ok VIBRIO

PHẦN 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIBRIO HÌNH THÁI VÀ ĐẶC TÍNH SINH TRƯỞNG: Vibrio trực khuẩn cong, gọi phẩy khuẩn Phần lớn, chúng thuộc Gram âm, thường tìm thấy nước Tế bào vi khuẩn xếp liên tiếp thành hình chữ S hay hình xoắn Chúng di động nhanh nhờ đơn mao đầu, không sinh nha bào, phản ứng oxidase dương tính, tăng trưởng điều kiện hiếu khí hay kỵ khí Cấu trúc vách giống vi khuẩn Gram âm khác Vibrio giống vi sinh vật gây bệnh thường có mặt hải sản sản phẩm hải sản.Trong thường thấy Vibrio parahaemolyticus Loài thường gây bệnh cho người Vibrio có khoảng 28 loài Trong có bốn loài thường thấy nhiều hải sản như: V vulnificus; V alginolyticus; V cholerae; V parahaemolyticus Đặc điểm loài liệt kê bảng sau: Đặc tính số loài Vibrio tiêu biểu T T Loài vibrio Đặc tính Hình que Phát triển NaCl 10% Phát triển NaCl 6% Tạo thành đám(swarming) Tạo thành axeton Lên men đường succrose Lên men cellobiose Sử dụng putrescine Tạo màu thạch TCBS Ghi chú: S: thẳng C: vòng G: maøu xanh Y: maøu vaøng D: 11 – 90% gram (+) PHÂN LOẠI: V parahaemolyticus S − + − V alginolyticus S + + + V vulnificus C − + − V cholerae D − − − − − − + G + + − D Y − − + − G + + − − Y Hieáu khí: A- Tạo thành acid không tạo thành khí từ glucose thường từ số đường khác (một loài phát quang, loài ưa mặn loài tan thạch lực tạo thành acid từ glucose) 1- Không phát quang, không làm tan thạch không phân giải hợp chất có vòng benzen hay oxy hoá oxalate ™ Gặp nước hay chất dịch thể động vật bao gồm người ™ Dịch hoá gelatin • Tạo thành indole • Tạo thành nitrite từ nitrate Không làm đông sữa - Gây bệnh tả _ Vibrio comma (còn gọi Vibrio cholera) - Phẩy khuẩn giống phẩy khuẩn tả phân lập từ nước ngọt_Vibrio berolinensis Làm đông sữa_ Vibrio metschnikovii • Không tạo thành nitrite từ nitrate _ Vibrio proteus • Không tạo thành indole Gặp xoang miệng người _ Vibrio sputigenus Gây áp_xe cóc châu Phi _Vibrio xenopus ™ Không dịch hoá gelatin _ Vibrio leonardii ™ Để phát triển đòi hỏi nước biển môi trường nước muối • Phân lập nước biển Thường tạo thành môi trường gelatin sắc tố nâu tối, khuếch tán _Vibrio marinopraesens Tạo thành thạch nước biển sắc tố vàng nhạt không tạo thành sắc tố khuếch tán _ Vibrio phytoplanktis • Gặp phát triển nước muối Tạo thành acid từ glucose _ Vibrio costicolus Không tạo thành acid từ glucose _ Vibrio halonitrificans 2- Phát quang, làm tan thạch, phân giải hợp chất có vòng benzen hay oxi hoá oxalat ™ Phát quang cách đặc biệt môi trường trung tính chứa nước biển hay chứa hàm lượng muối tương đương nước biển • Dịch hoá gelatin Để phát triển đòi hỏi nước biển kiềm môi trường tương tự (khi phân lập) - Thích hợp phát triển nhiệt độ 26 28oC _Vibrio luminosus - Thích hợp phát triển nhiệt độ 30 32oC _Vibrio indicus Gặp nước ruột _Vibrio albensis • Không dịch hoá gelatin _Vibrio pierantonii ™ Không phát quang cách đặc biệt môi trường trung tính chứa nước biển hay chứa hàm lượng muối tương đương nước biển • Phân giải thạch nhiều • Gặp đất chất hữu thối Phân giải cellulose thạch _Vibrio agarliquefaciens Chỉ dịch hoá thạch _ Vibrio andoii • Gặp nước biển với tảo thối rữa Tạo thành nitrite từ nitrate - Trên thạch khuẩn lạc từ màu trắng đến màu xám _ Vibrio beijerinckii - Trên thạch khuẩn lạc có màu vàng nhạt chuyển thành vàng sáng sau nâu nhạt _ Vibrio fuscus • B12™ • • ™ • Tạo thành nitrite từ nitrate _Vibrio granii Không phân giải thạch Sống đất, có khả phân giải hợp chất có vòng benzen - Sống đất, có khả phân giải naftalen _Vibrio neocistes - Sống đất, có khả phân giải phenol m-cresol _ Vibrio cyclosites Sống đất, có khả phân giải oxalat - Phát triển tốt thạch oxalat canxi Khuẩn lạc màu trắng _ Vibrio oxsliticus - Có dạng màng mỏng đáy môi trường dịch thể Trên thạch oxalat nhuộm màu hồng đỏ đến màu đỏ máu _Vibrio extorquens Không phân giải hydrat carbon Sống đất, có khả phân giải naftalen _ Vibrio cuneatus Không Không dịch hoá gelatin Phân lập từ nước _ Vibrio percolans Khi phân lập cần dùng môi trường nước biển _ Vibrio adaptatus Dịch hoá gelatin Gây phân giải nước _ Vibrio piscum Khi phân lập cần dùng môi trường nước biển _ Vibrio hyphalus Kỵ khí hay hiếu khí (tất ký sinh, thường gây bệnh) A- Vi kỵ khí (microaerophillo) gây bệnh động vật máu nóng Gây sẩy thai gia súc cừu dê _Vibrio fetus Không gây sẩy thai gia súc cừu dê ™ Gây bệnh lỵ lợn _Vibrio coli ™ Gây bệnh lỵ gia súc _Vibrio jejuni B- Kỵ khí bắt buộc ™ Tạo thành khí có mùi thối môi trường protein _Vibrio niger ™ Không tạo thành khí có mùi thối môi trường protein _Vibrio sputorum CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TỒN TẠI VÀ PHÁT TRIỂN: • Nhiệt độ: Vibrios sinh trưởng mạnh khoảng nhiệt độ từ 15-40oC Loài V.parahaemolyticus sinh trưởng 10oC 46oC Khả phát triển vài loài 43oC giúp ta cô lập nhận dạng chúng Nhiệt độ tối ưu cho phát triển hầu hết loài vi khuẩn gây bệnh 37oC Một vài loài có thời gian hệ 20 phút thực phẩm trung bình khoảng 16 phút phòng thí nghiệm với nồng độ muối khoảng 2.9% Mặc dù số loài sinh trưởng 10oC thấp chúng phát triển nhiệt độ làm lạnh 4oC thấp Do đó, bảo quản hải sản nhiệt độ lạnh thích hợp (99 + - - % % V vulnificus 100 20 100 Ký hiệu D + % 76 97 - - 96 +/- 40 + 66 - - Khí từ lactosec Khí từ sucrosec,d Khí từ arabinosec Khí từ mannose Khí từ mannitol Khí từ salicinc Khí từ esculinc + + + - 96 10 99 100 0 + + + + 81 100 100 >99 + + + D - 100 100 100 13 + + + + NA 81 100 66 100 NA a Trên sở ủ 35oC – ngày Vi khuẩn oxydase dương tính không sinh H2S thạch TSI b Kí hiệu: +: 80% hay nhiều dương tính vòng – ngày -: 80% hay nhiều không biểu phản ứng vòng – ngày +/-: mức độ khác biệt cao chủng xét +w: phản ứng dương tính yếu NA: chưa có số liệu chứng minh D: phản ứng không giống bình thường c Có cho việc phân biệt loài vi khuẩn d Các vi khuẩn không lên men sucrose xem V mimicus Bảng : phân biệt loài V cholerae, Aeromonas, Plesiomonas V cholerae A hydrophila P shigelloides Test hay chấta Ký hiệub Dương tính(%) 47 74w 100 96 Ký hiệu Dương tính(%) 45 54 18w 81 Ký hiệu Voges – Prokauerc +/+/Citrate (Simmons) + D Lysine decarboxylase + + Arginine decarboxylase + + Ornithine + +/decarboxylase Khí từ glucose +/55 c Khí từ lactose D 13 D Khí từ sucrosec + 99 D 80 c Khí từ arabinose 10 D 55 Khí từ mannose + 99 + 91 D Khí từ mannitol + 100 + 98 c Khí từ inositol 0 + Khí từ esculinc +/60 a o Trên sở ủ 35 C – ngày Vi khuẩn oxydase dương tính không sinh H2S thạch TSI b Kí hiệu: +: 80% hay nhiều dương tính vòng – ngày -: 80% hay nhiều không biểu phản ứng vòng – ngày +/- : mức độ khác biệt cao chủng xét Dương tính(%) 0 98 96 70 60 96 +w: phản ứng dương tính yếu D: phản ứng không giống bình thường c Có cho việc phân biệt loài vi khuẩn - Các phản ứng lên men: Cấy vi khuẩn phát triển môi trường TSA vào ống nghiệm chứa môi trường dịch thể Andrade, carbohydrate có chứa glucose, lactose, sucrose, mannose, mannitol, salicin, arabinose, esculin inositol 35 oC ngày Kêt test trình bày bảng - Thạch Simmons citrate: Sử dụng que cấy thẳng cấy vi khuẩn phát triển môi trường thạch nghiêng TSA vào thạch nghiêng môi trường phương pháp cấy ria bề mặt cấy trích sâu 35oC 48 ± 0,2 Đọc kết sau: dương tính :xuất phát triển vi khuẩn, kèm theo thay đổi màu từ lục sang xanh; m tính :vi khuẩn không phát triển phát triển màu môi trường không đổi Xem bảng cho phản ứng V cholelae - Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn ( 24 tuổi) Tế bào vi khuẩn V cholerae Gram(-), đơn bào , không tạo bào tử, có hình que cong hay hình dấu phẩy(không xoắn ) 7) Phát xác minh V.cholerae, V mimicus vibrio khả ngưng kết O1 phản ứng với huyết miễn dịch - Test ngưng kết với huyết miễn dịch: Do kháng nguyên loài vi khuẩn khác làm cho kết test trở nên không rõ ràng nên cần phải test sinh hóa trước vi khuẩn phân lập xác minh V cholerae vibrio khả ngưng kết O1 Những vi khuẩn phân lập cho kết thích hợp thạch TSI LI trước hết test với huyết miễn dịch O1 với đối chứng nước muối sinh lý - Vi khuẩn cho phản ứng ngưng kết với huyêùt miễn dịch nhóm O1 không cho ngưng kết nước muối sinh lý V cholerae nhóm O1 phản ứng sinh hóa xác minh vi khuẩn V cholerae Vi khuẩn cho phản ứng với huyết miễn dịch chuyên biệt đem kiểm tra tiếp với huyết miễn dịch Ogawa, Inaba, Hikojima - Những vi khuẩn không cho phản ứng ngưng kết với huyết nhóm O1 hay nước muối sinh lý vi khuẩn vibrio khả ngưng kết phản ứng sinh hóa xác minh chúng thuộc loài vibro - Những vi khuẩn cho phản ứng ngưng kết với huyết nhóm O1 nước muối sinh lý phân loài Tuy nhiên, việc sử dụng môi trường giàu chất dinh dưỡng TSA BHI làm giảm khả ngưng kết , làm cho việc phân loại vi khuẩn trở nên thực Xác định biotype cổ điển biotype Tor E1: phân biệt chủng V cholerae gây ngưng kết huyết Hikojima, Inaba, hay Ogawa để xác định xem chúng có phải biotype cổ điển hay biotype Tor E1 Hai biotype phân biệt dựa vào hai cách sau đây: - Tính mẫn cảm với thực khuẩn thể (phage): thoa bề mặt thạch Mueler Hinton với que có vi khuẩn cần xác định khoảng tuổi môi trường dịch thể nhầm tạo thảm vi khuẩn sinh trưởng Cho lên bề mặt thạch cấy vi khuẩn dịch (một vòng dây cấy đầy) chứa phage IV ( độ pha loãng thích hợp) Quan sát đóa thạch sau ủ qua đêm nhiệt độ 35oC Các chủng thuộc biotype cổ điển thường mẫn cảm với phage tan mặt thạch nơi có diện phage - Tính mẫn cảm với polymyxin B : thoa bề mặt thạch Mueler Hinton với que có vi khuẩn cần xác định khoảng tuổi môi trường dịch thể nhằm tạo thảm vi khuẩn sinh trưởng Để thạch thấm hết dịch chứa vi khuẩn đặt lên bề mặt thạch đóa kháng sinh polymyxin B đơn vị Đảo ngược đóa ủ 35oC 18 – 24 Các chủng cổ điển cho vùng suốt vi khuẩn không phát triển bị ức chế polymyxin B ( đường kính vùng từ 12 – 15mm ) xung quanh đóa kháng sinh Biotype Tor E1 phát triển bình thường vùng bị ức chế từ – 2mm xung quanh đóa kháng sinh - Test làm tan tế bào hồng cầu : trộn thể tích (0,5 hay ml) môi trường dịch thể BHI chứa vi khuẩn 24 tuổi dịch huyền phù nước muối sinh lý tế bào hồng cầu máu cừu 5% ống nghiệm Tạo hỗn hợp tương tự với phần dịch vi khuẩn làm nóng 65oC 30 phút, sử dụng chủng V cholerae làm tan không làm tan tế bào hồng cầu biết làm đối chứng hỗn hợp bể điều nhiệt 35oC làm lạnh qua đêm 4÷ 5oC Kiểm tra tượng tế bào hồng cầu tan ống Ly tâm tốc độ thấp làm tăng khả phát hiện tượng máu tan Phần lớn chủng Tor E1 làm tan tế bào hồng cầu Phần dịch vi khuẩn làm nóng không cho tượng máu tan tính không bền nhiệt chất làm tan tế bào hồng cầu Tuy vậy, biotype V cholerae cổ điển vài chủng biotype Tor E1 không làm tan tế bào hồng cầu - Ngưng kết với tế bào hồng cầu gà:Tạo vi khuẩn đậm đặc huyền phù vi khuẩn ( thuần, cần xác định) phát triển qua đêm môi trường thạch nước muối sinh lý Trên phiến kính sạch, trộn dịch chứa tế bào hồng cầu gà rửa (2,5% nước muối sinh lý) từ vòng ( đầy ) dây cấy với huyền phù với tế bào vi khuẩn Các tế bào hồng cầu ngưng kết lại trông thấy mắt thường biotype Tor E1 Các chủng cổ điển thường không ngưng kết với tế bào hồng cầu gà Cần thực song song với đối chứng dương tính âm tính - Voges – Prolauer (V – P ) test: tiến hành test môi trường dịch thể MR– VP sau ủ vi khuẩn 18 – 24 22oC Biotype Tor E1 thường cho phản ứng dương tính, chủng cổ điển thường cho phản ứng âm tính 8) Một số điểm cần lưu ý: Khi xác định diện vi khuẩn V cholerae thực phẩm, cần lưu ý số điểm sau đây: - Khi phân tích sò hay loài động vật giáp xác khác, thịt nước lấy vào mẫu - Tăng sinh môi trường peptone kiềm không để lâu hệ vi sinh vật khác phát triển lấn át V cholerae - Quá trình tăng sinh phải tiến hành bể điều nhiệt cài đặt 42 ± 2oC - Sự sinh trưởng vi khuẩn bề mặt hay tạo màng cần phải cấy ria từ nước peptone kiềm hay môi trường tăng sinh GSP lên thạch đóa - Khi cấy vi khuẩn vào môi trường KI, TSI hay LI, không nên lấy lặp khuẩn lạc không nên đốt nóng dây cấy sâu lần cấy vào môi trường từ khuẩn lạc - Không loại bỏ vi khuẩn ( V cholerae ) phát triển môi trường KI dựa sở mặt thạch nghiêng có tính acid - Đối chứng nước muối sinh lý âm tính phải tiến hành song song thực test với huyết miễn dịch đa hóa trị, Inaba, Ogawa II PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA Vibrio parahaemolyticus V parahaemolyticus vi khuẩn chịu muối nên môi trường sử dụng để phân lập vi khuẩn phải chứa NaCl nồng độ 3% Ngoài V cholerae V parahaemolyticus, có loài vibro khác nguy hiểm sức khỏe người: V alginolyticus, V fluvialis, V metschinikovii V vulnificus Tất loài vibro chịu muối phân biệt hay nhiều test sinh hóa Thiết bị vật liệu − Các thiết bị vật liệu salmonella − Que tăm vô khuẩn − Mẩu thực phẩm kiểm tra Môi trường thuốc thử ( Lưu ý công thức chuẩn bị môi trường sinh hóa sử dụng phương pháp phải chứa it 1% NaCl) − Môi trường MR – VP (M46) − Môi trường dịch thể trypticase soy (TSB) (M58) − Môi trường thạch TSA(trypticase (tryptic) soy agar) (M1) − Môi trường dịch thể Glucose Salt Teepol (GSTBO (M87) − Môi trường dịch thể Hugh – Leifson glucose (M81) − Môi trường test khả di động (bán lỏng )(M66) − Môi trường dịch thể Bromcresol (M75) có bổ sung riêng lẻ carbohydrate sau: mannitol, lactose, sucrose, hay arabinose − Môi trường decarboxylase (M76) có bổ sung riêng lẽ với arginine, lysine, hay ornithine − Môi trường dịch thể salt tripticase (M88) − Thaïch thiosulfate – citrate – bile salts – sucrose (TCMS) (M78) − Thaïch tryple sugar iron (TSI) (M57) − Thạch Wagasuma(M89) − Môi trường bảo quản dài hạn (M90) − Thuốc thử test oxidase (R24) − Dung dịch NaCl 3% (R33) − − − − Thuốc thử test Voges – Prokauer (R40) Creatine,crystalline Dầu khoáng (dầu parafin) vô khuẩn (R20) Thuốc nhuộm Gram (S6) Chuẩn bị tăng sinh mẫu a Thành phần mẫu − Cá : mô bề mặt, ruột mang − Động vật giáp xác: toàn phần vật Từ khoảng 10 – 12 con, lấy 50g thành phần bên vật làm mẫu b Ngày thứ Thêm 450 ml nước có chứa 3% NaCl để pha loãng mẫu xay phút 8000 rpm ; vậy, độ pha loãng mẫu 1:10 Chuẩn bị mẫu độ pha loãng 1:100; 1:1000; 1:10000 hay cao cần thiết Cấy 10ml mẫu có độ pha loãng 1:10 vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường dịch thể GSTB (nồng độ đôi) (tức chứa phần mẫu 1g) Cấy 1ml mẫu độ pha loãng 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000 vào môi trường dịch thể GSTB (nồng độ đơn) ống nghiệm qua đêm 35oC 18 – 24 Phân lập V parahaemolyticus a Ngày thứ hai: Sau ủ, cấy ria vi khuẩn ( chứa đầy vòng dây cấy đường kính 3mm) phát triển nơi khoảng 1cm từ bề mặt môi trường GSTB có chưa mẫu độ pha loãng cao mà thấy có sinh trưởng vi khuẩn lên đóa thạch TCBS Cây ria chủng biết loài nghi vấn lên thạch TCBS làm đối chứng đóa thạch TCBS 35oC 18 – 24 b Ngày thứ ba: Kiểm tra hình thái khuẩn lạc thạch đóa TCBS: − Khuẩn lạc V parahaemolyticus V vulnificus có hình tròn, đường kính – mm với tâm màu lục hay xanh đậm − Khuẩn lạc V alginolyticus, V fluvialis, metschnikovii có kích thước lớn có màu vàng − Khuẩn lạc Coliform, Proteus, Enterococus, có , có kích thước nhỏ mờ − Khi nhận biết khuẩn lạc test sinh hóa hay huyết thanh, sử dụng phương pháp MPN để định lượng vi khuẩn Nhận biết V parahaemolyticus test sinh hóa a Ngày thứ ba: Test phân biệt I : Sử dụng que cấy thẳng lấy hai hay nhiều khuẩn lạc nghi vấn điển hình, có, từ thạch đóa TCBS cấy lên môi trường sau: − Thạch nghiêng TSI : Câý ria lên bề mặt cấy trích sâu ủ 35oC 18 – 24 V parahaemolyticus V vulnificus làm cho phần thạch bề mặt trở nên kiềm tính phần trích sâu acid tính; khí sinh vi khuẩn phát triển mặt thạch không sinh khí H2S Điểm giống với Shigella, V.aginolyticus, V fluvialis V metschnikovii cho phần bề mặt phần sâu thạch mang tính acid khí sinh − Môi trường dịch thể TSB (3% NaCl) thạch nghiêng TSA (3% NaCl) : cấy vi khuẩn vào TSB TSA, ủ 18 – 24 35oC Sử dụng vi khuẩn phát triển môi trường cho test khác, nhuộm Gram quan sát kính hiển vi V parahaemolyticus vi khuẩn có quan hệ gần vi khuẩn Gram âm, đa hình, hình que cong thẳng với tiên mao đầu − Môi trường test khả di động: Cấy vào ống chứa môi trường phương pháp cấy sâu vào môi trường tận đáy ống, ủ 18 – 24 35oC Sự phát triển vi khuẩn khuếch tán thành vòng xung quanh đường thẳng cấy chứng tỏ test dương tính V parahaemolyticus vi khuẩn có quan hệ gần vi khuẩn có khả di động b Ngày thứ tư : Test phân biệt II : Tiến hành thêm test sau: − Môi trường dịch thể Huge – Leifson glucose (HLGB) : Cấy trích sâu hai ống nghiệm chứa môi trường HLGB lên que cấy thẳng có vi khuẩn phát triển từ môi trường TSA Phủ lên bề mặt ống lớp dầu khoáng có độ dày khoảng cm ủ 35oC ngày lâu cần thiết Nếu màu môi trường hai ống nghiệm đổi từ tím sang vàng chứng tỏ vi khuẩn lên men carbonhydrate Nếu thay đổi màu môi trường xảy ống dầu khoáng chứng tỏ vi khuẩn oxyhoá carbonhydrate V parahaemolyticus vibrio có mối quan hệ gần lên men glucose không sinh khí − Cytochrome oxidase test : Cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng TSA ủ 35oC 24 Cho – giọt thuốc thử oxidase lên bề mặt thạch nghiêng hay khuẩn lạc thạch đóa Phản ứng dương tính màu xanh tối xuất vòng phút V metchnikovii cho phản ứng âm tính với test Tất vibro ưa muối khác cho phản ứng dương tính − Test cho arginine dihydrolase, lysine orinithine decarboxylase: cấy vi khuẩn (một vòng dây câý đầy) từ TSA vào ống ba môi trường sử dụng để test Enzim trên, sau thêm lớp dầu khoáng dày 10mm vào ống, gồm ống đôí chứng Đậy nút lỏng ủ 35oC Kiểm tra ống sau mổi 24 ngày Màu môi trường chuyển sang màu vàng phản ứng sinh acid Phản ứng dương tính môi trường có màu tím (kiềm); ống đối chứng mang màu vàng (acid) Kết test test khác trình bày bảng − Test khả chịu muối môi trường dịch thể salt trypticase (STB) : Sử dụng dây cấy vòng ( có đường kính nhỏ ) cấy vi khuẩn phát triển môi trường dịch thể TSB chứa 3% NaCl vào ống nghiệm chứa môi trường STB có thêm 0, 6, 8, 10% NaCl, theo thứ tự Các loài vibrio chịu muối không phát triển môi trường không chứa muối, phát triển tốt môi trường chứa 6% NaCl Một số loài khác gồm V parahaemolyticus, V.alginolyticus, V fluvialis số chủng loài V metchnikovii phát triển môi trường chứa 8% NaCl Chỉ có V aginolyticus phát triển tốt môi trường chứa 10% NaCl − Sinh trưởng 420C: Với dây cấy vòng đường kính nhỏ, cấy vi khuẩn 24 tuổi từ môi trường TSB 3% NaCl vào môi trường TSB 3% NaCl Ủ bể điều nhiệt 420C 24 Chỉ xét ống có vi khuẩn phát triển dương tính.V parahaemolyticus, V alginolyticus số chủng loài V fluvialis V metschnikovii dương tính với test − Môi trường dịch thể MR-VP: Với dâây cấy vòng đường kính nhỏ, cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào môi trường MR-VP ủ 350C ngày Tiến hành V-P test.V.parahaemolyticus, V.vulnificus V fluvialis V-P âm tính, V.algnolyticus V.metschnikovii dương tính với test − Phản ứng lên men môi trường dịch thể bromcresol purple: Cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng TSA vào ống chứa môi trường dịch thể sucrose,lactose, mannitol arabinose ủ 350C 4-5 ngày.Phản ứng sinhh acid xảy làm cho màu môi trường thay đổi tư ø tím sang vàng Kết trình bày bảng sau: Test Parahaemolyti Algin oyticus Anguilarum Vulni ficus FLUV IALIS Mesch Aeromonikovii nashydro- Plesio Shigellode cus phila s TCBS(khuẩn + + + lạc màu lục) Sinh trưởng ôû Varb Var + + NDa 42 C Sinh trưởng môi + + trường chứa: + + Var + + 0% NaCl + Var Var Var + + 6% NaCl + 8% NaCl 10% NaCl Lysinedecarbo + + + Var + xylase Argininedihydr Var + + Var + olase Ornithinedecar + Var Var Var Var boxylase Leân men + + + + Var sucrose Leân men + Var Var Var lactose Leân men + + + Var + + + mannitol Leân men + + Var arabinose Voges+ Var + Var Prokauer a ND, không xác định b Var,có thể thay đổi − Phản ứng dương tính đïc xem tỷ lệ với khả gây bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập Các vi khuẩn Vibrio gây bệnh người thường Kanagawa dương tính.Trái lại, vi khuẩn khác phân lập từ thực Hiện tượng Kanagawa (thạch Wagatsuma): phản ứng Kanagawa sử dụng để test xuất chất phân huỷ tế bào hồng cầu bền nhiệt trực tiếp thạch Wagatsuma phẩm hải sản Kanagawa âm tính Để tiến hành Kanagawa test, nhỏ giọt dịch chứa vi khuẩn 18 tuổi từ môi trường TSB 3% NaCl với tăm vô khuẩn lên đóa thạch máu Wagatsuma khô.Có thể nhỏ nhiều giọt tách biệt lên đóa Phải nhỏ giọt làm đối chứng dương tính âm tính lên đóa Ủ 350C Quan sát ghi nhận kết sau 24 Test dương tính gồm có tượng tan tế bào hồng cầu (βhemolysis), tức vùng suốt xuất rõ quanh khuẩn lạc Vùng có mép sắc nét nhiều vòng xung quanh.Vùng máu tan xác định từ mép khuẩn lạc mép vùng Những khuẩn lạc tạo vùng suốt ≥ 3mm xem Kanagawa dương tính xem có khả gây bệnh; với vùng < 3mm vi khuẩn xem có khả gây bệnh cần test lại phương pháp tắc ruột nhỏ ( rabbit ileal loop assay) Lưu ý quan sát trước 24 giơ øthì test không xác − Bảo quản vi khuẩn: cấy vi khuẩn vào môi trường (bán lỏng) bảo quản dài hạn phương pháp cấy trích sâu Để bảo quản V parahaemolyticus V vulnificus nhiều tháng -700C, lấy ml môi trường dịch thể TSB 3% NaCl có chứa vi khuẩn 6-12 tuổi 0,09 ml DMSO (Dimethyl Sulfoxide) vô khuẩn vào cốc chịu lạnh vô khuẩn làm lạnh sâu -700C Xác minh V parahaemolyticus phản ứng với huyết miễn dịch: Kháng nguyên K gồm nhóm soma khác trình bày bảng Rửa thạch nghiêng với ml NaCl 3% để tạo huyền phù vi khuẩn.( Huyền phù đậm đặc tốt cho test ngưng kết phiến kính hiển vi) Chia huyền phù tế bào thành hai thể tích hai ống nghiệm riêng biệt Hấp tiệt trùng ống 1210C Huyền phù tiệt trùng chứa kháng nguyên O Sử dụng bút sáp chia phiến kính làm 12 phần Nhỏ giọt huyền phù đậm đặc vào phần thêm giọt huyết miễn dịch 11 huyết miễn dịch nhóm O vào phần Phần thứ mười hai chứa đối chứng ngưng kết tự động, thêm vào giọt NaCl 3% Nghiêng phiến kính nhẹ nhàng để trộn chất phần, dịch phiến kính tới, lui vòng phút Ngưng kết dương tính thấy Ngưng kết O dương tính xác định loại kháng nguyên K test Đánh dấu phần số thích hợp, kể phần đối chứng Nhỏ giọt huyền phù đậm đặc không hấp tiệt trùng vào phần thêm giọt NaCl 3% Nghiêng phiến kính nhẹ nhàng để trộn chất phần, dịch phiến kính tới lui vòng phút Ngưng kết dương tính thấy Bảng: Sự kết hợp kháng nguyên vi khuẩn V.parahaemolyticus Nhóm O 10 11 Tổng cộng:11 Loaïi K 1,25,26,32,38,41,56,58a,64 3,28 4a,5,6,7,29,30a,31,33,37,43,45,48,54,57,58a,59 4a,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63 15,17,30a,47,60,61 18,46 19 20.21,22,39,62 23,44 19,24,52 36,40,50,51 60 loại K/63 serotype PHẦN 5: KHỐNG CHẾ CÁC LOÀI VIBRIO • Có nhiều cách khống chế khác cần thiết để ngăn chặn, hay giảm thiểu lây nhiễm phẩy khuẩn qua nước thực phẩm Việc khống chế thực cách thông qua trình loại trừ giảm tối đa khả bị lây nhiễm cá thể Không thể khẳng định bệnh phẩy khuẩn gây bị loại bỏ hoàn toàn đường lây truyền hầu hết nguồn bệnh hải sản, phần lớn phần ăn nhiều người giới Những nguồn môi trường cho giống mang bệnh tồn điều kiện môi trường có lợi cho tăng trưởng chúng, hải sản thu gom từ khu vực lại tiếp tục gây bệnh Do đó, loại hải sản có nguy lây nhiễm phẩy khuẩn Tuy nhiên, kiến thức yếu tố rủi ro vật chủ, chế nhiễm độc mầm bệnh đặc điểm sinh học chúng cách xử lý an toàn thực phẩm giúp giảm thiểu khả nhiễm bệnh • Hải sản sau thu hoạch có nguy hư thối cao; vậy, công đoạn xử lý phải tránh làm hư hỏng sản phẩm phát triển loài Vibrio.Việc bao hàm việc khống chế nhiệt độ thời điểm thu hoạch Yêu cầu công đoạn xử lý tương tự sản phẩm dễ hư hỏng khác , bao gồm làm lạnh, điều chỉnh nhiệt độ, phân lập sản phẩm sống với sản phẩm qua xử lý, vệ sinh bề mặt tiếp xúc với thiết bị.Những việc áp dụng cho khu xử lý hải sản nhà Những thiết bị xử lý cho mục đích thương mại phải liền với hệ thống vệ sinh nghiêm ngặt công đoạn xử lý hàng loạt tốt để đảm bảo cho sản phẩm an toàn Do hải sản xuất đến nhiều nước, lây lan diễn nơi xa nguồn gây bệnh Những quốc gia tham gia vào hợp đồng thương mại loại bỏ số nguy thông qua chương trình kiểm tra phản ánh phân tích rủi ro để chắn sản phẩm từ cá an toàn • Một cách tổng quát, công đoạn xử lý hải sản tương tự thực phẩm dễ hư hỏng khác giống nhà Hải sản nấu kỹ để tiêu diệt vi khuẩn, sau ngăn chặn lây nhiễm qua lại sản phẩm nấu từ sản phẩm sống cách tách biệt việc xử lý sản phẩm sống sản phẩm nấu chín Bảo quản thực phẩm sống chín 4.40C Tránh ăn thực phẩm sống thực phẩm chưa nấu kỹ • Hải sản lúc nấu kỹ, ví dụ hải sản thuộc loại vỏ cứng thường hấp thời gian ngắn lớp vỏ hở ra.Khuyến cáo việc nấu hào sống phải để sôi từ 3-5 phút sau mở lớp vỏ ngoài, hấp từ 4-9 phút nước bốc Những hào dược bóc vỏ phải dược nấu sôi phút lớp rìa cuộn lại, chiên phút nhiệt độ 3750F (190.50C), nướng lò 10 phút 4500F (2320C), hay nướng phút với khoảng cách inch (7.7 cm) so với nguồn nhiệt Sau nấu chín, không dùng phải bảo quản nhiệt độ 40C (400F) 600C (1400F) phải bảo quản để tránh nhiễm phẩy khuẩn trở lại Phần lớn bệnh đường ruột gây V parahaemolyticus thực phẩm chế biến để chung vật dụng với thực phẩm sống Những cá nhân bị bệnh gan bị rối loạn tuần hoàn nên ăn thực phẩm chế biến kỹ.Việc loại bỏ tiêu thụ sò sống ngăn ngừa nhiều lây lan V vulnificus loài khác • Các yếu tố môi trường nguyên nhân mức độ tăng nhanh số loài vibrio nước Một hệ thống giám sát dựa trênnhiệt độ độ mặn nước dùng để nhận thời điểm năm thích hợp cho việc thu hoạch hải sản vùng riêng biệt nên gioi hạn lại Một ví dụ việc đề xuất Hoa Kỳ để khoanh vùng thu hoạch sò vịnh Gulf cho việc tiêu thụ hải sản sống ngày ¼ đến 31/10 để giảm thiểu khả nhiễm bệnh V.vulnificus Các số liệu nghiên cứu dịch tễ học cho thấy gần 90% khả nhiễm bệnh ngăn chặn dựa vào việc khoanh vùng thu hoạch • Ứng dụng chiếu tia gamma cường độ thấp(1.0 kGγ) hải sản cách khác để làm giảm lượng vi khuẩn • Khi đặt vào môi trường 60Co, V parahaemolyticus bị ảnh hưởng mạnh mầm bệnh thực phẩm với D10 0.03 – 0.04 kGy 2.8 giảm 5.4 log10 thịt cua loại cá với cường độ krads/min (0.05 kGy) 24oC Với cường độ cao hơn, 50 krads/min (0.5kGy), giảm 6log10 số lượng V cholerae đùi ếch Sử dụng tia xạ phương pháp khống chế số lượng phụ thuộc vào tính hiệu kinh tế chấp nhận người tiêu dùng sản phẩm xử lý theo phương pháp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Giáo trình “ Bệnh truyền nhiễm”, Bộ môn nhiễm Trường Đại học Y Dược TpHCM [2] Nguyễn Đức Lượng – Phạm Minh Tâm, “Vệ sinh an toàn thực phẩm”, NXB ĐHQG TpHCM [3] Nguyễn Đức Lượng- Phan Thị Hiền- Nguyễn nh Tuyết, Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, tập 2, “Thí nghiệm vi sinh vật học”, NXB ĐHQG TpHCM [4] “Vi khuẩn học”, Bộ y tế Trường Đại học Y Dược TpHCM, Khoa Y, Bộ môn Vi sinh, 1997  ... _ Vibrio comma (còn gọi Vibrio cholera) - Phẩy khuẩn giống phẩy khuẩn tả phân lập từ nước ngọt _Vibrio berolinensis Làm đông sữa_ Vibrio metschnikovii • Không tạo thành nitrite từ nitrate _ Vibrio. .. hợp phát triển nhiệt độ 26 28oC _Vibrio luminosus - Thích hợp phát triển nhiệt độ 30 32oC _Vibrio indicus Gặp nước ruột _Vibrio albensis • Không dịch hoá gelatin _Vibrio pierantonii ™ Không phát... dê _Vibrio fetus Không gây sẩy thai gia súc cừu dê ™ Gây bệnh lỵ lợn _Vibrio coli ™ Gây bệnh lỵ gia súc _Vibrio jejuni B- Kỵ khí bắt buộc ™ Tạo thành khí có mùi thối môi trường protein _Vibrio