Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp tốc

Papain và Amylase là những enzym đã được sử dụng từ lâu ở nhiều nước trên thế giới dưới dạng các thực phẩm hoặc thuốc cổ truyền, thậm chí đã trở thành những huyền thoại về sự tuyệt diệu của chúng

MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 Đại cương amylase papain .4 1.1.1 Amylase 1.1.2 Papain 1.2 Một số sản phẩm thuốc có chứa papain amylase 14 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 15 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Hoá chất thuốc thử 16 2.1.3 Dụng cụ máy móc 17 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26 2.2.1 Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein phản ứng Biuret 26 2.2.2 Xác định hoạt độ Papain hỗn hợp PP1 27 2.2.3 Xác định hoạt độ papain hỗn hợp PP2 33 2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase hỗn hợp 36 2.3 BÀN LUẬN 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 3.1 Kết luận 46 3.2 Đề xuất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Papain Amylase enzym sử dụng từ lâu nhiều nước giới dạng thực phẩm thuốc cổ truyền, chí trở thành huyền thoại tuyệt diệu chúng Papain có nước ép đu đủ xanh cứu sống em bé người Ấn Độ bị ngạt thở mắc nghẽn miếng thịt to họng Sự tuyệt diệu amylase chỗ cần thìa nước ép giá đỗ xanh làm loãng giảm thể tích bát bột nấu chín trẻ em xuống cịn nửa, giá trị dinh dưỡng khơng thay đổi hiệu hấp thu tăng lên [14] Trong thời gian qua nhờ thành tựu phát triển khoa học đặc biệt dược học, nghiên cứu sâu ứng dụng enzym phát triển Ngoài tác dụng thuỷ phân tinh bột protein, hai enzym cịn có tác dụng chống viêm, làm da hiệu Ngày nay, bên cạnh việc chiết tách, tinh chế, người ta phải đưa chế phẩm enzym vào dạng bào chế thích hợp nhằm phân liều xác, ổn định hoạt chất đại hoá sản phẩm Papain amylase phối hợp thích hợp nhằm bổ trợ tiêu hoá thành phần hoá học thức ăn mức tối ưu theo nhu cầu dinh dưỡng số đối tượng bị rối loạn tiêu hoá, trẻ em suy dinh dưỡng người lớn có bệnh đường tiêu hoá Hỗn hợp trở thành sản phẩm thuốc sử dụng nhiều nước giới, chiếm tỷ trọng lớn nước phát triển có tỷ lệ trẻ em suy dinh dưỡng cao Việt Nam nước phát triển có tỷ lệ trẻ em SDD tuổi cao, đến năm 2004 26,4% số người có bệnh đường tiêu hoá cao, chủ yếu viêm dày, ruột Mặt khác nước ta có khí hậu nhiệt đới, cối quanh năm xanh tốt, nguồn nguyên liệu để thu papain amylase dồi Nhưng hàng năm phải nhập hàng triệu sản phẩm thuốc hỗn hợp papain amylase từ nước Mỹ, Pháp, Hàn Quốc, Nhật Bản ấn Độ Đó thực tế, điều khơng thể chấp nhận người dược sĩ điều kiện nguồn nguyên liệu để thu sản phẩm nước ta thuộc loại dồi dào, sẵn có -2- Để góp phần nghiên cứu triển khai biến chế phẩm enzym papain amylase thành sản phẩm thuốc có giá trị, ổn định đại, sản xuất Việt Nam, phục vụ số đông người bệnh có nhu cầu, chúng tơi tiến hành đề tài: “ Đánh giá biến đổi hoạt độ enzym hỗn hợp Papain Amylase dạng bột dạng dung dịch điều kiện lão hoá cấp tốc” với mục tiêu: đánh giá biến đổi hoạt tính enzym hỗn hợp điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm quy luật thay đổi hoạt độ enzym Từ có biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất nâng cao độ ổn định thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc thành thực -3- PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương amylase papain 1.1.1 Amylase Amylase [EC.3.2.1] thuộc nhóm enzym hydrolase có vai trị quan trọng việc thuỷ phân tinh bột thức ăn thành thành phần đơn giản Amylase xúc tác phân giải liên kết nội phân tử polysaccarid với tham gia nước có dịch tiêu hoá nước bọt, dịch dày , mơ theo phương trình sau: R-R' + H-OH  RH + R'OH Amylase có nguồn gốc động vật thực vật Ở người amylase sinh chủ yếu hai tuyến: tuỵ nước bọt Hiện nay, người ta biết có loại amylase, α-amylase, loại: β-amylase, γ-amylase (glucoamylase) thuỷ phân liên kết α-1,4-glucosid tinh bột, glycogen polysaccharid Các amylase lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân liên kết α-1,6-glucosid phân tử polysaccharid Sáu enzym amylase chia thành hai nhóm: endoamylase exoamylase [4]: - Endoamylase: gồm có α-amylase enzym khử nhánh Nhóm enzym khử nhánh chia thành hai loại: khử trực tiếp pullulanase (hay α-dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp transglucosylase (hay oligo1,6-glucosidase) amylo-1,6-glucosidase Các endoamylase thuỷ phân liên kết glucosid bên chuỗi polysaccharid -4- - Exoamylase:gồm β-amylase γ-amylase, enzym thuỷ phân tinh bột từ đầu cuối không khử chuỗi polysaccharid  Đặc điểm số amylase:  α -amylase (α−1,4−glucan−4−glucanohydrolase, EC.3.2.1.1) α-amylase enzym có khả thuỷ phân tinh bột, amylose amylopectin, glycogen, dextrin, endoenzym, có nước bọt dịch tuỵ máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột phần miệng, phần lớn tiêu hoá tinh bột ruột non α-amylase phân lập từ hầu hết động vật, hạt nảy mầm số loài nấm Aspergillus oryzae, từ số loại vi khuẩn không gây bệnh Bacillus subtilis ∗ Cơ chế tác dụng: α-amylase có khả phân cắt liên kết α-1,4glucosid chất cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90% maltose, lượng nhỏ D-glucose α-dextrin giới hạn phân tử lượng thấp (gồm - phân tử glucose chứa một liên kết α-1,6glucosid) Các liên kết α-1,6-glucosid chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ enzym Các giai đoạn trình thuỷ phân tinh bột α-amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: Tinh bột α-amylase dextrin phân tử lượng thấp (4-8 liên kết glucosid) - Giai đoạn đường hoá: Dextrin α-amylase tetra- trimaltose -5- di- monosaccharid  Tổng quát : Amylose α-amylase Maltose (di monosaccharid) oligosaccharid polyglucose maltotriose maltotetrose Khả dextrin hoá α-amylase cao, người ta cịn gọi αamylase amylase dextrin hố hay amylase dịch hố ∗ Tính chất: α-amylase protein phức tạp có chứa Ca 2+ αamylase có nguồn gốc khác nhau, thường có thành phần acid amin khơng hồn tồn giống loại α-amylase từ nguồn gốc thường có tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng Thành phần chung αamylase có chứa nhiều tyrosin, trytophan, acid glutamic acid aspartic Các acid amin có tính acid glutamic aspartic chiếm khoảng 1/4 lượng acid amin phân tử enzym, ngược lại, α-amylase có methionin có – 10 gốc cystein Các α-amylase có nguồn gốc khác có KLPT khác nhau: α-amylase từ tuỵ động vật có KLPT 4500 Da, α-amylase từ Bacillus subtilis có tác dụng giống α-amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến lần 9900 Da [4], [6] Nhìn chung, α-amylase có số đặc tính như: + Protein α-amylase có tính acid yếu; dễ tan nước, dung dịch muối cồn thấp độ + Điểm đẳng điện α-amylase nằm vùng pH 4,2 - 5,7 [3] + α-amylase metaloenzym, phân tử α-amylase có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, khơng 1-6 ngun tử gam Ca/mol Ca tham gia vào hình thành ổn định cấu trúc bậc ba enzym, trì hoạt động enzym [4] -6- + Hoạt động α-amylase hoạt hố ion Cl -, bị kìm hãm kim loại nặng Cu 2+, Ag+, Hg2+ pH tối thích 6,9 (α-amylase động vật); 4,7 - 5,4 (α-amylase thực vật – mầm lúa); 5,0 - 6,0 (α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis) [3] + Độ bền nhiệt α-amylase nguồn gốc khác không giống nhau, α-amylase nấm men vi khuẩn bền với nhiệt αamylase động vật thực vật [4]  β -amylase (α−1,4−glucan–maltohydrolase, EC.3.2.1.2) β-amylase enzym thuỷ phân tinh bột, diện phổ biến thực vật, đặc biệt hạt nảy mầm β-amylase xúc tác thuỷ phân cắt phân tử maltose khỏi đầu không khử chuỗi polysaccarid cách phân cắt liên kết α-1,4-glucosid KLPT β-amylase 152.000 Da 215.000 Da, bị ức chế iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, kim loại nặng Ag +, Hg2+, Cu2+, thuốc thử có chứa nhóm –SH pH tối thích 4,0 – 5,0 [4] β-amylase chịu nhiệt α-amylase bền với acid hơn, bị bất hoạt nhiệt độ 70oC [4]  γ -amylase (glucoamylase, α−1,4−glucan−4−glucanohydrolase, EC.3.2.1.3) γ-amylase enzym có khả thuỷ phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucosid Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucosid chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách phân tử glucose khỏi đầu khơng khử mạch polysaccharid Ngồi liên kết α-1,4 α-1,6 glucosid, glucoamylase cịn có khả thuỷ phân liên kết α-1,2 α-1,3 glucosid Do đó, glucoamylase có khả thuỷ phân hồn tồn tinh bột, glycogen, -7- amylopectin, dextrin, maltose thành glucose mà không cần có tham gia loại amylase khác [4] pH tối thích glucoamylase nằm vùng acid nhẹ 4,0-5,0 có loại glucoamylase có pH tối thích nằm vùng trung tính khoảng 6,0-7,5 [4]  Ứng dụng: Với vai trị enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, y tế nhiều lĩnh vực kinh tế khác Trong công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột, nấu rượu bia, chế tạo bánh kẹo Trong Y Dược, dùng để chế tạo glucose, dextrin uống tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ trợ tiêu hoá cho nhiều đối tượng khác Đặc biệt, gần người ta dùng amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dưỡng thể tích thức ăn cho trẻ em SDD Ngồi ra, có ý tưởng sử dụng amylase nhằm mục đích chống viêm phù nề ý tưởng cịn phải chứng minh thực tế 1.1.2 Papain Papain [EC.3.4.1.21] enzym thuỷ phân protein có nguồn gốc thực vật nghiên cứu nhiều tính chất chế hoạt động Papain chủ yếu tách chiết từ nhựa đu đủ xanh đu đủ Carica papaya L (Caricaceae) a- Cấu tạo hoá học: Papain endoprotease có chứa 16,1%N 1,2%S [4] Phân tử enzym có 212 acid amin khơng chứa methionin, khối lượng phân tử 23400 Da Mạch polypeptid Papain có đầu tận amin isoleucin, đầu tận -8- carboxyl asparagin, phân tử có liên kết disulfua (S−S) tạo gốc cystein nhóm –SH (sulfhydryl) tự vị trí 25, liên kết khơng có chức sinh học, làm tăng tính bền vững cấu trúc [4] Thành phần papain chưa hoạt hoá hỗn hợp protein cystein disulfid Khi hoạt hố papain KCN giải phóng nhóm thiol phân tử enzym β-thiocyanatalanin tương tác cyanid cystein Sau đó, β-thiocyanatalanin khép vịng tạo thành α-iminothiazolidin Khi có khơng khí, chế xảy theo chiều ngược lại tạo thành sản phẩm khơng hoạt hố Q trình hoạt hố papain khơng làm thay đổi cấu trúc khơng gian [4] N+H3 papa in C≡N papa in SSCH2CH SH + S COO− N+H3 CH2−CH CN− hoạt hoá Papain hoạt động COO− β−thiocyanatalanin O2 HC−NH2 S H2C NH CH COO− α−iminothiazolidin Hình1: Sơ đồ chế hoạt hố papain cyanid b- Cấu trúc không gian papain: -9- Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước trục o cấu trúc khơng gian chiều là: 36×48×36 A , mạch polypeptid bị gấp khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên “hốc đặc biệt” Trung tâm hoạt động nằm bề mặt “khe” này, nhóm sulfhydryl hoạt động cystein 25 nằm bên trái “khe” nhóm histidin 159 nằm bên phải “khe” Phần có cấu trúc xoắn α chiếm khoảng 20% tồn acid amin có phân tử [4] c- Hoạt tính enzym chế tác dụng: Đặc điểm quan trọng papain khả thuỷ phân protein đến tận acid amin Papain thuỷ phân protein thành polypeptid acid amin, đóng vai trị vừa endopetidase vừa exopeptidase [4] Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid: R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) R (-NH-CH-COOH)i + (H2N-CH-CO-)k i+k=n Các exopeptidase thuỷ phân peptid thành amino acid: R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) R (NH2-CH-COOH)n' + (H2N-CH-CO-)k' n' + k' = n So với protease có nguồn gốc động vật vi sinh vật khác, papain có khả thuỷ phân sâu hơn, dùng để thuỷ phân tiếp liên kết peptid lại sau thuỷ phân pepsin, trypsin hay chymotrysin Tính đặc hiệu chất papain rộng, papain có khả phân huỷ hầu hết liên kết peptid trừ liên kết với prolin với acid glutamic có nhóm carboxyl tự d- Sự hoạt hố papain: Papain cần có nhóm sulfhydryl tự để thể hoạt tính xúc tác Do trung tâm hoạt động papain có nhóm cystein 25 nitrogen bậc -10- ... tài: “ Đánh giá biến đổi hoạt độ enzym hỗn hợp Papain Amylase dạng bột dạng dung dịch điều kiện lão hoá cấp tốc? ?? với mục tiêu: đánh giá biến đổi hoạt tính enzym hỗn hợp điều kiện nhiệt độ cao,... mẫu xác định hoạt độ enzym theo phương pháp xác định hoạt độ enzym đánh giá biến đổi hoạt độ enzym biểu đồ riêng biệt thông qua theo dõi phần trăm (%) hoạt độ enzym (HđE) lại tốc độ (v) giảm HđE... đến hoạt tính enzym: -11-  Nhiệt độ: Papain enzym chịu nhiệt độ tương đối cao độ bền chịu nhiệt phụ thuộc vào dạng chế phẩm Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính 100oC Cịn dạng dung dịch papain