(b) Cry I A(c) vào vector pAcUW2B, sau chuyển vào Baculovirus Autographa California Các baculovirus tái tổ hợp tạo thành có hoạt lực diệt sâu côn trùng không cao baculovirus hoang dại, phổ diệt sâu hại rộng nhiều lần Virus BTV (Blue Tonge Virus) mã hoá protein độc tố mạnh với côn trùng sâu hại, có khả xâm nhiễm côn trùng Bằng kỹ thuật gen tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen độc tố mạnh virus BTV có phổ xâm nhiễm côn trùng sâu hại rộng, khả diệt sâu cao CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 239 Bảng 10.2 Phổ diệt sâu hại, côn trùng số gen Cry Kí hiệu CryI (a, c) Chủng B t Kurstaki Alesti CryI (b) Berliner CryI (b, c) Thuringiens is CryI (d, e, Aizawai f) CryIII (a, Kurstaki b, c) CryIII a Shangai Diệt sâu hại Sâu xanh đục thân Bộ Cánh vảy (Lepidoptera) Sâu đo, sâu xám, Cánh vảy (Lep), mối Hai cánh (Diptera) Sâu keo, mối, sâu Cánh vảy (Lep), hại kho Cánh cứng (Coleoptera) Sâu tơ, sâu xanh hạt Cánh vảy (Lep) cải Sâu cánh vẩy Cánh vảy (Lep) Sâu cánh vẩy Bọ khoai tây Cánh vảy (Lep) Cánh cứng (Coleoptera) Cánh cứng (Coleoptera) Hai cánh (Diptera) CryIII a Tenebrionis Bọ cánh cứng CryIV a Israelausis Muỗi Culex Aedes Sâu keo, mối, sâu Cánh vảy (Lep), Cánh hại kho, bọ cánh cứng (Coleoptera) cứng Giun tròn nematoda Cry V Cry VI Đầu tiên, tạo vector tái tổ hợp cách gài gen độc tố BTV vào vector tách dòng phía với promoter gen mã hoá polyhedrin (gen mã hoá độc tố baculovirus), vector tái tổ hợp nhân dòng tế bào vi khuẩn tạo sinh khối tạo nên dạng thuốc trừ sâu sinh học nguồn gốc virus có hiệu diệt sâu cao nước ta chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học nguồn gốc virus ngày sử dụng rộng rãi Ví dụ, chế phẩm virus NPV - Dp trừ sâu róm thông (Dendrolimus punctatus) áp dụng Thanh Hoá từ 1991, hiệu diệt sâu đạt 74 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 240 đến 82%; chế phẩm virus NPV- Ha trừ sâu xanh hại (Heliothis armigera) sử dụng công ty từ 1993 có hiệu diệt sâu cao Ngày có nhiều loại thuốc trừ sâu sinh học sản xuất từ kỹ thuật gen, sử dụng sản xuất nông nghiệp nhiều nước giới Việt Nam II Kỹ thuật gen sản xuất vaccin Vaccin Edward Jenner (Anh) chế tạo 1796 từ mụn mủ bò bị bệnh đậu mùa, vaccin dại Louis Pasteur chế tạo thành công năm 1885 Vaccin chia thành nhóm chính: vaccin giảm độc tính, vaccin bất hoạt tính vaccin kỹ thuật gen Vaccin bất hoạt tính, chế tạo cách giết chết tác nhân gây bệnh (vaccin phòng bệnh ho gà, thương hàn, cúm, chó dại ), vaccin nhóm có độ an toàn cao, ổn định hiệu lực không cao Vaccin giảm độc tính làm từ vi khuẩn hay virus sống (vaccin phòng bệnh lao - BCG, sởi, bại liệt, quai bị ) có hiệu cao phải luôn bảo quản lạnh, số trường hợp virus vi khuẩn phục hồi biến đổi gen độc dẫn đến hiệu ứng không mong muốn người tiêm chủng Kỹ thuật gen nhằm gây đột biến gen loại bỏ phần gen kiểm soát độc tính, giữ tính kháng nguyên cao dùng để sản xuất vaccin Kỹ thuật gen ngày ứng dụng sản xuất vaccine công nghệ DNA tái tổ hợp, vaccin viêm gan virus B, vaccin viêm gan virus A, vaccin lở mồm long móng, AIDS Vaccin chống bệnh viêm gan virus B hệ đầu vaccin chiết tách từ huyết tương người có kháng nguyên HBs gây bất hoạt, để tạo vaccin cần lượng lớn huyết người mang HBsAg (kháng nguyên bề CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 241 mặt virus viêm gan B) trình chiết tách phức tạp Vaccin viêm gan virus B hệ thứ hai vaccin tạo cách lây nhiễm virus viêm gan B vào tế bào chủ cho virus sản xuất kháng nguyên, tách chiết gây bất hoạt virus để tạo vaccin Hạn chế loại vaccin kỹ thuật chiết tách kháng nguyên phức tạp tốn Vaccin viêm gan virus B hệ thứ ba vaccin tạo kỹ thuật gen Virus có nhóm gen mã hoá protein vỏ virus protein S, protein preS1 protein pre-S2 Trong protein pre-S2 có khả gây đáp ứng miễn dịch giúp bảo vệ tế bào nhanh mạnh Gen mã hoá cho protein pre-S2 tách dòng năm 1981 tái tổ hợp tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae (Rutter cộng sự, Đại học California) Bằng kỹ thuật gen vaccin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất từ 1986 với nhiều thương phẩm Engerix B sản xuất nấm men tái tổ hợp (hãng Smith Kline, Mỹ); Recombivax (hãng Merck- Sharp DNA Dohme, Mỹ); Genhevac B sản xuất tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc -CHO (hãng Pasteur Merieux) Hiện Việt Nam số nước sản suất thành công vaccin viêm gan virus B tái tổ hợp có hiệu cao qui mô công nghiệp Hiện nay, tách dòng gen mã hoá protein bề mặt virus HIV tạo vaccin miễn dịch chống lại virus HIV nghiên cứu Virus HIV có nhiều chủng (type) khác nhau, (type) virus HIV gây bệnh mức độ khác nhau, cần loại vaccin khác phòng trị bệnh Mặt khác, virus HIV có khả thay đổi nhanh chóng kiểu gen, thay đổi cấu trúc lớp vỏ để chống lại vaccin gây khó khăn lớn sản xuất vaccin đặc hiệu Sản xuất vaccin chống virus HIV đòi hỏi nhiều nghiên cứu phức tạp, thử nghiệm thận trọng Hiện nay, vaccin chống virus HIV giai đoạn sản xuất thử nghiệm số nước tiên tiến CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN III 242 Kỹ thuật gen ứng dụng sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học Sản xuất insulin Insulin hormon điều chỉnh trình đồng hoá đường thể người động vật Năm 1955 trình tự axit amin insulin xác định Phân tử insulin gồm hai chuỗi polypeptid: chuỗi A gồm 21 axit amin chuỗi B có 30 axit amin nối với nhờ liên kết disulfur Sản phẩm gen mã hoá tổng hợp pre- proinsulin Phân tử pre- proinsulin cắt bỏ đoạn peptid tín hiệu gồm 24 acid amin tạo thành phân tử tiền insulin (proinsulin) Trong tế bào, phân tử proinsulin bị cắt bỏ khoảng 35 acid amin đoạn (đoạn C), liên kết disulfur acid amin Cystein chuỗi A liên kết disulfur nối acid Cystein chuỗi A chuỗi B, tạo nên phân tử insulin hoàn chỉnh Hình 10.1 Cấu trúc phân tử pre- proinsulin CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 243 Năm 1963 - 1965 người ta thành công tổng hợp hoá học hai chuỗi polypeptid A B tạo đươck insulin nhân tạo đầu tiên, trình tổng hợp phức tạp với 170 phản ứng, giá thành đắt Sau insulin từ tụy bò tụy lợn tách chiết để chữa bệnh cho người bị tiểu đường, nhiên số người bị bệnh tiểu đường dị ứng với insulin bò lợn, gây nên phản ứng loại thải insulin bò lợn loại thải protein lạ Hình 10.2 Sơ đồ tổng hợp insulin người kỹ thuật gen CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 244 Năm 1978 lần insulin người tổng hợp nhờ vi khuẩn E coli kỹ thuật gen Insulin người sản phẩm protein tạo dòng đầu tiên, có giá trị chữa bệnh tiểu đường cho người bán thị trường Đầu tiên, tổng hợp nhân tạo đoạn DNA mã hoá chuỗi polypeptid A chuỗi polypeptid B Tạo vector tái tổ hợp để đoạn DNA gắn vào plasmid pBR322 đoạn cuối gen lacZ (gen mã hoá enzym βgalactosidase) Mỗi vector tái tổ hợp chuyển vào dòng vi khuẩn E coli Trong dòng vi khuẩn E coli tổng hợp nên phân tử protein lai βgal- chuỗi A, dòng tổng hợp phân tử protein lai β-gal- chuỗi B Các chuỗi polypeptid A B tách tinh chế kỹ thuật đặc trưng có tham gia cyanua bromid Kết hợp chuỗi polypeptid A chuỗi polypeptid B điều kiện thích hợp để hình thành liên kết disulfur, tạo nên phân tử insulin hoạt tính dùng chữa bệnh Sản xuất interferon Interferon phát năm1957, interferon protein kháng thể hình thành tế bào bị nhiễm virus, có tác dụng giúp tế bào chống lại xâm nhiễm loại virus khác Interferon tính đặc hiệu virus, có tính đặc hiệu loài cao, interferon tế bào loài sinh giúp thể loài chống lại virus Từ năm 1980, interferon sản xuất kỹ thuật gen Trước đây, interferon phân loại dựa vào tính bền vững với acid Ngày phân loại interferon theo loại tế bào sản xuất, gồm nhóm với loại interferon α, interferon β interferon γ Các interferon nhóm I gồm interferon α tế bào bạch cầu sản sinh, interferon β tế bào fibroblasts sản xuất, có xâm nhiễm CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 245 virus Các Interferon nhóm II interferon γ tế bào lympho T sản xuất Interferon α 22 gen khác nhiễm sắc thể số mã hoá Các interferon β gen nằm nhiễm sắc thể số mã hoá, interferon γ gen nằm nhiễm sắc thể số 12 mã hoá Interferon α (IFN- α) protein có 166 acid amin, interferon β (IFNβ) có 187 acid amin interferon γ (IFN- γ) có 220 acid amin Các interferon có tác dụng kháng virus, điều hoà miễn dịch, chống lại tăng sinh tế bào khối u, chống ung thư Các bước chủ yếu công nghệ sản xuất interferon: - Tách mRNA từ gen mã hoá interferon tế bào bạch cầu người (tuỳ theo yêu cầu sản xuất cần tách mRNA gen mã hoá interferon α, interferon β interferon γ), thực kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA tương ứng - Sử dụng vector tách dòng phage λ tạo vector tái tổ hợp cDNA với vector tách dòng - Chuyển vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli, nuôi cấy tạo sinh khối để thu interferon - Tách chiết, tinh interferon, bào chế với phụ gia NaCl, KH2PO4, Na2HPO4, dextan dùng kỹ thuật đông khô đóng gói chế phẩm interferon Sản xuất kích tố hormon sinh trưởng người (Human growth hormone) Hormon sinh trưởng người (hGH) protein có 191 axit amin, sản xuất tuyến yên Tuyến yên định phát triển mô xương tốc độ phát triển người Một số trẻ em bị giảm chức CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 246 tuyến yên phát triển không bình thường, hormon sinh trưởng Trước đây, trẻ em còi cọc điều trị hormon sinh trưởng tách chiết từ tuyến yên người chết Điều trị cho trẻ em thiểu tuyến yên tốn kém, năm cần lượng hormon từ 70 não người chết Mặt khác hGH thu từ não người chết bị lây nhiễm bệnh não, nên hiệu Đoạn peptid tín hiệu hormon sinh trưởng người gồm 24 acid amin đoạn đầu phân tử protein, peptid tín hiệu qui định vị trí tế bào protein đưa đến tiết tế bào Các bước công nghệ tổng hợp hormon sinh trưởng người kỹ thuật gen: - Tách chiết mRNAhGH từ tế bào tuyến yên hoạt động - Tổng hợp phân tử DNA bổ xung (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) DNA- polymerase - Sử dụng cặp enzym giới hạn Eco RI Hind III cắt cDNA, loại bỏ đoạn gen điều khiển đoạn peptid tín hiệu - Tổng hợp nhân tạo đoạn gen mã hoá 24 acid amin có khác biệt hai nucleotid so với đoạn gen mã hoá peptid tín hiệu gắn đoạn gen vào cDNA tạo nên gen mã hoá hGH - Tạo plasmid tái tổ hợp gen mã hoá hGH plasmid pBR322 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli, nuôi cấy tạo sinh khối để thu hGH, sau tách tinh chế hGH để tạo chế phẩm Tổng hợp Somatostatin Somatostatin hormone tạo vùng não điều khiển thân nhiệt Bằng kỹ thuật gen somatostatin tạo E coli giống CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 247 kỹ thuật tổng hợp polypeptid ngắn Các bước chủ yếu công nghệ sản xuất somatostatin: - Tổng hợp hoá học phân tử DNA sợi đơn có 51 bazơ, có trình tự: TAC - 42 bazơ (mã hoá somatostatin) - ACTATC - Phiên mã tạo mRNA tương ứng là: AUG - 42 bazơ - UGAUAG Phân tử mRNA có ba AUG không sử dụng cho khởi đầu, trình tự gồm 42 bazơ mã hoá somatostatin hai ba stop - Sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA tương ứng - Vector tách dòng plasmid pBR322 biến đổi có promoter lac phần gen lacZ Đoạn cuối gen lacZ mã hoá đoạn peptid có nhóm - NH2 enzym β-galactosidase Tạo vector tái tổ hợp cDNA với vector tách dòng - Biến nạp vector tách dòng vào tế bào chủ, tế bào biến nạp tạo thành phân tử protein lai có đoạn peptid có nhóm - NH2 enzym β-galactosidase đoạn peptid somatostatin - Tách tinh chế protein xử lý với cyanua bromid, tạo nên somatostatin IV Liệu pháp gen Liệu pháp gen kỹ thuật đưa gen lành vào thể thay cho gen bệnh, đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen bị sai hỏng Do gen đưa vào thể biểu cách tuỳ tiện không biểu Gen đưa vào gây hiệu không mong muốn, gắn vào vị trí gây hoạt hoá gen tiền ung thư, dẫn đến biểu độ gen gây ung thư nên khó khăn lớn kỹ thuật gen CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 248 kiểm soát gen cần đưa vào thể Liệu pháp gen thành công tuỳ thuộc vào vector tái tổ hợp điều kiện kỹ thuật đại Vector tách dòng sử dụng liệu pháp gen thường sử dụng virus Nhóm retrovirus gồm virus RNA có enzym phiên mã ngược, thường sử dụng chuyển gen vào tế bào người Retrovirus cho phép cài DNA vào tế bào chủ, biểu DNA tế bào Tuy nhiên, sử dụng retrovirus làm vector chuyển gen có nhiều hạn chế: retrovirus nhóm virus gây ung thư; gen retrovirus gắn vào gen tế bào chủ cách ngẫu nhiên không kiểm soát được, dễ gây đột biến không không định hướng gen tế bào chủ, mặt khác retrovirus lây nhiễm nhanh tế bào phân chia, nên sử dụng retrovirus làm vector chuyển gen áp dụng để sửa chữa tế bào biệt hoá tận Nhóm adenovirus virus DNA, có khả xâm nhiễm nhiều loại tế bào (không cần giai đoạn tế bào phân chia), thích hợp cho việc chuyển gen vào tế bào biểu bì đường hô hấp Một số ý kiến cho việc sử dụng liệu pháp gen người tác động trực tiếp vào vốn di truyền nhân loại, cần phải bị kiểm soát chặt chẽ Một số nước đề nghị nghiêm cấm sử dụng liệu pháp gen chữa bệnh người Hiện nay, liệu pháp gen phương pháp điều trị bệnh đầy hứa hẹn, ngày có nhiều người chữa bệnh liệu pháp gen Liệu pháp gen chữa bệnh di truyền Bệnh thiếu hụt miễn dịch gây khiếm khuyết gen enzym adenosine deaminase (ADA) liên quan đến chuyển hoá CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 249 purin Người đồng hợp tử gen ADA bị hỏng có hệ miễn dịch yếu, có nguy tử vong nhiễm số bệnh, mà người có gen ADA bình thường không bị Trẻ em bị bệnh phải nuôi cách ly thường xuyên nhà kính, để tránh nhiễm tác nhân gây bệnh Năm 1990, French Anderson cộng thành công sử dụng liệu pháp gen chữa bệnh thiếu hụt ADA cho em gái tuổi Anderson cộng lấy số tế bào máu trắng khiếm khuyết, cấy vào tế bào vector retrovirus chứa gen ADA bình thường Sau đến hai tháng tế bào cấy lại vào người cháu bé, tiếp tục điều trị cho cháu enzym ADA Năm 1992 cháu bé phục hồi chức hệ thống miễn dịch sinh hoạt người bình thường Bệnh cầu hình liềm bệnh thiếu máu di truyền, người bị bệnh hồng cầu hình liềm gen β- globin bị đột biến Liệu pháp gen thay tế bào tủy xương mang gen đôt biến tế bào tuỷ xương mang gen bình thường Các bước liệu pháp gen: - Tách số tế bào tủy xương người bệnh, sau chuyển gen β-globin bình thường tách dòng vào tế bào tủy xương này, chọn lọc tế bào tuỷ xương tái tổ hợp mang gen β-globin bình thường - Nuôi tế bào tế bào tuỷ xương tái tổ hợp mang gen β-globin bình thường điều kiện thích hợp để tạo sinh khối - Chiếu xạ tia X với liều lượng cao cho bệnh nhân, để giết tế bào tủy xương mang gen đột biến - Cấy tế bào tuỷ xương tái tổ hợp mang gen β-globin bình thường vào thể người bệnh, tế bào sinh trưởng phục hồi dần số lượng tế bào tủy xương, bệnh thiếu máu khắc phục CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 250 Điều trị liệu pháp gen với tế bào bệnh xử lý bên thể gọi điều trị ex vivo Liệu pháp gen điều trị bệnh AIDS Năm 1983 hai phòng thí nghiệm viện nghiên cứu Pasteur (Pháp) viện nghiên cứu ung thư quốc gia (Mỹ) đồng thời phát virus gây suy giảm khả miễn dịch thể người (HIV) Năm 1996, Mery Kerington nữ bác học người Mỹ phát hai gen CD4 CCR5 có khả giúp cho tế bào kháng virus HIV Người bị nhiễm virus HIV tiến triển thành bệnh nhân AIDS, gen CCR5 dạng bình thường không biến dị Trong tế bào virus HIV tiếp cận gần tế bào miễn dịch, gen CCR5 điều khiển tế bào tổng hợp protein CCR5, protein kết hợp với protein CD4 (do gen CD4 mã hoá) tạo thành điểm thụ cảm cho virus HIV tiếp xúc với tế bào miễn dịch Bộ gen virus HIV gắn với gen tế bào vị trí gen CCR5, tồn nhân lên với tế bào trình phân chia, giai đoạn ủ bệnh Một số người có gen CCR5 bị biến dị, không tạo điểm thụ cảm bề mặt tế bào, virus HIV tiếp cận với tế bào miễn dịch, người có gen CCR5 biến dị dù tiếp xúc trực tiếp với virus HIV không bị lây bệnh Phát Mery Kerington mở triển vọng chữa khỏi bệnh AIDS theo hướng tạo loại kháng nguyên kết hợp với gen CCR5 , chuyển gen CCR5 biến dị vào thể người để vô hiệu hoá virus HIV Đây biện pháp triển vọng để chữa bệnh AIDS tương lai CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 251 V Kỹ thuật gen ứng dụng chuẩn đoán bệnh di truyền Kỹ thuật gen tiến hành nghiên cứu triển khai Việt nam hàng loạt ứng dụng: ứng dụng PCR phát đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis chuẩn đoán bệnh lao, ứng dụng RT- PCR phát Virus Dengue (DHF) gây sốt xuất huyết bệnh viện nhi, ứng dụng PCR phát đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Helicobacter pylori từ mẫu sinh thiết để xác định trường hợp viêm loét dày, tá tràng vi khuẩn Helicobacter pylori Ung thư gan loại ung thư virus viêm gan HBV, HCV gây nên Có thể chuẩn đoán ung thư gan xét nghiệm phản ứng huyết tìm kháng nguyên HBsAg Sử dụng kỹ thuật gen chẩn đoán ung thư gan, chuẩn đoán xác loại ung thư gan nguyên phát HBV định lượng RNA virus HCV huyết nhờ sử dụng phản ứng PCR sử dụng số bệnh viện nước ta Câu hỏi ôn tập chương 10 Ứng dụng kỹ thuật gen nông nghiệp Ứng dụng kỹ thuật gen sản xuất chất hoạt tính sinh học Ứng dụng kỹ thuật gen chẩn đoán sớm Cơ sở ứng dụng kỹ thuật gen Liệu pháp gen CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THGUẬT GEN 252 Tài liệu tham khảo Molecular Biology - Robert F Weaver, 2002, International Edition Genetics - Robert F Weaver, Philip W Hedrick, 1997, Wm C Brown Publishers, USA Advanced Molecular Biology - Richard M Twyman, 1998, BIOS Scientific Publishers, Cambridge, UK Molecular cloning - T Maniatis, E.F Fristch, J Sambrook, 1989, 2000, Cold Spring Harbor Molecular Biotechnology - Bernard R Glick and Jack J Pasternak, 1994, ASM Press D.C Washington Di truyền học - Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh, 1999, NXB Giáo dục Cơ sở Công nghệ sinh học - N P Elinov, 1995, NXB Khoa học, (Bản tiếng Nga - Osnovưi Biotexnologiy- (Nauka) Di truyền học đại cương - N P Dubinin, 1981, NXB Thế giới, Matxcova (Bản tiếng Nga -Obsayia Genetika - Mir) Di truyền học sở chọn giống- D Ph Petrov 1984, NXB Mir, Matxcova, (Bản dịch tiếng Việt) 10 Biologie moleculaire - G Barroso, 1988, NXB KHKT, Hà nội, (Bản dịch tiếng Việt) ... trình Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, nhằm mục đích cung cấp kiến thức lĩnh vực di truyền học, di truyền phân tử, nguyên lý kỹ thuật gen sở khoa học số ứng dụng di truyền phân tử kỹ thuật gen. .. số kỹ thuật ứng dụng PCR phân loại phân tử xác định tính đa dạng di truyền sinh vật 112 170 Kỹ thuật RAPD 170 Kỹ thuật RFLP 171 Kỹ thuật AFLP 174 Kỹ thuật SSR 175 V Nguyên lý kỹ thuật chuyển gen. .. pháp gen 246 Liệu pháp gen chữa bệnh di truyền 247 Liệu pháp gen điều trị bệnh AIDS 249 IV Kỹ thuật gen ứng dụng chuẩn đoán bệnh di truyền 250 Tài liệu tham khảo 251 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ