Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học của fucoidan được phân lập từ rong nâu sargassum mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Trần Bảo Huy ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI THEO CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT KHÁC NHAU C h u y ê n n g ành : Mã số: Hố phân tích 8440118 LUẬ N VĂN THẠ C SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚN G DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Đức Thịnh PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Hà Nội 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Phạm Đức Thịnh PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Các số liệu nêu luận văn trung thực Những kết luận khoa học luận văn chưa cơng bố cơng trình khác Nha Trang - 2021 Tác giả Nguyễn Trần Bảo Huy LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận quan tâm giúp đỡ quý báu thầy cô, bạn bè đồng nghiệp Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Phạm Đức Thịnh PGS.TS Trần Thị Thanh Vân tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ TS Cao Thị Thúy Hằng; ThS Đinh Thành Trung CN Nguyễn Thị Khánh Vy tận tình giúp đỡ, động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện mặt quý thầy cô, anh chị học viên cao học lớp CHE18 CHE19 công tác học tập Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Ban lãnh đạo Khoa Hóa học tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành học phần luận văn thủ tục cần thiết Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục Đào tạo Khánh Hòa, Ban lãnh đạo trường THPT Lý Tự Trọng, anh chị em đồng nghiệp tạo điều kiện công việc, động viên trợ giúp để tơi dành thời gian chun tâm học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Nha Trang - 2021 Tác giả Luận văn Nguyễn Trần Bảo Huy DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT NMR IR HPLC CS IC50 MeOH EtOH TFA DPPH Man Fuc Gal Gluc Xyl GluA ManA GuluA DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1 Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố số chi rong nâu 10 Hình Phân tử Alginic acid .12 Hình Cấu trúc Laminaran .13 Hình Một đoạn cấu trúc Fucoidan 13 Hình Cấu trúc fucoidan có sunfat vị trí C-4 liên kết 3-O-linked từ lồi rong E Kurome mơ tả vào năm 1991 17 Hình Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus 18 Hình Cấu trúc fucoidan từ Sargassum polycystum 30 Hình Mảnh cấu trúc fucoidan chiết từ rong T decurrens 32 Hình Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium 34 Hình Rong khơ S mcclurei 36 Hình 2 Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu nước nóng .38 Hình Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu theo Bản quyền Nga (Patent WO 2005/014657) 39 Hình Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu dung dịch CaCl2 2% 40 Hình Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có hỗ trợ enzyme 41 Hình Cơ chế hịa tan xenlulose BmimCl 41 Hình Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu chất lỏng ion 42 Hình Mơ hình cấu trúc thành tế bào rong nâu 50 Hình 3 Hình điện di C-PAGE fucoidan chiết phương pháp chiết khác 53 Hình Phổ hồng ngoại IR mẫu fucoidan thơ chiết từ TN1 62 Hình Phổ hồng ngoại IR mẫu fucoidan thô chiết từ TN2 63 Hình Phổ hồng ngoại IR mẫu fucoidan thô chiết từ TN3 64 Hình Phổ hồng ngoại IR mẫu fucoidan thơ chiết từ TN4 65 Hình Phổ hồng ngoại IR mẫu fucoidan thô chiết từ TN5 65 Bảng 1 Thành ph Bảng Thành phần hóa học Bảng Cấu trúc Bảng Hàm lượng, thành phần hóa học KLPT trung bình mẫu fucoidan phân lập từ loài rong nâu Việt Nam Bảng Hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 ung thư mô liên kết RD Bảng Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan phổ hồng ngoại Bảng Kết phân tích thành phần hóa học rong nguyên liệu Bảng Hiệu suất thu nhận fucoidan từ phương pháp chiết Bảng 3 Hàm lượ Bảng Thành ph Bảng Nhận xét Bảng 6.Thành ph Bảng 7.Kết p Bảng 8.Hàm lượ Bảng 9.Khả DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Đường chuẩn carbohydrate tổng số 79 Phụ lục Đường chuẩn Fucose 80 Phụ lục Đường chuẩn Galactose .81 Phụ lục Đường chuẩn Glucose 82 Phụ lục Đường chuẩn Sulfate 83 Phụ lục Đường chuẩn Uronic acid 84 Phụ lục Đường chuẩn Poly phenol 85 Phụ lục Đường chuẩn Protein 86 Phụ lục Đường chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa tổng số 87 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu rong biển 1.1.2 Giới thiệu rong nâu 1.1.3 Một số thành phần hóa học rong nâu 1.1.3.1 Polysaccharide 1.1.3.2 Hợp chất Phenolic 1.1.3.3 Hợp chất Carotenoid 1.1.3.4 Hợp chất Terpenoid 1.1.3.5 Protein 1.2 TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN 1.2.1 Thành phần hóa học fucoidan 1.2.2 Đa dạng cấu trúc fucoidan 1.2.3 Hoạt tính sinh học fucoidan 1.2.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn kháng virus 1.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa 1.2.3.3 Hoạt tính kháng u điều hịa miễn dịch 1.2.3.4 Hoạt tính chống đơng tụ máu chống huyết khối 1.2.3.5 Chống lại bệnh gan 1.2.3.6 Giảm lipid máu 1.2.4 Ứng dụng fucoidan 1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN 1.3.1 Phương pháp chiết fucoidan axit pH 2-3 23 1.3.2 Phương pháp chiết fucoidan nước nóng 23 1.3.3 Phương pháp chiết fucoidan dung dịch CaCl2 2% 23 1.3.4 Phương pháp chiết fucoidan ethanol 24 1.3.5 Phương pháp chiết fucoidan chất lỏng ion 24 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 26 1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan giới .26 1.4.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan Việt Nam 28 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 35 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 35 2.1.1 Rong nâu Sargassum mcclurei 35 2.1.2 Chuẩn bị hóa chất thiết bị .36 2.1.2.1 Hóa chất 36 2.1.2.2 Thiết bị .37 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Phương pháp chiết fucoidan 37 2.2.1.1 Phương pháp chiết fucoidan nước nóng 37 2.2.1.2 Phương pháp chiết fucoidan dung dịch HCl (pH:2-3) 38 2.2.1.3 Phương pháp chiết fucoidan dung dịch CaCl2 2% 39 2.2.1.4 Phương pháp chiết fucoidan có hỗ trợ enzyme 40 2.2.1.5 Phương pháp chiết fucoidan chất lỏng ion .41 2.2.2 Phương pháp xác định thành phần hóa học fucoidan 42 2.2.2.1 Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 42 77 Bitter T., Muir H.M., 1962, A modified uronic acid carbazole reaction., Anal Biochem, 4, 330–334 [60] Velioglu Y.S., Mazza G., Gao L., Oomah B D., 1998, Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products., J Agric Food Chem., 46(10), 4113–4117 [61] Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent., J biol Chem., 193, 265–275 [62] Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., 1999, A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum., Carbohydr Res., 320, 108–119 [63] Hang T T Cao, Maria D Mikkelsen, Mateusz J Lezyk, Ly M Bui, Van T T Tran, Artem S Silchenko, Mikhail I Kusaykin, Thinh D Pham, Bang H Truong, Jesper Holck and Anne S Meyer, 2018, Novel Enzyme Actions for Sulphated Galactofucan Depolymerisation and a New Engineering Strategy for Molecular Stabilisation of Fucoidan Degrading Enzymes, Mar.Drugs, 16, 422 [64] Prieto P., Pineda M., Aguilar M., 1999, Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: Specifi c application to the determination of vitamin E., Anal Biochem., 269, 337–341 [65] Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Công Thùy Trâm, Đỗ Thị Phương, Vũ Thị Thu Phương, Thị Nguyễn Nga, Truan Gilles, Đỗ Thị Thảo, 2017, Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan in vitro dịch chiết từ phèn đen (phyllanthus reticulates poir.), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15, 251–258 [66] Deniaud-Bouët E., Kervarec N., Michel G., Tonon T., Kloareg B., Hervé C., 2014, Chemical and enzymatic fractionation of cell walls from Fucales: Insights into the structure of the extracellular matrix of brown algae., Ann Bot., 114(6), 1203–1216 [67] [68] Zhang Q., Yu P., Li Z., Zhang H., Xu Z., Li P., 2003, Antioxidant 78 activities of sulfated polysaccharide fractions from Porphyra haitanesis., J Appl Phycol., 15, 305–310 Yoshizawa Y., Ametani A., Tsunehiro J., Nomura K., Itoh M., 1995, Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from a marine alga (Prophyra yezoensis): Structure-function relationships and improved solubility., Biosci Biotechnol Biochem., 59, 1933–1937 [69] 79 PHỤ LỤC Phụ lục Đường chuẩn carbohydrate tổng số Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ D-glucose Nồng độ D-glucose (µg/ml) 20 40 80 120 160 OD 490 200 -50 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate tổng số Phương trình: D = 0,0073C + 0,0294 tuyến tính khoảng 0-200µg/ml Với giá trị R2= 0,9975 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µg/ml) D: mật độ quang 80 Phụ lục Đường chuẩn Fucose Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ fucose Nồng độ fucose Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng fucose Phương trình có dạng: D = 0,1979C + 20,203 Với giá trị R2= 0,9987 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) D: Diện tích pic 81 Phụ lục Đường chuẩn Galactose Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ galactose Nồng độ galactose (µ Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng galactose Phương trình có dạng: D = 0,4587C + 29,042 Với giá trị R2= 0,9993 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) D: Diện tích pic 82 Phụ lục Đường chuẩn Glucose Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ glucose Nồng độ galactose (µmol/L) 250 500 1000 2000 5000 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng glucose Phương trình có dạng: D = 0,358C + 39,759 Với giá trị R2= 0,9983 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) D: Diện tích pic 83 Phụ lục Đường chuẩn Sulfate Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ K2SO4 Nồng độ K2SO4 (µg/ml) 100 250 500 750 1000 1250 OD 360 1500 -500 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate Phương trình: D = 0,0004C+0,0057, tuyến tính khoảng 0-1500µg/ml Với giá trị R2 = 0,9974 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) D: mật độ quang 84 Phụ lục Đường chuẩn Uronic acid Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ D-glucuronic acid Nồn D-glucu (µg Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng uronic acid Phương trình: D = 0,0058C+0,0198, tuyến tính khoảng 0-100µg/ml Với giá trị R2= 0,9966 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) D: mật độ quang 85 Phụ lục Đường chuẩn Poly phenol Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ phloroglucinol Nồng độ phloroglucinol (µg/ml) 10 20 40 60 80 100 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng poly phenol Phương trình: D = 0,0144C-0,0228 tuyến tính khoảng - 100µg/ml Với giá trị R2= 0,9978 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) D: mật độ quang 86 Phụ lục Đường chuẩn Protein Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA Nồng độ BSA (µg/ml) 20 40 60 80 100 120 0.400 0.350 OD 750 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 -20 -0.050 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein Phương trình: D = 0,003C-0,0169 tuyến tính khoảng 0-120µg/ml Với giá trị R2= 0,9939 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) D: mật độ quang 87 Phụ lục Đường chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa tổng số Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ ascobic acid Nồng độ Ascorbic aci (µg/ml) 10 20 40 60 80 OD 695 100 -20 Đồ thị đường chuẩn xác định Hoạt tính chống oxy hóa tổng số Phương trình: D = 0,0055C-0,0185 tuyến tính khoảng 0-100 µg/ml Với giá trị R2= 0,9965 ≈ ⇒ Có thể áp dụng Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) D: mật độ quang ... PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI 55 3.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN VỊ TRÍ CỦA NHĨM SULFATE TRÊN FUCOIDAN. .. việc chiết để thu nhận sản phẩm fucoidan có hoạt tính [11][12][13][14] Ở Vì vậy, chọn đề tài "Đánh giá biến đổi thành phần hóa học fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum mcclurei theo phương pháp. .. TRÊN FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI 60 3.6 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI