Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh Vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột ở tôm nước lợ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 62 62 03 01 TRƯƠNG MINH ÚT ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA MẦM BỆNH Vibrio spp VÀ VI BÀO TỬ TRÙNG HIỆN DIỆN TRONG ĐƯỜNG RUỘT Ở TƠM NI NƯỚC LỢ 2022 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Từ Thanh Dung Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ sở Họp tại: Phòng Bảo vệ luận án tiến sĩ (Phòng họp 3, lầu 2, Nhà điều hành), Khu II – Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc 14 00 ngày 08 tháng 08 năm 2022 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Ngọc Phước Phản biện 2: PGS.TS Trần Thị Tuyết Hoa Xác nhận xem lại Chủ tịch Hội đồng GS.TS Nguyễn Thanh Phương Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ - Thư viện Quốc gia Việt Nam i DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Ut, T M., Uyen D T T., and Dung, T T (2021) Antimicrobial activity of herbal extracts against vibrio spp bacteria isolated from white feces syndrome on white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) in some provinces in the Mekong Delta Can Tho University Journal of Science Vol 13, No 2: 61-68 Út, T M., Khôi, L M., Nghĩa, N T, Duyên, L T N Dung, T T (2021) Xác định khả gây bệnh phân trắng vi khuẩn vibrio spp phân lập tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) số tỉnh Đồng Sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học cơng nghệ Nông nghiệp Việt nam Số 08, trang 125-132 Út, T M., Khôi, L M., Nghĩa, N T Dung, T T (2022) Nghiên cứu khả lây nhiễm vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopanaei tôm thẻ chân trắng (Litopennaeus vannamei) Tạp chí Khoa học cơng nghệ Nông nghiệp Việt nam Số 02 (135), trang 126-132 ii CHƯƠNG PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) vùng trọng điểm ni tơm nước Năm 2020, diện tích ni tơm chiếm 92% diện tích ni tơm nước lợ nước; diện tích ni tơm sú chiếm 95%; tôm thẻ chân trắng chiếm 74,4% sản lượng chiếm 86,9% sản lượng nuôi tôm nước lợ nước (Tổng cục Thủy sản, 2020) Chính vậy, tơm sú tôm thẻ chân trắng hai đối tượng tôm nuôi nước lợ chủ lực Việt Nam Tuy nhiên, với sự phát triển thâm canh hóa ngày cao nghề nuôi tôm nước lợ, kéo theo tình hình dịch bệnh diễn tơm nuôi ngày phức tạp, mối đe dọa đến suất, sản lượng sự phát triển bền vững nghề ni tơm Việt Nam nói chung ĐBSCL nói riêng Hiện nay, dịch bệnh xảy tơm ni liên quan đến đường tiêu hóa (đường ruột) ngày phổ biến đến chưa có nhiều nghiên cứu, thơng tin chun sâu bệnh Đặc biệt Việt Nam hội chứng phân trắng (WFS), bệnh chậm lớn vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây chưa có nhiều cập nhật nghiên cứu dịch tễ, phương thức lây nhiễm tác động cộng gộp nhiều mầm bệnh (nhiễm kép/đa nhiễm) đến tôm nuôi Các nghiên cứu dừng lại cấp độ sơ bộ, nhận diện sự xuất mầm bệnh dấu hiệu bệnh lý bên ngồi Trước tình hình dịch bệnh liên quan đến đường ruột tôm nuôi nước lợ xảy ngày nhiều phức tạp, nghiên cứu chuyên sâu tác nhân gây bệnh, đường lây truyền để tìm giải pháp phịng, trị bệnh vơ quan trọng cấp thiết Chính vậy, nhằm cung cấp, bổ sung thêm thông tin khoa học chi tiết hơn, đặc biệt việc tìm biện pháp hạn chế dịch bệnh tôm nuôi, đề tài “Đặc điểm bệnh học mầm bệnh Vibrio spp vi bào tử trùng diện đường ruột tôm nước lợ” thực nhằm hướng tới kiểm soát tốt dịch bệnh, đề xuất, khuyến cáo quản lý dịch bệnh tơm ni cách có hiệu bền vững 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định khả gây bệnh mầm bệnh Vibrio spp vi bào tử trùng đường ruột tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ làm sở khoa học đề xuất biện pháp kiểm sốt bệnh đường ruột tơm thẻ chân trắng ni nước lợ cách có hiệu bền vững 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Mục tiêu 1: Xác định sự diện mầm bệnh Vibrio spp vi bào tử trùng gây bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng nuôi tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng Bến Tre - Mục tiêu 2: Phân lập, định danh xác định khả gây bệnh vi khuẩn Vibrio spp vi bào tử trùng bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ - Mục tiêu 3: Xác định tính nhạy với chất kháng vi sinh vật mầm bệnh Vibrio spp đường ruột tôm thẻ chân trắng 1.3 Nội dung nghiên cứu Đề tài thực nội dung cụ thể sau: a) Khảo sát sự diện mầm bệnh Vibrio spp vi bào tử trùng tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ có biểu bệnh đường ruột b) Phân lập, định danh xác định khả gây bệnh vi khuẩn Vibrio spp vi bào tử trùng bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ c) Nghiên cứu ảnh hưởng chất kháng Vibrio spp lên bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng 1.4 Ý nghĩa luận án Luận án góp phần bổ sung sở khoa học thực thực tiễn khả gây bệnh vi khuẩn Vibrio spp khả lây truyền bệnh vi bào tử trùng tác động ảnh hưởng lên hệ tiêu hóa tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ Nghiên cứu xác định tác động tổ hợp nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh phân trắng tôm thẻ chân trắng mối liên hệ với gen độc lực tạo sở cho nghiên cứu dịch tễ sau loài vi khuẩn tơm nói riêng thủy sản nói chung Đề xuất số giải pháp phòng, trị bệnh tôm thẻ chân trắng hỗn hợp thảo dược có dược tính tương đồng nhằm hạn chế thiệt hại, rũi ro xảy dịch bệnh bùng phát gây thiệt hại cho người nuôi tôm CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự diện mầm bệnh Vibrio spp vi bào tử trùng tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ có biểu bệnh đường ruột Thu mẫu tôm thẻ chân trắng bệnh đường ruột từ ao nuôi thâm canh huyện Đầm Dơi, Cái Nước, Phú Tân-tỉnh Cà Mau, huyện Thạnh Phú-tỉnh Bến Tre, huyện Mỹ Thạnh, Vĩnh Châu-Tỉnh Sóc Trăng Các mẫu thu tiến hành thực tiêu mẫu tươi phát vermiform, trùng tế bào Gregarine vi bào tử trùng EHP đồng thời phân lập vi khuẩn môi trường TCBS từ gan tụy đường ruột, kết hợp với trữ Ethanol Davison’s sử dụng cho phân tích sinh học phân tử mơ bệnh học 2.2 Nội dung 2: Phân lập, định danh xác định khả gây bệnh vi khuẩn Vibrio spp vi bào tử trùng bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng nuôi nước lợ 2.2.1 Định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm bệnh đường ruột định danh thông qua số tiêu hình thái gồm Gram, hình dạng, tính di động, catalase, oxidase, khả lên men oxi hoá đường glucose (O/F) sử dụng test Kit API 20E (BioMerieux, Pháp), kết hợp với giải trình tự đoạn gen 16sRNA vi khuẩn Bảng 2.1 Trình tự mồi 16S rRNA thực phản ứng PCR Tên mồi Gen mục tiêu 27-F 1492-R 16S rRNA Trình tự mồi (5’→ 3’) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT Kích thước (bp) 1500 Tham khảo (Lane, 1991) 2.2.2 Xác định gen độc lực Chủng vi khuẩn V alginolyticus, V cholerae, V vulnificus, V parahaemolyticus xác định gen độc lực toxR, tdh, pirB, toxRS cặp mồi trình bày Bảng 2.2 chu kỳ nhiệt cặp mồi trình bày Bảng 2.3 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng phân tích gen độc lực Đoạn mồi VpPirB-392-F Trình tự mồi (5’→ 3’) PirBVP VpPirB-392-R tlh-F TGATGAAGTGATGGGTGCTC Kích thước (bp) Tài liệu tham khảo 392 Han et al (2015) 450 Mahmud et al (2006) 367 Kim et al (1999) 1347 Matsumoto et al., (2000) TGTAAGCGCCGTTTAACTCA tlh AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG tlh-R GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC toxR-F toxR toxR-R toxRS-F GTCTTCTGACGCAATCGTTG ATACGAGTGGTTGCTGTCATG toxRS toxRS-R TATCTCCCATGCGCAACCGTA ACAGTACCGTAGAACCGT GA Bảng 2.3 Chù kỳ nhiệt sử dụng phản ứng PCR phân tích gen độc lực Khuếch đại Đoạn mồi Giai đoạn tiền biến tính VpPirB-392 (35 chu kỳ) 94°C-3 phút 94°C-1 phút 57°C-1 phút 30 giây 72°C-1 phút 72°C-10 phút tlh (30 chu kỳ) 94°C-3 phút 94°C-1 phút 48°C-1 phút 30 giây 72°C-1 phút 72°C-10 phút toxR (35 chu kỳ) 94°C-3 phút 94°C-1 phút 48°C-1 phút 30 giây 72°C-1 phút 72°C-10 phút toxRS (35 chu kỳ) 94°C-3 phút 94°C-1 phút 54°C-1 phút 30 giây 72°C-1 phút 72°C-10 phút Biến tính Gắn mồi Kéo dài Hoàn tất 2.2.3 Xác định giá trị độc lực vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh Khả gây độc vi khuẩn Vibrio sp phân lập từ tôm bệnh đường ruột thực với lồi điển hình V cholerae, V alginolyticus, V vulnificus V parahaemolyticus cảm nhiễm đơn loài theo chủng riêng biệt (Bảng 2.4) tổ hợp kết hợp – chủng vi khuẩn (Bảng 2.5) tôm thẻ chân trắng bệnh trọng lượng 10 – 12gram Mỗi nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần Tơm bố trí hệ thống bể nhựa 80L với mật độ 40 tơm/bể Tất thí nghiệm cảm nhiễm thực phương pháp tiêm xoang tim-gan tụy theo dõi tỷ lệ chết, dấu hiệu bệnh lý số tiêu chất lượng nước thời gian 14 ngày Từ xác định giá trị gây chết 50% khả gây bệnh chủng vi khuẩn tôm thẻ chân trắng Giá trị LD50 tính theo cơng thức: LD50 = 10n-PD cfu/mL Trong n: số mũ thấp vi khuẩn gây chết 50% tơm thí nghiệm Khoảng cách tỷ lệ (proportionate distance, PD) hai nồng có tỷ lệ chết lớn 50% nhỏ 50% tính theo cơng thức sau: PD = (Tỷ lệ chết > 50%) - 50%/(Tỷ lệ nhiễm > 50%) - (Tỷ lệ nhiễm < 50%) Bảng 2.4 Bố trí nghiệm thức cảm nhiễm đơn loài Chủng vi khuẩn Nồng độ (CFU/mL) Tôm TN Đối chứng 240 - V alginolyticus CM3IC1 240 0,78×103; 104; 105; 106 V cholerae CM3HPTB1 240 0,97×103; 104; 105; 106 V vulnificus CM2HPA4 V parahaemolyticus BTIA1 240 240 0,7×103; 104; 105; 106 0,39×103; 104; 105; 106 Bảng 2.5 Bố trí nghiệm thức tổ hợp chủng vi khuẩn Vibrio Tổ hợp chủng vi khuẩn Đối chứng (Không vi khuẩn) V alginolyticus CM3IC1 V cholerae CM3HPTB1 V vulnificus CM2HPA4 V alginolyticus CM3IC1 V cholerae CM3HPTB1 V parahaemolyticus BTIA1 V alginolyticus CM3IC1 V vulnificus CM2HPA4 V parahaemolyticus BTIA1 V cholerae CM3HPTB1 V vulnificus CM2HPA4 V parahaemolyticus BTIA1 V alginolyticus CM3IC1 V vulnificus CM2HPA4 V cholerae CM3HPTB1 V parahaemolyticus BTIA1 Tôm TN Nồng độ 300 - 240 103; 104 105; 106 240 103; 104 105; 106 240 103; 104 105; 106 240 103; 104 105; 106 240 103; 104 105; 106 2.2.4 Xác định khả lây nhiễm vi bào tử trùng EHP tôm thẻ chân trắng Khả lây nhiễm EHP tôm thẻ chân trắng (10 – 12gram) thực thơng qua thí nghiệm gây nhiễm bào tử với nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nghiệm thức (1) đối chứng âm (không cảm nhiễm EHP), (2) nuôi nhốt chung với tôm nhiễm bệnh theo tỷ lệ tôm bệnh: tôm khỏe (1:10), (3) nguồn nước bổ sung EHP mật độ 3,25×105 bào tử/L (4) thức ăn trộn EHP mật độ 0,5×105 bào tử/gram Mỗi nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần Tơm bố trí hệ thống bể nhựa 80L với mật độ 40 tơm/bể Thí nghiệm theo dõi thời gian 14 ngày theo dõi hàng ngày ghi nhận tỷ lệ chết, quan sát dấu hiệu bệnh lý tiêu môi trường nước (nhiệt độ, oxy hoà tan, pH, độ kiềm-kH, NO2, NH4/NH3+) Thu mẫu tôm định kỳ ngày/lần hết ngày thứ 14 để xác định sự lây nhiễm EHP tơm phương pháp Realtime-PCR Kết thúc thí nghiệm, thu tất mẫu tôm bể thực phân tích mơ học Realtime-PCR 2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng chất kháng Vibrio spp lên bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng 2.3.1 Đánh giá khả kháng khuẩn, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) thảo dược Hoạt tính kháng khuẩn, MIC MBC chất chiết xuất thảo dược từ ổi (P guajava) diệp hạ châu (P urinaria L) rau mui (W biflora (L.) DC) thực chủng vi khuẩn đại diện thuộc loài vi khuẩn V cholerae, V alginolyticus, V vulnificus V parahaemolyticus Hoạt tính kháng khuẩn chiết xuất thảo dược phát phương pháp khuếch tán qua giếng thạch nồng độ 25, 50 100 mg/mL (Magaldi et al., 2004) MIC MBC chất chiết xuất xác định theo phương pháp Oonmetta-aree et al., (2016) nồng độ pha loãng giảm dần theo số từ 25– 0,024 mg/mL 2.3.2 Sử dụng thảo dược phịng bệnh đường ruột tơm thẻ chân trắng Đánh giá tác động thảo dược lên tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng số tiêu miễn dịch Thí nghiệm bố trí hồn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức, nghiệm thức lần lặp lại Bao gồm nghiệm thức bổ sung thảo dược phần ăn tôm thẻ bao gồm: bổ sung cao chiết ổi tỷ lệ 1% (O1, O2, O3), bổ sung cao chiết diệp hạ châu tỷ lệ 1% (DHC1, DHC2, DHC3), bổ sung cao chiết hỗn hợp tỷ lệ ổi 0,5% diệp hạ châu 0,5% vào thức ăn (HH1, HH2, HH3) nghiệm thức đối chứng cho ăn thức ăn thông thường (ĐC1, ĐC2, ĐC3) Phương pháp bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn thực theo nghiên cứu Hồng Mộng Huyền ctv., (2017) Thức ăn sau phối trộn trữ nhiệt độ 4°C làm tuần Tơm bố trí cho ăn theo nhu cầu ngày với tần suất cho ăn lần/ngày (vào khoảng thời gian 8; 12; 16; 20 giờ) Theo dõi thí nghiệm tuần, kiểm tra số tiêu chất lượng nước nhiệt độ, oxy hoà tan, pH, độ kiềm-kH, NO2, NH4/NH3+; tỷ lệ sống đánh giá tốc độ tăng trưởng tôm thông qua số tiêu bao gồm: Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối DWG (g/ngày) = (Wf-Wi)/T; Tốc độ tăng trưởng đặc biệt SGR (%/ngày) = {(lnWf-lnWi) / T} ×100; Hệ số tiêu tốn thức ăn FCR = [Lượng thức ăn cho ăn /(Wf -Wi)], đó: Wf khối lượng cuối cùng, Wi khối lượng ban đầu T tổng thời gian thí nghiệm Tỷ lệ sống (%) = (số lượng tôm thời điểm kết thúc thí nghiệm / số lượng tơm thời điểm bố trí thí nghiệm) ×100 Thu mẫu để phân tích tổng mật số vi khuẩn Vibrio spp gan tuỵ ruột tiêu miễn dịch vào vào tuần thí nghiệm Các tiêu miễn dịch phân tích bao gồm: tổng số tế bào máu (total hemocyte count- THC) (Le Moullac et al., 1997), hoạt tính phenoloxidase (PO) (Hernández-Lospez et al., 1996) Hiệu thảo dược phòng bệnh đường ruột Sau tuần bổ sung chất chiết xuất ổi diệp hạ châu, tôm cảm nhiễm với tổ hợp vi khuẩn V parahaemolyticus; V cholerae; V alginolyticus (ACV) liều 1,05x105 CFU/mL Mỗi nghiệm thức theo dõi ghi nhận dấu hiệu lâm sàng, số lượng tôm chết hàng ngày vịng 14 ngày thí nghiệm 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn cách sử dụng phần mềm Excel, so sánh sự khác biệt tiêu chất lượng nước, tỷ lệ sống, tiêu tăng trưởng, mật số vi khuẩn Vibrio tiêu miễn dịch phân tích ONE-WAY ANOVA nhân tố CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Dấu hiệu bệnh lý Nghiên cứu thu mẫu tổng số 63 ao tơm thẻ chân trắng bệnh đường ruột, có 39 ao ni thu 03 huyện: Đầm Dơi, Cái Nước, Phú Tân, tỉnh Cà Mau; 10 ao nuôi huyện Mỹ Xuyên Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng 14 ao ni thu huyện Thạnh Phú, Bến Tre Các dấu hiệu bệnh lý tôm bệnh đường ruột thường biểu gan tụy đường ruột, có dấu hiệu ghi nhận gan tụy gan sưng, nhạt màu gan teo nhạt màu với tỷ lệ ghi nhận mẫu tôm bệnh 34,75% 31,31% Đồng thời, đường ruột ghi nhận nhóm dấu hiệu bao gồm phân trắng với tỷ lệ 14,7%, ruột rỗng/đứt khúc 33,65% cao với 59,71% dấu hiệu phân lỏng Tùy vào ao mẫu thu mà mẫu tơm bệnh biểu từ nhiều dấu hiệu bệnh lý khác với tỷ lệ theo nhóm dấu hiệu Trong đó, gan teo, nhạt màu, phân lỏng gan sưng, nhạt màu, phân lỏng chiếm tỷ lệ cao 23,16% 21,85% tôm bị bệnh đường ruột Kế đến dấu hiệu phân lỏng với 14,47%, gan sưng, nhạt màu, ruột rỗng/đứt khúc 12,9%, ruột rỗng/đứt khúc 12,36%; gan teo, nhạt màu, ruột rỗng 8,15% thấp dấu hiệu phân trắng với tỷ lệ phát 7,2% 3.2 Kết quan sát ký sinh trùng Kết quan sát cho thấy mẫu tơm thẻ có dấu hiệu bệnh lý đường ruột có 77,78% số mẫu ghi nhận vermiform diện gan tụy đường ruột tôm 14,29% tổng số mẫu nhiễm trùng hai tế bào Gregarine đường ruột 41,27% nhiễm vi bào tử trùng EHP Các mẫu tôm nhiễm Vermiform Gregarine nghiên cứu thường khơng có dấu hiệu biểu rõ qua dấu hiệu tơm chậm lớn, cịi cọc, mềm vỏ, đục mềm ốp thân; đường ruột đứt khúc không liên tục, phân lỏng có màu vàng nâu ruột rỗng kèm theo số biểu thay đổi màu sắc kích thước khối gan tụy Các 10 bào tử trưởng thành nhận dạng thông qua phương pháp soi tươi qua hình oval đặc trưng với khơng bào nhỏ đầu cực bắt màu tím/xanh nhuộm với Giemsa Tất mẫu tôm kiểm tra dương tính thơng qua phương pháp RT-PCR, 3.3 Mô bệnh học tôm bệnh đường ruột Qua kết thu mẫu ao nuôi nghiên cứu cho thấy tơm ao xuất có nhóm biểu dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như: (1) Gan tụy sưng, nhạt màu: gia tăng khoảng cách rõ rệt ống gan tụy, giảm tế bào biểu mô B, R, F; cấu trúc biểu mô ống gan tụy đứt gãy Một số mẫu, ống gan tụy có dấu hiệu teo lại, khơng có sự diện tế bào biểu mô với sự tập trung tế bào máu lòng ống gan tụy quan sát tế bào bị bong tróc (2) Gan tụy, teo dai, ruột rỗng: khơng có hoạt động phân bào tế bào E, ống gan tụy teo, giảm số lượng tế bào B, R, F; tế bào biểu mơ gan tụy thối hóa, bong tróc rớt vào lịng ống gan tụy; nhân tế bào trương to; melanin hóa với sự tập trung tế bào máu xung quanh ống gan tụy (3) Hội chứng phân trắng: ống gan tụy cấu trúc hình sao, tế bào biểu mơ thối hóa bị ly giải bong tróc rơi vào lịng ống, phần gần ống gan tụy có sự xâm nhập nghiêm trọng tế bào máu với tượng melanin hóa Một số ống gan tụy teo lại, biểu mô số ống nhỏ dần, giảm độ dày lịng mạch phình Đồng thời, phát vermiform lịng ống 3.4 Mơ bệnh học tôm nhiễm vi bào tử EHP Kết phân tích mơ bệnh học mẫu tơm bệnh chậm lớn EHP ghi nhận số biến đổi mặt cấu trúc sự tăng lên khoảng cách ống gan tụy vùng ngoại biên, ống gan tụy bị biến đổi cấu trúc, cấu trúc hình sao, tế bào biểu mơ ống gan tụy bị ly giải thối hóa, phân mảnh rơi vào lòng ống với sự tập trung tế bào máu Ngồi ra, tơm nhiễm EHP cho thấy sự giảm số 11 lượng rõ rệt tế bào biểu mô B, R, F; tế bào biểu mô ống co lại số lòng ống chứa mãnh vỡ bị hoại tử EHP ghi nhận xuất dạng thể vùi mang cấu trúc ưa axit nằm tế bào chất tế bào biểu mô gan tụy bào tử tự giải phóng vào lịng ống EHP từ tế bào biểu mô bị tách bong 3.5 Kết phân lập định danh vi khuẩn Vibrio sp Tổng số 82,54% mẫu tôm bệnh nhiễm vi khuẩn Vibrio sp., tỷ lệ đơn chiếm cao (47,62%), đa nhiễm (nhiễm kép, nhiễm đến loài) ghi nhận mức cao (34,92%) Kết phân lập tổng số 102 chủng vi khuẩn Vibrio spp thuộc loài khác bao gồm V cholerae, V alginoloyticus, V harveyi, V vulnificus V parahaemolyticus phân loại định danh dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc mơi trường TCBS TSA+, số tiêu sinh lý – sinh hóa bản, test kit API 20E kết hợp với giải trình tự gen 16S rRNA Bảng 3.1: Kết phân lập tỷ lệ nhóm Vibrio spp tơm thẻ chân trắng Lồi V parahaemolyticus V harveyi Tỷ lệ (%) 10,7 5,9 V V V vulnificus cholerae alginolyticus 15,7 17,7 50 3.6 Thí nghiệm xác định độc lực vi khuẩn Vibrio spp 3.6.1 Xác định giá trị LD50 chủng Vibrio spp đơn loài Chủng vi khuẩn V cholerae CM3HPTB1 chủng V alginolyticus CM3IC1 phân lập tử tôm bị hội chứng phân trắng không gây chết tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm phương pháp tiêm nồng độ 103 – 106 CFU/mL Cả hai chủng vi khuẩn gây biểu bệnh lý tương đồng tất nghiệm thức cảm nhiễm với dấu hiệu gan tụy sưng nhạt màu, phân lỏng, ruột rỗng hay bị đứt đoạn sau 10 ngày ngày cảm nhiễm tương ứng với chủng vi khuẩn 12 Chủng vi khuẩn V vulnificus CM2HPA4 thể khả gây chết cao tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm phương pháp tiêm Nồng độ gây chết 50% (LD50) vi khuẩn V vulnificus thí nghiệm 1,5 × 104 CFU/mL Trên tôm cảm nhiễm, V vulnificus CM2HPA4 gây số biểu bệnh đường ruột tôm thẻ chân trắng thu từ ao ni, điển hình đường ruột đứt khúc rỗng ruột kèm theo gan tụy biểu nhạt màu, gan sưng to, mềm nhũn có dịch Giá trị LD50 tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm V parahaemolyticus BTIA1 phân lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng nghiên cứu xác định 2,7 × 105 CFU/mL Tôm cảm nhiễm V parahaemolyticus chủng BTIA1 dấu hiệu gan tụy sưng, nhạt màu; số tơm có dấu hiệu gan tụy teo, dai, ruột rỗng 3.6.2 Xác định giá trị LD50 chủng Vibrio spp trắng kết hợp đa loài Ở tất nghiệm thức cảm nhiễm với tổ hợp vi khuẩn ghi nhận tỷ lệ chết khác theo tổ hợp khác nhau, số dấu hiệu điển hình theo tổ hợp cảm nhiễm (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Tỷ lệ chết tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm tổ hợp vi khuẩn Vibrio spp sau 14 ngày Tổ hợp vi khuẩn Đối chứng Nồng độ (CFU/mL) Tỷ lệ chết (%) 0 13,3 13,3 26,7 10 33,3 103 10 10 V alginolyticus, V cholerae, V vulnificus (ACV) V alginolyticus, V cholerae, V parahemolyticus 10 10 23,3 23,3 10 10 13 Dấu hiệu bệnh lý Bình thường Gan tụy sưng, nhạt màu, thức ăn đường tiêu hóa không liên tục, phân lỏng phân trắng Gan tụy sưng, nhạt màu, thức ăn đường tiêu hóa khơng liên tục, phân (ACP) V alginolyticus, V vulnificus, V parahemolyticus (AVP) V cholerae, V vulnificus, V parahemolyticus (CVP) V alginolyticus, V cholerae, V vulnificus, V parahemolyticus (ACVP) 106 26,7 lỏng phân trắng 10 13,3 104 23,3 33,3 Gan tụy sưng, nhạt màu, thức ăn đường tiêu hóa khơng liên tục rỗng ruột 43,3 10 104 33,3 43,3 105 50 106 83,3 10 10 10 104 6,7 6,7 105 10 106 10,3 Gan tụy sưng, nhạt màu, thức ăn đường tiêu hóa khơng liên tục rỗng ruột Gan tụy sưng, nhạt màu, thức ăn đường tiêu hóa khơng liên tục hoặc, phân lỏng Tương tự thí nghiệm cảm nhiễm đơn lồi tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm với tổ hợp vi khuẩn dấu hiệu thể đặc trưng theo tổ hợp Các dấu hiệu gan tụy biểu rõ tơm cảm nhiễm với tổ hợp có vi khuẩn VP (AVP CVP) biểu phân lỏng ghi nhận nhiều tôm cảm nhiễm với tổ hợp có vi khuẩn AC (ACV ACP) Đặc biệt, tôm cảm nhiễm với tổ hợp vi khuẩn ACV ACP, nghiên cứu ghi nhận dấu hiệu bệnh lý đường ruột tơm có màu trắng sữa thải phân bên tương tự với tơm bị hội chứng phân trắng thu ngồi tự nhiên 3.7 Kết nhận diện gen độc lực chủng vi khuẩn Vibrio spp Kết khảo sát cho thấy tất chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập tôm hội chứng phân trắng mang gen độc lực Trong đó, chủng vi khuẩn V alginolyticus CM3IC1 ghi nhận mang gen độc lực toxRS, chủng V vulnificus CM2HPA4 mang gen toxR toxRS; chủng V cholerae CM3HPB1 mang gen PirBVP tlh; V parahaemolyticus BTIA1 có mang gen PirBVP, toxR toxRS 14 3.8 Khả lây truyền gây bệnh EHP tôm thẻ chân trắng Sau 14 ngày cảm nhiễm chứng minh EHP có khả lây truyền qua hình thức ni nhốt chung, nguồn nước nhiễm bào tử đường tiêu hóa (cho ăn), lây truyền nhanh xác định hình thức ni nhốt chung Tơm cảm nhiễm bơi lội, phản ứng chậm với tiếng động, giảm bỏ ăn so với nghiệm thức đối chứng Tôm bỏ ăn, mềm vỏ, còi cọc, sậm màu xuất nhiều điểm sắc tố vỏ Khối gan tụy tôm chuyển sang màu nâu nhạt, nhũn, xanh rêu, trắng sữa teo dai, ruột rỗng, chứa thức ăn ruột ngắt qng, phân tơm bị xoắn lị xo, xuất bọt khí, có chứa dịch màu vàng nhạt đến vàng nâu nâu đỏ Mô bệnh học gan tụy tôm nghiệm thức lây nhiễm EHP ghi nhận có biến đổi cấu trúc, sự ảnh hưởng mức độ tế bào với số biểu đặc trưng ống gan tuỵ cấu trúc hình giảm số lượng tế bào B, R, tế bào biểu mơ bong tróc rơi vào lịng ống sự tập trung tế bào máu xung quanh ống gan tụy Sau 14 ngày cảm nhiễm việc quan sát thể vùi nhiễm EHP dày đặc dạng bào nang giai đoạn cuối G2 đầu G3 Ngồi ra, số vùng gan tụy tơm ghi nhận tập trung cụm bào tử EHP 3.9 Kết sử dụng số loại thảo dược để phịng bệnh Vibrio spp phân lập tơm thẻ chân trắng 3.9.1 Đánh giá khả kháng khuẩn số loại thảo dược nhóm Vibrio spp phân lập Diệp hạ châu (P urinaria L) có hoạt tính kháng khuẩn cao tất mười chủng phân lập với vòng kháng khuẩn dao động từ 12,7 đến 24,85 mm, ổi (P guajava) từ 09 - 22,95 mm thấp chiết xuất mui W biflora (L.) DC với đường kính vịng vơ trùng dao động khoảng từ – 16,45mm 3.9.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 15 Trong số chất chiết xuất từ thảo dược thử nghiệm, ổi (P guajava) diệp hạ châu (P urinaria L) với hoạt tính kháng khuẩn cao chọn để xác định MIC MBC Kết giá trị MIC cao chiết xuất diệp hạ châu (P urinaria L) 0,2 mg/mL V parahaemolyticus BTIA1, V harveyi CM3HPA2, V alginolyticus CM3IC1 V alginolyticus CM3HPC1, giá trị MBC 0,78; 0,39; 0,39; 1,56 mg/mL, tương ứng Cụ thể, tỷ lệ MBC/MIC cao dịch chiết diệp hạ châu (P urinaria L) V alginolyticus CM3IC1 giá trị tỷ lệ V parahaemolyticus BTIA1, V cholerae CM3HPTB1, V cholerae CM1HPB1, V alginolyticus STIC1, V alginolyticus CM2IC1 giá trị chủng lại 3.9.3 Kết bố trí thí nghiệm thảo dược phịng bệnh Vibrio spp phân lập tôm thẻ chân trắng Sau tuần thí nghiệm, nghiệm thức cho ăn thảo dược có tốc độ tăng trưởng, tăng trọng không nhiều so với đối chứng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p >0,05) Tuy nhiên, tỷ lệ sống nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p