Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết từ tua sen hưng yên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG N N NC ÀN Ị ÀN C ẦN C ỌC C N À C ĐỊN N EN N D ƯN ẠC Đà Nẵng – Năm 2015 DỊC Y N ỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG N N NC ÀN Ị ÀN C D C ẦN ỌC C À C ĐỊN N EN DỊC ƯN Y N C u n n àn u s 60 44 01 14 N N ớn N n ẠC o ọ Đà Nẵng – Năm 2015 ỌC ẦN ẠN C Ờ C Đ N C ả T u n ả lu n v n ị oàn D ễm C C MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đố tượng mụ đí h nghiên cứu P n p p n Ý n n ứu ĩa k oa ọc thực tiễn đề tài Bố cụ lu n v n C ƯƠN TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SEN 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Mô tả sen 1.3 GI TRỊ S 1.3.1 C n 1.3.2 Một số DỤNG CỦ C Y SEN 10 ụn 10 t uố t s n 11 1.4 MỘT S NGHI N CỨU VỀ HOẠT T NH SINH HỌC CỦA SEN 15 1.4.1 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học sen giới 15 1.4.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học sen Việt Nam 18 C ƯƠN N Y N À 2.1 NGUY N LIỆU DỤNG CỤ H ƯƠN N NC 19 CHẤT 19 2.1.1 N uy n l ệu 19 2.1.2 T ết ị ụn ụ a ất 19 2.2 PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 20 2.2.1 C sở l t uyết p n p p ấp t ụ n uy n t 2.2.2 C sở l t uyết p n p p S 20 ết 22 2.2.3 C sở l t uyết p n p p GC-MS 29 2.2.4 C ết t 2.2.5 S k n p n p ps k ản m n 30 ột 33 2.3 C C NGHI N CỨU TH C NGHIỆM 36 2.3.1 S đồ 2.3.2 X ết tách 36 địn t n số 2.3.3 P n tí 2.3.4 X a l 36 địn lượn tan n 39 địn t n p ần a ọ tron 2.3.5 Khảo sát yếu tố ản ị ưởn đến qu tr n ết 40 ết tách 41 2.3.6 S đồ đ ều chế cao dichloromethane 43 2.3.7 C ạy s k ản m n 2.3.8 C ạy s k ột p ần ao C ƯƠN Ả À ao lorom t an 44 lorom t an 44 Ả N 46 3.1 K T QUẢ X C ĐỊNH C C CHỈ S H 3.1.1 H m lượn LÝ 46 m 46 3.1.2 H m lượn tro 46 3.1.3 H m lượn k m loạ 47 3.2 K T QUẢ ĐỊNH LƯ NG T NIN 47 3.3 K T QUẢ ĐO GC – MS X C ĐỊNH THÀNH PHẦN H HỌC TRONG C C DỊCH CHI T KH C NH U CỦ TU SEN 48 3.3.1 Thành phần hóa học ị ết n-hexane 48 3.3.2 Thành phần hóa học ị ết nz n 51 3.3.3 Thành phần hóa học ị ết loro orm 54 3.3.4 Thành phần hóa học ị ết t yl a tat 57 3.3.5 Thành phần hóa học ị ết m t anol 60 3.3.6 Thành phần hóa học ị ết t anol 63 3.3.7 T n an tron ợp ấu t đượ địn ị ết 66 3.4 KHẢO SÁT CÁC Y U T ẢNH HƯỞNG Đ N QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT CỦ DUNG M I ETHYL XET TE 69 3.4.1 Ản ưởng thời gian 69 3.4.2 Ản ưởng tỉ lệ r n-l ng 70 3.4.3 Ản ưởng nhiệt độ 70 ưn n n n ều lần với dung môi ethyl acetate 71 3.4.4 Kết chiết 3.5 KHẢO S T C C Y U T ẢNH HƯỞNG Đ N QU TR NH T CH CHẤT VỚI DUNG M I ETH NOL 72 3.5.1 Ản ưởng thời gian 72 3.5.2 Ản ưởng tỉ lệ r n-l ng 73 3.5.3 Ản ưởng nhiệt độ 74 3.5.4 Ản ưởng nồn độ t anol 75 ưn n n n ều lần với dung môi ethanol 76 3.5.5 Kết chiết 3.6 K T QUẢ PH N L P C O DICHLOMET N 76 3.6.1 Kết ạy s k ản m n 76 3.6.2 Kết ạy s k ột 78 N À NN Ị 82 K T LU N 82 KI N NGHỊ 83 D N Y C À ĐỊN Ả ĐỀ ÀI ( ản sao) D N Số hiệu Tên bảng bảng 2.1 C BẢN Trang Hóa chất s dụng q trình làm thí 20 nghiệm 2.2 Một số tỉ lệ un m ạy s k ản m n 3.1 Kết x địn độ m tua s n 46 3.2 Kết x địn 46 3.3 Kết 3.4 Kết địn lượn tan n tron m u tua s n k 47 3.5 T n p ần a ọ tron ị ết n-hexane 49 3.6 T n p ần a ọ tron ị ết nz n 52 3.7 T n p ần a ọ tron ị ết loro orm 55 3.8 T n p ần a ọ tron ị ết t yl axetate 58 3.9 T n p ần a ọ tron ị ết m t anol 61 3.10 T n p ần a ọ tron ị ết t anol 64 3.11 T n ấu t đượ địn 44 m lượn tro tron tua s n m lượn k m loạ tron tua s n ợp an tron 47 ị 66 ết 3.12 T n p ần a ọ tron p n đoạn TSD21-24 81 D N Số hiệu C ÌN Tên hình hình Trang 1.1 Mơ hình sen 1.2 C 2.1 Tua s n trướ v sau k 2.2 S đồ cấu tạo máy quang ph hấp thụ nguyên t AAS 21 2.3 Chiết b ng máy soxhlet 28 2.4 Thiết bị s c ký khí khối ph (GC-MS) Agilent 30 ộ p n tron ys n n ền 19 7890/5975C 2.5 S đồ ết tách 2.6 Dị ết tua s n trướ v sau k 36 địn lượn n 39 KMnO4 1N 2.7 S đồ đ ều chế cao chiết dichloromethane 43 3.1 S k đồ GC ị ết n- xan tua s n 48 3.2 S k đồ GC ị ết nz n tua s n 51 3.3 S k đồ GC ị ết loro orm tua s n 54 3.4 S k đồ GC ị ết t yl a tat tua s n 57 3.5 S k đồ GC ị ết m t anol tua s n 60 3.6 S k đồ GC ị ết t anol tua s n 63 3.7 Ản an đến 69 ưởng thờ m lượng cao chiết ethyl acetat 3.8 Ản ưởng tỉ lệ r n-l n đến m lượng cao chiết 70 m lượng cao chiết ethyl 71 ethyl acetate 3.9 Ản ưởng n ệt độ đến acetate 3.10 Ản ưởng số lần chiết đến k ố lượn n 3.11 un m Ản ưởn ao ết 72 t yl a tat thờ an đến m lượng cao chiết 73 ethanol 3.12 Ản ưởng tỉ lệ r n-l n đến hàm lượng cao chiết 73 ethanol 3.13 Ản ưởn n ệt độ đến m lượn ao ết 74 nồn độ đến m lượng cao chiết 75 ethanol 3.14 Ản ưởn ethanol 3.15 Ản ưởng số lần chiết đến m lượn ao ết 76 ethanol 3.16 C ết m u tron ệ un m 3.17 Kết k ạy s ản m n vớ lom t an - nướ 77 ệ un môi n- 77 hexan 3.18 Cột ạy s k sau k 3.19 C 3.20 C ất kết t n 79 3.21 S 80 p n đoạn t n v sau k k đồ p n đoạn TSD21-24 om uv o ạy ột 78 79 D N AAS CC C : P n –C CC p p p hấp thu nguyên t (Atomic Absorption Spectrophotometric) GC-MS : S c ký khí khối ph (Gas Chromatography Mass Spectrometry) PA : Tinh khiết phân tích TCCS : T u u n sở 73 Ả Nh n xét: k n t n ethanol t n t ời gian chiết khố lượng riêng chất t u t sau 120 phút khố lượn r n t n n ẹ nên thời gian thích hợp để chiết tách chọn 120 phút 3.5.2 Ản ởn ủ tỉ lệ r n-l n Chu n bị m u cho vào bình tam giác, m u cân xác khoản 10 am sau đ o un m thanol vào thể tí 50, 75, 100, 125, 150 ml Tiến hành chiết khoảng thời gian tốt t ay đ i ưn n n nhiệt độ 800C ọn 120 phút Đ m lọc cô cạn dịch chiết t u c n tỉ lệ r n-l ng khác n au đ m n ta kết Hình 3.12 Ả ỉ ắ -ỏ ethanol 74 Nh n t: K t ay đ i, thể tí t ay đ i thể tích dung mơi khố lượng chất chiết t n đến 10g/100ml khố lượng chiết t n n an sau đ t n n ẹ Vì v y tỉ lệ r n l n tố ưu l :10ml 3.5.3 Ản ởn ủ n ệt độ Chu n bị m u cho vào bình tam giác, m u cân xác khoảng 10gam, sau đ chiết o 100ml dung môi ethanol vào Tiến hành ưn n n tron k oảng thời gian tốt on l 120 p út v với nhiệt độ t ay đ i 70, 75, 80, 85, 900C Đ m lọc cô cạn dịch chiết t u c n nhiệt độ khác nhau, đ m n ta kết .13 Ả Nh n xét: K t n t n n ệt độ khố lượng riêng chất t u đến 85oC khố lượng ao khố lượn ao ethanol ết lớn nhất, tiếp tụ t n t ời gian ết chất giảm Có thể giải thích dịch chiết tua sen có chứa cấu t không bền với nhiệt độ nên dễ ay oặc phân hủy chiết liên tục nhiệt độ cao Sự t ay đ i phù hợp với qui lu t V y ọn n ệt độ tố ưu l 850C 75 3.5.4 Ản ởn ủ nồn độ et nol Chu n bị m u cho vào bình tam giác, m u cân xác khoản 10 am sau đ o 75ml ung môi ethanol vào Tiến hành chiết ưn n n tron k oảng thời gian tốt on l 120 p út v với nồn độ t anol t ay đ i 50, 60, 70, 80, 90, 96o Đ m lọc cô cạn dịch chiết t u c n nhiệt độ khác nhau, đ m n ta kết 3.14 Ả N n t: K ethanol t n nồn độ tron lượng riêng chất t u đượ un m n t n t n độ cồn đến 80o t r n l lớn n ất t ếp tụ t n độ ồn l n t đượ ảm mạn C t ể ột tua s n k n t ể ị N k k ố lượn r n nồn độ ồn qu k ố lượn ất ao số ết ất tron ết đượ V y nồn độ ồn tố ưu l 800 t un ủ qu tr n ọn đượ t an ết l 120 phút n ệt độ 850C v tỷ lệ r n-l n 1:10 (10 n ất n ả t í tanol ùn để chiết khối ảo s t: Qu tr n ột:100ml t anol) v nồn độ ồn l 800 t lượn ết ất ưn n n ết l tốt 76 ết 3.5.5 C n ín x ết n n n n ều lần vớ k oản 10 am m u 100ml dung môi ethanol vào T ến ov o n ết un mô et anol n ầu 250ml sau đ o ưn n n tron k oản t an 120 p út v vớ n ệt độ 850C Đ m lọ t u dịch chiết lần 1, bã sau lọc ta cho vào bình cầu, thêm vào 100ml dung mơi ethanol tiếp tụ đun tron t ời gian nhiệt độ Tư n tự ta có dịch chiết lần lần Đ m ạn ta c n dịch chiết lần 1, lần lần sau đ đ m n ta kết t ể 15 Ả ện n 3.9 ầ Nh n xét: Qua lần chiết ta thấy lần chiết thứ nhất, cấu t hòa tan m lượng cao chiết 2,5641gam chiếm 78,26%, lần chiết thứ nhiều vớ vớ m lượng cao chiết 0,5508gam chiếm 16,81% với lần chiết thứ lượng chất chiết gần n o n to n (0,1615gam) chiếm 4,93% Ả 3.6 3.6.1 ÂN ết s C D CHLOMETAN ý m n C n k oản 350 am m u tua s n đượ x l N m m u tron lít methanol tron n y t ến lạ đ t ến đố sệt n quay n n m lần l n tụ Dị n k n t u đượ ết sau lần ộp ao m t anol l p ần ặn tư n 77 Hòa tan ao m t anol tron nướ ết l n – l n l n tụ vớ n quay lorom t an Dị n k n t u đượ C ao ẫ Hòa tan ao ao ản m n vớ o v o p ễu ết lít T ến hloromethane t ến lorom t an d d - lorm t an tron m t anol v t ến ệ un m n n ạy s xan: t yl a tat vớ tỉ lệ k k n au t u đượ kết sau: acetate the ả ắ ý ả ỉ : , : , : ( ỏ d ả -hexan:ethyl d è 78 N n - Vớ t ệ un m 7:3 ấu t t - Vớ ệ un m 8:2 un - Vớ ệ un m Do đ ún t m ấu t t 9:1 ấu t t ọn ệ un m k đầu sau đ t n ra k n rõ k ện tượn kéo đu rõ n- xan: t yl a tat = 9:1 l m ệ độ p n ự o tớ ệ un m n- hexan:ethyl acetat 7:3 3.6.2 ết s ý ột Sau kh lựa chọn hệ dung môi thích hợp, tiến hành s c ký cột với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat Mỗi lần pha 100 ml hệ dung môi nhexan:etyl axetat vớ độ phân cự t n ần theo tỉ lệ n sau 90:10 85:80, 80:20, 70:30 C ắ ý ẫ 79 C Sau k o ay tự n nt p n đoạn TSD21-24 kết t n l n t n n ta r a kết t n v t u đượ m u kết t n t n ợp sau: 20 C S k đồ GC p n đoạn kết t n TSD21 - TSD24 đượ t ể 3.20 Kết địn an đượ t n p ần tr n y ản 3.12 ện n 80 21 Sắ ý TSD21-24 81 Bả 12 D ện n l u tí STT p t ầ TSD21-24 p n ọ Côn t ứ (%) 1,88 0,092 Furan-2,3-dihydro O (C4H6O) 2H-Pyran, tetrahydro-2- 1,98 0,097 (1-methylethoxy) (C8H16O2) 2(4H)-Benzofuranone, 11,58 0,301 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7atrimethyl (C11H16O2) 60,61 1,706 61,28 21,93 62,12 76,14 N n t n p ần Betamethasone acetate (C24H31FO6) Campesterol (C28H48O) β –Sitosterol (C29H50O) t T kết ản 3.12 ủ yếu l β -S tost rol v Camp st rol ếm 21,93% òn lạ ếm o t tron p n đoạn kết tinh n y m lượng cao l n đến 76,14% ất k ếm tỉ lệ 82 N À NN Ị N 1, Qua qu tr n n n ứu đề t t u đượ số kết n sau: 1.1 Địn tín v địn lượn tan n tron tua s n: - M u tạo kết tủa m xan đ n vớ muố F Cl3 5% - B n p n p p Low nt al địn lượn đượ m lượn tan n tron m u l 8,973% 1.2 B n p n p p sấy k ấp t ụ n uy n t S x p n p p tro m u v p n p p địn đượ độ m; m lượn tro v m lượn k m loạ tron tua s n Hưn Y n: - Độ m tua s n l 5,390% - H m lượn tro tua s n l 17,146% - H m lượn k m loạ nặn t o địn s P C H n m tron k oản ộ y tế số 505/BYT-QĐ n y 13 t n n m 1992 m lượn k m loạ nặn tố đa o p ép tron rau sấy k 1.3 B n p n p p GC-MS địn ị ết n- xan địn an đượ 14 ấu t t ị ết t ị ết t anol đượ 13 ấu t 1.4 X loro orm đượ 13 ấu t địn đượ đ ều k ện - Ethyl acetate: +T ị ết ị ị ết benzene đượ 12 ấu ết t yl a tat đượ 15 ấu ết m t anol đượ 14 ấu t ưn n n vớ loạ dung môi: an tố ưu l 120 p út + Tỷ lệ r n l n tố ưu l : 5ml +T an đượ 24 cấu t Tron đ + N ệt độ tố ưu l 75oC - Ethanol: o p ép an tố ưu l 120 p út + N ệt độ tố ưu l 85oC + Tỷ lệ r n l n tố ưu l :10ml 83 + Nồn độ ồn tố ưu l 80o 1.5 Cao chiết D lom t an phân l p b n ký cột với chất hấp phụ l s l a l t u đượ đượ t n p ần NN an n n ứu n ứu s u địn ợp ất ạn t n qua kết đề t β-sitosterol vớ sốn ấu t - Nếu n t ột để p n l p x đề t tr n ất ụn ết tua s n p n l p v an tron tua s n ứn oạt tín s n trị s ị ưa địn m lượn tư n đố p p ần l m t n t uố a ọ ún t n số vấn đề n sau: n t n p ần ứa số - Tua sen có pháp tách c an ủ yếu l β-s tost rol v Camp st rol mon muốn đề t đượ p t tr ển rộn x ất kết t n Tron đ địn Ị Do t -N p n p ps c ụn tron y ọ n ư: campesterol, ao V v y ần n n ứu p n ọ đ n m đ p ứn n u ầu uộ ũn n ữa ện tua s n tron an an v đ ều k ện n địn ấu trú n ứu t ất t ếp tụ t ến n s tron p n đoạn kết t n k D N C À Ả ến v ệt [1] AOAC 971.21 (2010), AOAC 986.15 (2010), AOAC 999.11 (2010) [2] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Vi t Nam t p I, NXB Trẻ tr 312 x [3] Ngô Minh Khôi (2014), ả d dị Đạ ị ầ ả ” Lu n v n t sĩ Đạ Họ Đ Nẵn 2014 [4] Đỗ Tất Lợi (2001), Những thu c vị thu c Vi t Nam, NXB Y học [5] Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh K (1998) “Nghiên c u thành phần hóa h c Sen” Tạp í ược họ t n nǎm 1998 tr 13 – 18 [6] N uyễn T ị K m P ụn ( 2007) P NXB Đạ ọ quố ữ ơ, a TP Hồ C í M n [7] Hồ Viết Quý (1998), C í ại ng dụng hóa h c NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội [8] Đỗ C u M n Vĩn T ọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùn (2011) “ ầ Mn [9] Trần Bí d ” tạp í Y Học TP Hồ Chí n m 2011 tran 606-611 T ủy Tốn v n H n í ỏ N uyễn Vĩn Trị (1989) “ ” Tạp í a ọ ĐHBK tpHCM t p 27 số Địn lượn tan n [10] TCVN 5613:1991 [11] TCVN 5611:2007 [12] Viện Dược liệu (2004) “Cây thu ng v t làm thu c Vi t Nam” t p II, Nhà xuất Khoa học Kỹ Thu t, trang 721 [13] Bù xu n vữn 2013, G í ụ, tr 173-194 ến n [14] Carol Kaesuk Yoon (1996-10-01) "Heat of Lotus Attracts Insects And Scientists" New York Times Retrieved 2012-11-14) "Heat of Lotus Attracts Insects And [15] Brown.D.Encyclopaedia of Herbs and their Uses [16] Huang CF, Chen YW, Yang CY, Lin HY, Way TD, Chiang W Liu SH(2011), Extract of lotus leaf ( Nelumbo nucifera ) and its active constituent catechin with insulin secretagogue activity, Journal of Agricultural and Food Chemistry [17] Ivan Polunin, "Plants and Flowers of Singapore", Times Editions, 1987 (p 68: description, habitat, distribution, photo) [18] Kashiwada, Y.; Aoshima, A.; Ikeshiro, Y.; Chen, Y P.; Furukawa, H.; Itoigawa, M.; Fujioka, T.; Mihashi, K.; Cosentino, L M.; MorrisNatschke, S L.; Lee, K H (2005) "Anti-HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera, and structure–activity correlations with related alkaloids" Bioorganic & Medicinal Chemistry 13 (2): 443–448 [19] Kim HK, Park HR, Lee JS, Chung TS, Chung HY, Chung J Downregulation of iNOS and TNF-alpha expression by kaempferol via NFkappaB inactivation in aged rat gingival tissues Biogerontology 2007;8(4):399-408 [20] Lin HY, Kuo YH, Lin YL Chiang W (2009), Antioxidative effect and active components from leaves of Lotus ( Nelumbo nucifera ), Graduate Institute of Food Science and Technology [21] Ohkoshi E , Miyazaki H , K Shindo , Watanabe H , Yoshida A Yajima H (2007), Constituents from the Leaves of Nelumbo nucifera Stimulate Lipolysis in the White Adipose Tissue of Mice, planta medica [22] Perry, F Flowers of the World Bonanza Books, 1972 p 192-193 [23] Shen-Miller, J.; Schopf, J W.; Harbottle, G.; Cao, R.-j.; Ouyang, S.; Zhou, K.-s.; Southon, J R.; Liu, G.-h (2002)."Long-living lotus: Germination and soil -irradiation of centuries-old fruits, and cultivation, growth, and phenotypic abnormalities of offspring" American Journal of Botany 89(2): 236–47 doi:10.3732/ajb.89.2.236 PMID 21669732 [24] Takefumi Sagara, Naoyoshi Nishibori, Manami Sawaguchi, Takara Hiro, Mari Itoh, Song Her, Kyoji Morita (2012), Lotus root (Nelumbo nucifera rhizome) extract causes protective effect against iron- induced toxic damage to C6 glioma cell, Inforesights Publishing UK, 179-189 [25] Wee Yeow Chin, "A Guide to Medicinal Plants", Singapore Science Centre, 1992 (p 108: description, chemical compounds, uses) Websites [26] https://en.wikipedia.org/wiki/Beta-Sitosterol (Truy p v o n y p v o n y p v o n y 18/3/2015) [27] https://en.wikipedia.org/wiki/Campesterol (Truy 18/3/2015) [28] https://en.wikipedia.org/wiki/Palmitic_acid (Truy 28/2/2015) [29] https://en.wikipedia.org/wiki/Nelumbo_nucifera (Truy p v o n y 28/3/2015) [30] http://vi.wikipedia.org/wiki/Sen_h%E1%BB%93ng#Xem_th.C3.AAm (Truy p v o n y 28/3/2015) [31] http://www.duoclieu.org/2012/01/sen-nelumbo-nucifera.html (Truy v o n y 14/12/2015) [32] http://123doc.org/document/896340-nghien-cuu-mot-so-dac-diem-thucvat-va-hoa-sinh-cua-cay-sen-nelumbo-nucifera-gaertn-tai-xa-hungtien-nam-dan-nghe-an.htm?page=9 (Truy p v o n y 14/12/2015) p ... hóa học ị ết nz n 51 3.3.3 Thành phần hóa học ị ết loro orm 54 3.3.4 Thành phần hóa học ị ết t yl a tat 57 3.3.5 Thành phần hóa học ị ết m t anol 60 3.3.6 Thành phần hóa học ị... QUẢ ĐỊNH LƯ NG T NIN 47 3.3 K T QUẢ ĐO GC – MS X C ĐỊNH THÀNH PHẦN H HỌC TRONG C C DỊCH CHI T KH C NH U CỦ TU SEN 48 3.3.1 Thành phần hóa học ị ết n-hexane 48 3.3.2 Thành phần hóa. .. tả sen 1.3 GI TRỊ S 1.3.1 C n 1.3.2 Một số DỤNG CỦ C Y SEN 10 ụn 10 t uố t s n 11 1.4 MỘT S NGHI N CỨU VỀ HOẠT T NH SINH HỌC CỦA SEN 15 1.4.1 Các nghiên cứu