Giám sát sự lưu hành type virus và khảo sát yếu tố nguy cơ phát sinh dịch cúm gia cầm trên địa bàn huyện quảng ninh tỉnh quảng bình

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn “Giám sát lưu hành type vi rút khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình” cơng trình nghiên cứu riêng tơi, nằm khuôn khổ đề tài Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Bình năm 2017 PGS - TS Nguyễn Xuân Hòa làm chủ nhiệm Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Quảng Bình, ngày 15 tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp xin cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông lâm Huế tạo điều kiện cho theo học chương trình đào tạo trình độ Thạc sỹ trường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Vũ Văn Hải, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông lâm Huế người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tập thể Lãnh đạo cán Chi cục Thú y Quảng Bình, Phân viện Thú y Nha Trang, Đề tài khoa học Cơng nghệ tỉnh Quảng Bình năm 2017 – 2018, nghiên cứu sinh Phạm Hồng Kỳ tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ hồn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln bên cạnh, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Mặc dù thân nổ lực, cố gắng, song kiến thức thời gian hạn chế nên không tránh khỏi tồn tại, thiếu sót Vì vậy, kính mong tiếp tục nhận quan tâm, góp ý từ thầy cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp cho nội dung nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Giám sát lưu hành type vi rút khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình” thực từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 100 hộ nuôi gia cầm xã địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình điều tra vấn trực tiếp phiếu điều tra Các yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm gồm: Khơng tiêm vắc xin phịng bệnh cho đàn gia cầm (OR = 11,15); tập quán giết mổ gia cầm sống gia đình (OR = 25,67); nuôi gia cầm tiếp xúc với chim trời (OR = 7,5); Tập quán nuôi ghép nhiều gia cầm với (OR = 11,07); Tập quán sử dụng nước ao hồ (OR =7,36) Với mục đích giám sát lưu hành vi rút cúm A , từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình 72 mẫu swab gộp gà vịt thu thập Sự có mặt vi rút cúm phát phương pháp Real time RT - PCR Kết xác định 21 mẫu dương tính với vi rút cúm type A, cụ thể sau: Tại chợ Võ Xá, qua lần lấy mẫu với tổng số 32 mẫu giám sát, có 13/32 mẫu dương tính với gen M (tỷ lệ 40,625 %) Tiếp tục xét nghiệm 13 mẫu dương tính gen M để xác định subtyp H, thấy mẫu dương tính với subtyp H5 Xét nghiệm mẫu để xác định subtyp N1 N6 phát thấy mẫu dương tính với subtype N6 (3,125%) Như có lưu hành vi rút cúm A/H5N6 với tỷ lệ 3,125% địa bàn nghiên cứu Giám sát đàn báo : Qua lần lấy mẫu với tổng số 40 mẫu giám sát, có 8/40 mẫu dương tính với gen M (tỷ lệ 20%) Khơng có mẫu dương tính với subtyp H5 H7 Như vậy, khơng có lưu hành cúm A/H5N6 hộ chăn nuôi thời điểm giám sát Mẫu dương tính với vi rút cúm A/H5N6 chợ Võ Xá, Quảng Ninh, tiến hành giải trình tự gen cơng ty 1st Base, Singapo Quy trình thực phương pháp Sanger dideoxy sequencing Kết giải trình tự trích xuất dạng mặc định (*ab1) đọc phần mềm Bioedit sau: Đánh giá thuật toán Blast GenBank (NCBI), Trình tự gen H5 chủng phân lập huyện Quảng Ninh có mức tương đồng cao (nhận dạng dể nhất) với chủng H5 tìm thấy, hiển thị màu đỏ tương ứng mức điểm >200 Trình tự điểm phân cắt chủng phân lập có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, Giống với trình tự điểm phân cắt chủng độc lực cao tổ chức OIE công bố năm 2017 (Motiff cleavage site hpaiv h5 RERRRKR/GLF,OIE, 2017) Từ kết luận chủng phân lập Quảng Ninh có độc lực cao Vẫn chủng H5N6 lưu hành đàn gia cầm cho thấy nguy phát dịch tiềm ẩn cần tăng cường cơng tác giám sát chủ động, đặc biệt hàng năm cần xây dựng kế hoạch lấy mẫu để xác định lưu hành vi rút cúm gia cầm nhằm cảnh báo sớm chuẩn bị đầy đủ điều kiện để sẵn sàng ứng phó với dịch cúm gia cầm độc lực cao iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG .viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm cúm gia cầm 1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm giới 1.3.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.3.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm Quảng Bình 15 1.3.4 Tình hình dịch cúm gia cầm huyện Quảng Ninh 16 1.4 Vi rút học bệnh cúm gia cầm 17 1.4.1 Cấu trúc vi rút cúm gia cầm 17 1.4.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gence cúm gia cầm 19 1.4.3 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 21 1.4.4 Độc lực vi rút 24 1.4.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên gây bệnh vi rút 25 1.4.6 Sức đề kháng vi rút 26 1.5 Truyền nhiễm học 27 1.5.1 Động vật cảm nhiễm 27 v 1.5.2 Con đường truyền lây 28 1.5.3 Mùa phát bệnh 28 1.6 Triệu chứng bệnh tích 28 1.6.1 Triệu chứng 28 1.6.2 Bệnh tích 29 1.7 Các phương pháp chẩn đoán 30 1.7.1 Chẩn đoán dịch tễ học 30 1.7.2 Chẩn đoán lâm sàng 30 1.7.3 Chẩn đoán vi rút học 30 1.7.4 Chẩn đoán huyết học 30 1.8 Phòng bệnh 31 1.8.1 Phòng bệnh vệ sinh 31 1.9 Hiểu biết kỹ thuật Realtime RT-PCR 32 1.9.1 Thế phản ứng Realtime RT-PCR 32 1.9.2 Cơ chế hoạt động Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 32 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 34 2.1 Đối tượng, phạm vi nội dung nghiên cứu đề tài 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 34 2.1.3 Nội dung 34 2.2 Bố trí thí nghiệm 34 2.3 Vật liệu nghiên cứu 35 2.3.1 Mẫu vật: 35 2.3.2 Nguyên liệu 35 2.4 Phương pháp nghiên cứu 37 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 37 2.4.2 Phương pháp xét nghiệm 37 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 42 vi Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Tình hình chăn ni gia cầm huyện Quảng Ninh 43 3.1.1 Tổng đàn gia cầm Huyện Quảng Ninh từ năm 2012- 2017 43 3.1.2 Kết đánh giá tình hình chăn ni gia cầm địa bàn số xã thuộc tỉnh Quảng Bình qua phiếu điều tra 44 3.2 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm địa bàn số xã thuộc huyện Quảng Ninh qua phiếu điều tra 47 3.3 Phân tích số yếu tố nguy làm phát sinh lây lan bệnh Cúm gia cầm huyện Quảng Ninh 48 3.3.1 Tỷ lệ tiêm phòng 48 3.3.2 Tập quán giết mổ gia cầm khu vực chăn nuôi 49 3.3.3 Yếu tố tự nhiên 50 3.3.4 Nuôi ghép nhiều gia cầm với 50 3.3.5 Nguồn nước 51 3.4 Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm huyện Quảng Ninh 52 3.4.1 Kết giám sát vi rút cúm gia cầm chợ theo thời gian 52 3.4.2 Lấy mẫu giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm đàn báo 54 3.4.3 Kết giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm chợ hộ chăn nuôi (đàn báo) 57 3.4.4 Kết giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm gà vịt thời gian nghiên cứu 58 3.5 Kết giải trình tự Gen HA chủng H5N6 phân lập huyện Quảng Ninh59 3.5.1 Đánh giá kết thực giải trình tự 59 3.5.2 Phân tích trình tự amino acid (do gen H5 quy định) chủng phân lập Quảng Ninh, Quảng Bình 63 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 4.1 KẾT LUẬN 64 4.2 ĐỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 68 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AI : Avian Influenza BNN PTNT : Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn CGC : Cúm gia cầm Ct : Cycle of threshold DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Emzyme Linked Immunosozbent Assay FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations HA : Haemagglutination test HEF : Hemagglutinin Esterase Fusion HI : Haemagglutination inhibitory test HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza IVPI : Intravenous Pathogenicity Index KN - KT : Kháng nguyên – kháng thể LPAI : Low Pathogenic Avian Influenza MA : Matrix NA : Neuraminidase NEP : Nuclear export protein NP : Nucleoprotein OIE : Organnisation international des epizooties PBS : phosphate buffered saline QCVN : Quy chuẩn Việt Nam RNA : Ribonucleic acid RNP : Ribonucleoprotein RR : Relative Rick RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction WHO : World Health Organization viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tình hình dịch CGC từ năm 2015 - 2017 Bảng 1.2: Các tỉnh, thành phố có dịch CGC năm 2017 13 Bảng 1.3: Bảng phân bố típ vi rút CGC lưu hành địa phương năm 2017 14 Bảng 1.4 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm từ năm 2012 - 2017 17 Bảng 2.1 Cặp mồi phát vi rút Cúm gia cầm 36 Bảng 2.2 Thành phần master mix 39 Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng real time RT-PCR 40 Bảng 3.1.Tổng đàn gia cầm từ năm 2012 – 2017 43 Bảng 3.2 Cơ cấu chăn nuôi gia cầm, thủy cầm hộ điều tra 44 Bảng 3.3 Phương thức chăn nuôi gia cầm 45 Bảng 3.4 Tình hình vệ sinh chuồng trại 46 Bảng 3.5 Xử lý chất thải chăn nuôi 46 Bảng 3.6 Tỷ lệ tiêm phòng Cúm gia cầm 47 Bảng 3.7 Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2012- 2017 47 Bảng 3.8 Kết phân tích yếu tố nguy khơng tiêm vắc xin phòng bệnh cúm 49 Bảng 3.9 Kết phân tích yếu tố nguy giết mổ gia cầm khu vực chăn nuôi 50 Bảng 3.10 Kết phân tích nguy tiếp xúc chim trời 50 Bảng 3.11 Kết phân tích yếu tố nguy ni chung lứa 51 Bảng 3.12 Kết phân tích yếu tố nguy nguồn nước 51 Bảng 3.13 Kết giám sát vi rút cúm gia cầm chợ theo thời gian 52 Bảng 3.14 Kết giám sát vi rút cúm gia cầm đàn báo theo thời gian 55 Bảng 3.15 Kết giám sát vi rút cúm gia cầm đàn báo chợ 57 Bảng 3.16 Kết giám sát vi rút cúm gia cầm gà vịt 58 Bảng 3.17 Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng phân lập Quảng Ninh năm 2017 63 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái cấu trúc vi rút cúm gia cầm 18 Hình 1.2 Các hệ gen vi rút cúm 19 Hình 1.3 Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên vi rút cúm A tế bào chủ 26 Hình 1.4 Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ vi rút cúm A 27 Hình 1.5 Cơ chế phát huỳnh quang Taqman probe 33 Hình 3.1 Biểu đồ diễn biến tổng đàn gia cầm giai đoạn 2012-2017 44 Hình 3.2 biến động lưu hành vi rút cúm chợ Võ Xá 54 Hình 3.3 Biến động lưu hành vi rút đàn báo theo thời gian 56 Hình 3.4 Tỷ lệ lưu hành vi rút cúm đàn báo chợ 58 Hình 3.5 Tỷ lệ lưu hành vi rút cúm gà vịt 59 Hình 3.6 Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Forward chủng LC376800 60 Hình 3.7 Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Reverse chủng LC376800 60 Hình 3.8 Đánh giá điểm sequence gen HA chủng LC376800 Blast 62 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, bệnh cúm gia cầm xảy khắp nơi giới, gây thiệt hại nặng nề mặt kinh tế, trị xã hội cho nhiều quốc gia Do mối lo ngại tồn cầu Cúm gia cầm có tên khoa học Avian Influenza, bệnh truyền nhiễm cấp tính gây vi rút cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridea Vi rút cúm typA chia thành subtyp khác tùy thuộc vào kháng nguyên bề mặt chúng Haemagglutinin (HA) Neuraminidase (NA) Nhóm vi rút cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) subtyp NA (từ N1 đến N9) Sự tổ hợp subtype HA NA tạo nhiều subtyp khác Mặt khác, vi rút cúm A có đặc tính quan trọng dễ dàng đột biến gen/hệ gen (đặc biệt gen NA HA) trao đổi gen với nhau, trình xâm nhiễm tồn lây truyền loài vật chủ, dẫn đến việc tạo nên nhiều subtyp có độc tính khả gây bệnh khác (De Wit Fouchier, 2008; Murphy, Webster, 1996; Ito et al., 1998) Bệnh cúm gia cầm tổ chức Thú y giới (OIE) xếp vào danh mục bảng A bệnh truyền nhiễm nguy hiểm động vật Tại nước ta, bệnh cúm gia cầm nằm danh mục bệnh động vật cạn phải công bố dịch; Danh mục bệnh truyền lây động vật người; Danh mục bệnh động vật cấm giết mổ, chữa bệnh; Danh mục bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phải áp dụng biện pháp phòng bệnh bắt buộc vắc xin cho động vật nuôi Danh mục bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phải áp dụng biện pháp giám sát định kỳ Từ dịch xuất đến có 75 quốc gia vùng lãnh thổ giới xuất dịch khiến hàng trăm triệu gia cầm ốm chết, phải tiêu hủy có 844 người mắc bệnh, tử vong 449 người 16 quốc gia, diễn biến dịch ngày phức tạp Ở Việt Nam dịch cúm gia cầm H5N1 lần xuất vào cuối năm 2003, bệnh lây lan cách nhanh chóng với nhiều ổ dịch xuất thời điểm nhiều địa điểm từ tỉnh miền Bắc đến miền Trung, Tây Nguyên tỉnh phía Nam Chính thế, tháng, đến 27/02/2004 dịch làm cho gia cầm 2.574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn 51 tỉnh/thành phố Việt Nam bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết bệnh bị tiêu hủy 43,9 triệu thủy cầm 13,5 triệu Ngồi cịn có 14,76 triệu chim cút loại chim khác bị chết tiêu hủy (Nguyễn Tuấn Anh, 2006) Năm 2014, Việt Nam vi rút cúm A/H5N6 lần phát tỉnh Lạng Sơn, Hà Tĩnh vi rút cúm A/H5N6 tiếp tục phát nhiều tỉnh nước Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Trị, Quảng Ngãi Trong đó, vi rút cúm A/H7N9 xuất 60 Hình 3.6 Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Forward chủng LC376800 BIO TRACE Model 3730 File: 1s t_BASE_3058149_QN53_2_primer_2R.ab1  KB.bcp 6258000-04 6258002-04 6258003-03 3058149_QN53_2_primer_2R 6258005-00 Lane 93 Signal G:1341 A:1782 T:2805 C:2342 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 2047 to 18360 BioEdit v ersion 7.0.5.3 (10/28/05) A A C TG T A T G C A CT T C T G CA T T G T A C G A C C CA T T G G AG C AC A T C C A T A A AG AT AG A C C A G C C A C A A T G A T T G C C AG T G C T AG G G A A C T C G C C A C T G T T G AA T A A A T T G A CA G T A T T T G G 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 T T C T T C CC T T T T T A A T C T TG C C T C T T C T G A AT A C T G G G G AT AG T C A T A C G T C C C A T T T C T T A C AC T T T C C A T A C A T T CA T T A T C A C A T T T A TG A T A G A A C T C G A A A C A A C C A T T A C C T AG C T 16 170 180 190 20 10 220 230 40 50 260 70 T C A T A A AG G T T C T T TA C A T T T G A A T C G T G A A A A T C T A A A G T T C T C T C A T T T T C C A TG AG A A C T A A A AG T T CA G C A T T G T A A G T C CA G A C A T C T AG G AA T C CG T C T T C C A T T T T C T T A T T T A A A T T C 320 330 40 350 360 370 380 90 400 410 42 43 A CG G C C T C A A A T T G A G T G T T C A T T T TG C C G A T T A T C G A G T T G A C C T T A T T G G T A A C T C C A T C T A T T G C C T T T T G G G T G G A T T C T C TG T C TG C AG CG T A C C C A C T C C C C TG T T C A T TG C T A TG G TG G 480 490 500 510 520 530 540 550 56 570 580 590 T C C C T C T A TG A A C C C T G C T A TA G C T C C A A A T A G T C C T C T C T T T C T T C T T C T T T CT C T T A A A G G A C T A T T T C TG AG T C C AG T CG C A A G G A CT A A T T T G T T TG A T T T C A C G T A T T T G G G G C A C T C 640 650 660 70 680 690 700 10 720 730 740 750 A T A C T AG A G T T T A T C G C C C C T A T T G G A G T T T G A C A T T T G G T G T T G C AG T G G C C A T A T T C C A T T T CA C T T T T C A T A A T TG T T G AG T C C T T T T C T C TG T A A A A A A G G 00 810 20 830 840 850 60 870 88 890 Hình 3.7 Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Reverse chủng LC376800 Chúng tơi thực giải trình tự lần: lần thực tinh với primer Forward lần chạy với primer Reverse Kết trình lần xử lý phần mềm Bioedit để xác định trình tự xác 61 Qua hình 3.6 3.7 ta thấy việc giải trình tự mẫu thực tinh với primer Forward khơng tốt, tín hiệu giải trình (thể qua đường cong) Nucleotic không đồng Kết giải trình tự thực mẫu tinh prime Reverse tốt thể qua đồng tín hiệu giải trình Các giá trị không cao không thấp phần trình tự Đây đánh giá ban đầu thể xác việc xác định trình tự xác Chủng phân lập trước chấp nhận đưa lên Gen Bank Qua so sánh kết giải trình tự mẫu primer ta nhận thấy primer Reverse cho kết tốt hơn, việc tinh prime Reverse phù hợp với Gen H5 chủng phân lập huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình Kết đăng tải gen bank: Chủng LC376800 Trình tự Nucleotic ORIGIN atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 61 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 121 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 181 aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tcttggaaac 241 ccaatgtgcg acgaattcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gaggactaac 301 ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 361 ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccaat 421 catgaaacat catcaggggt gagcgcagca tgcccatacc agggagtgcc ctcctttttc 481 agaaatgtgg tatggcttac caagaagaac gatgcatacc caacaataaa gatgagctac 541 aataatacca atggggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaatgaa 601 gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 661 ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacaagga 721 agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt tgagagtaat 781 ggaaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaatagtca agaaagggga ctcaacaatt 841 atgaaaagtg aaatggaata tggccattgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 901 ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa 961 tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tttaagagaa 1021 agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt tcatagaggg aggatggcaa 1081 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1141 gcagacagag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgata 1201 atcgacaaaa tgaacactca atttgaggcc gttgggaggg agtttaataa cttagaacgg 62 1261 agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttacaat 1321 gctgaacttt tagttctcat ggaaaatgag agaactttag attttcacga ttcaaatgta 1381 aagaaccttt atgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctaggtaat 1441 ggttgtttcg agttctatca taaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1501 acgtatgact atccccagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagggaaga aataagcgga 1561 gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1621 tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1681 ttacaatgca gaatttgcat ttaa Trình tự đối chiếu đánh giá lệnh Blast (NCBI) tìm kiếm chủng phân lập đăng tải trình tự lên Genbank Hình 3.8 Đánh giá điểm sequence gen HA chủng LC376800 Blast 63 Qua hình 3.8 nhận thấy điểm sequence chủng phân lập huyện Quảng Ninh có điểm cao (nhận dạng dể nhất), hiển thị màu đỏ tương ứng mức điểm >200 Chứng tỏ gen H5 chủng vi phân lập từ Quảng Ninh giống với nhiều trình tự gen H5 đăng tải Genbank 3.5.2 Phân tích trình tự amino acid (do gen H5 quy định) chủng phân lập Quảng Ninh, Quảng Bình Trình tự amino acid (CDS) gen HA chủng LC376800 (QN53) quy định MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH AQDILEKTHNGRLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERTNPA NDLCYPGNLNDYEELKHLLSRINHFEKTLIIPKSSWPNHETSSGVSAACPYQGVPSFF RNVVWLTKKNDAYPTIKMSYNNTNGEDLLILWGIHHSNNEAEQTNLYKNPTTYVSVGT STLNQRLVPKIATRSQVNGQQGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKG DSTIMKSEMEYGHCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLR NSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADRESTQKAIDG VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENE RTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYS EEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRIC Qua trình tự amino acid ta đánh giá được, ta có bảng đánh giá điểm điểm định độc lực chủng thu thập Quảng Ninh năm 2017 Bảng 3.17 Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng phân lập Quảng Ninh năm 2017 Tên virus A/duck/Vietnam/QuangBinh QN530206/2018(H5N6) Connecting peptide RERRRKR/GLF HA (numbering) 110 158 160 224 226 228 318 H N T N Q G T Qua bảng ta thấy trình tự điểm phân cắt chủng phân lập có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, Giống với trình tự điểm phân cắt chủng độc lực cao tổ chức OIE cơng bố năm 2017 Từ kết luận chủng phân lập Quảng Ninh có độc lực cao (Motiff cleavage site hpaiv h5 RERRRKR/GLF,OIE, 2017) 64 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đề tài, rút số kết luận sau: Nghiên cứu phản ánh huyện Quảng Ninh có cấu chăn ni đa dạng phong phú, chủ yếu chăn nuôi vịt, ngan sinh sản với phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ thả đồng Tỷ lệ tiêm phịng cúm gia cầm thấp 31% Xác định yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm gồm: Khơng tiêm vắc xin phịng bệnh cho đàn gia cầm (RR = 66,77); tập quán giết mổ gia cầm sống gia đình (RR = 1,14); nuôi gia cầm tiếp xúc với chim trời (RR = 1,35); Tập quán nuôi ghép nhiều gia cầm với (RR = 1,92); Tập quán sử dụng nước ao hồ (RR =1,02) Kết giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm - Kết giám sát chợ Võ Xá theo tháng : + Tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A 40,63 % + Tháng có tỷ lệ dương tính cao với gen M tháng 10 năm 2017, tỷ lệ 100% + Tỷ lệ dương tính với subtyp H5 3,13% + Tỷ lệ dương tính với subtyp N6 3,13% + Tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A/H5N6 3,13% - Kết giám sát đàn báo theo tháng : + Tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A 20% + Tháng có tỷ lệ dương tính cao với gen M tháng năm 2017, tỷ lệ 60% + Tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A/H5N6 0% - Kết giải trình tự gen H5 + Bước đầu xác định thành cơng trình tự gen HA (H5) NA (N6) 01 chủng đại diện cho quần thể vi rút cúm gia cầm type A, subtyp H5N6 huyện Quảng Ninh + Chủng phân lập Quảng Ninh có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, cho thấy chủng có độc lực cao 4.2 ĐỀ NGHỊ - Định kỳ tổ chức lấy mẫu giám sát lưu hành vi rút cúm để dự báo sớm tình hình dịch bệnh - Nghiên cứu yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm với quy mô rộng số mẫu lớn để có đánh giá xác 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005), “ Tiêu chuẩn ngành - Quy trình chẩn đốn bệnh Cúm gia cầm” [2] Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình (2017) “Báo cáo điều tra dịch tể bệnh Cúm gia cầm từ năm 2004 -2017 tỉnh Quảng Bình” [3] Cục Thống kê Quảng Bình (2017), Số liệu thống kê kinh tế xã hội Quảng Bình 2012-2017 (tóm tắt), Quảng Bình [4] Cục Thú y (2014) “Báo cáo tổng kết tình hình dịch bệnh năm 2014” [5] Cục Thú y (2015) “Báo cáo tổng kết tình hình dịch bệnh năm 2015” [6] Cục Thú y (2016) “Báo cáo tổng kết tình hình dịch bệnh sáu tháng đầu năm 2016." [7] Cục Thú y (2017) “Báo cáo công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2017 phát triển kế hoạch năm 2018” [8] Lê Văn Năm (2004) “Bệnh Cúm gia cầm” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr 81 – 86 [9] Nguyễn Trần Hiển (10 - 2005) "Tầm nhìn Việt Nam phòng chống bệnh dịch nảy sinh Báo cáo hội thảo Việt Nam, Canada lập kế chiến lược phòng chống bệnh nảy sinh" Hà Nội [10] Lê Thanh Hòa (2010) “Tổng quan virus cúm A/H5N1: vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype tương đồng kháng ngun-miễn dịch-vaccin” [11] Nguyễn Mạnh Kiên (2014) “Nghiên cứu biến đổi di truyền gen PB2, PB1 PA polymerase vi rút cún A/H5N1 đương nhiễm Việt Nam”, Đại học y Hà Nội [12] Nguyễn Ngọc Tiến (2013) “Tình hình dịch cúm gia cầm giai đoạn 2008 - 2012 biện pháp phịng chống” Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 20(01) tr 82 - 90 [13] Nguyễn Tuấn Anh (2006) “Dịch Cúm gia cầm hai năm qua - nguyên nhân, tính chất dịch tồn tại” Truy cập ngày 13/3/2016 http://www.cucchannuoi.gov.vn.vn/Web ID=1&NewsID=86 [14] Nguyễn Tiến Dũng, M Peiris, R Webter, K Inui, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh Long (2004).“Nguồn gốc virus Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 66 2003/2004”, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr – 14 [15] Phạm Sỹ Lăng (2004) “Diễn biến Cúm gia cầm Châu Á hoạt động phịng chống bệnh” Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr 87 - 93 [16] Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT ngày 25 tháng 10 năm 2011 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển nông thôn [17] Trần Hữu Cổn Bùi Quang Anh (2004) “Bệnh cúm gia cầm biện pháp phịng chống” Nhà xuất nơng nghiệp Hà Nội [18] Triệu Nguyên Trung Lê Thạnh (2014) “Những hiểu biết cần thiết cúm A (H7N9)” [19] Viện sốt rét, ký sinh trùng côn trùng Quy Nhơn, truy cập ngày 06/9/2015 http://www.impe-qn.org.vn/impen/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=944&ID=7834 Tiếng Anh [20] Alexander D J (2007) “An overview of the epidemiology of avian influenza” Vaccine 25 (30), pp.5637- 5639 [21] Basler C F (2007) “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets” Infect Disord Drug Targets (4), pp 282 - 293 [22] Beard C W (1998) “Avian Influenza In Foreign Animal Diseases”.United States Animal Health Association, pp 71-80 [23] Bender et al (1999) “Positive selection on the H3 hemagglutinin gen of human influenza virus A” Mobio Evol 16 (11), pp 1457-1465 [24] Bosch et al (1981) “Proteolytic activation of the influenza virus hemagglutinin: The structure of the cleavage site and the enzymes involved in cleavage” [25] Conenello G M, Zamarin M, Perrone A L, Tumpey T and Palese P (2007) “A single mutation in the PB1- F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence” PloS Pathog, 3(10), pp 1414-1421 [26] De Wit E and Fouchier RAM (2008) “Emerging Infuenza” J Clin Virol Vol 41, pp 1-6 [27] Gambotto A, Barratt – Boyes S M , de jong M D, Neumann G and Kawaoka Y (2008) “Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus” Lancet, 371 (9622), pp 1464-1475 [28] Ian R T (1982) “An Introduction to Veterinary Immonology” W B Saunders Co 67 [29] Ito T, Kawaoka Y and Nicholson K.G (1998) Avian influenzaNicholson K.G, Webster R G and Hay A J, eds, “Texbook of influenza Blackwell Sciences”, Exford, UK, pp 126-135 [30] Kawaoka Y (1991) “Diffrence in receptor specificity among influenza A virus from diffirent species of animals” J Vet Med Sci, pp 357-358 [31] Kishida N, Sakoda Y, Isoda N, Matsuda K, Eto M, Sunaga U, Umemura T and Kida H (2005) “Pathogensis of H5 influenza viruses for ducks Arch Virol.” Jul, 150 (7), pp 1383 - 1392 [32] Klenk H D, Geyer R and Schwarz R T (1983) “The characterization of influenza virus by carbohydrate analysis” Curr top Microbiol Immuno, pp 247257 [33] Luong and Palese (1992) “Gentic analysis of influenza virus” Curr Opin Gent Dev, pp.77–81 [34] Motiff cleavage site hpaiv h5 RERRRKR/GLF,OIE, 2017 [35] Murphy and Webster R G (1996) “Orthomyxoviruses In B N Fields, D M Knipe, P M Howley et al (ed) Fields Virology, 3rd ed Lippincott - Raven pblishers, Philadenphia”, pp.1397 - 1445 [36] Nayak D, Hui E and Barman S (2004) “Assembly and budding of influenza virus” Virus Res, 106(2), pp 147-165 [37] Nicholson K G,Wood J M, Zambon M (9397), pp 1733-1745 (2003) “Influenza” Lancet, 362 [38] Webster R G (1998).” Influenza: an emerging disease” Emerg Infect Dis, 4, pp 436-441 [39] WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group (2008) “Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1)” Emerg Infect Dis, 14(7): el [40] Zhao Z M, Shortridge K F, Garcia M, Guan Y and Wan X F (2008) “Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses” J Gen Virol, 89 (9), pp 2185-2193 [41] http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/update-on-avianinfluenza/2016/ [42] http://www micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html 68 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH Lấy mẫu swab 69 Hóa Chất kit chiết tách ARN tổng số Ống master mix RT - PCR Hai cặp mồi RT - PCR 70 Một số dụng cụ, thiết bị 71 Thao tác làm thí nghiệm Hình ảnh giá trị Ct 72 PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN DỊCH CÚM GIA CẦM THÔNG TIN CHUNG SDT: Họ tên chủ hộ chăn nuôi Huyện Địa Xã Thôn SDT: Họ tên người điều tra Đơn vị công tác X: Tọa độ GPS Y: Số lượng loại gia cầm có gia đình Loại gà Số lượng Loại vịt/ngan Gà Vịt /ngan Gà nuôi thịt Vịt/ngan nuôi thịt Gà sinh sản Vịt/ngan sinh sản Số lượng Phương thức chăn nuôi Chăn nuôi nhỏ lẻ, thả vườn  Ngan, vịt thả đồng  Chăn nuôi bán công nghiệp  Ngan, vịt ni nhốt  Chăn ni cơng nghiệp  Có  Chăn ni chung với lợn, chó Khơng  Không  Thức ăn chăn nuôi Thức ăn công nghiệp  Thức ăn tự chế  Thức ăn bán công nghiệp  Gia cầm tự kiếm ăn  Bổ sung kháng sinh vào thức ăn, nước uống Có  Không  Nguồn nước uống Nước máy  Nước giếng  Nước mưa  Sông suối  Nước ao, hồ Nguồn giống: Ghi rõ đại lý Tự sản xuất  Mua nơi khác có nguồn gốc  Mua nơi khác không nguồn gốc  Địa điểm chăn nuôi A Gần khu dân cư 10m- 50m  500m  1km  >1km  B Gần đường quốc lộ 10m- 50m  500m  1km  >1km  C Gần chợ buôn bán gia cầm sống 10m- 50m  500m  1km  >1km  D Gần địa điểm giết mổ 10m- 50m  500m  1km  >1km  E Gần ao, hồ, kênh, mương 10m- 50m  500m  1km  >1km  F Gần trang trại hàng xóm 10m- 50m  500m  1km  >1km  73 Vệ sinh chuồng trại Hàng ngày  2-3 lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  Hàng tuần  Hàng tháng  10 Vệ sinh dụng cụ, máng ăn uống cho gia cầm Hàng ngày  2-3 lần/tuần  11 Khử trùng, tiêu độc lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  3tháng/lần  Sáu tháng/lần  12 Xử lý chất thải chăn nuôi Ủ Bio gas  Sử dụng chế phẩm SH  Xử lý chất hóa học  Xả thẳng mơi trường  Có  Khơng  14 Người, xe cộ vào trang trại có khử trùng khơng? Có  Khơng  15 Ni nhốt chung nhiều lứa tuổi gà chuồng ni Có  Không  16 Giết mổ gia cầm khu vực chăn ni Có  Khơng  13 Gia cầm chăn nuôi thường xuyên tiếp xúc với chim trời Nói rõ lồi chim trời:…………………… Có  Khơng  18 Khu vực chứa thức ăn cho gia cầm mối, chuột, bọ dễ dàng xâm nhập Có  Khơng  17 Trước nhập đàn có để trống chuồng ni 14 ngày 19 Sử dụng đệm lót ẩm ướt Có  Khơng  20 Các loại vắc xin tiêm Có  Khơng  Nhược Vơ độc hoạt Tên bệnh Tên bệnh Nhược Vô độc hoạt Tên bệnh Cúm gia cầm Tụ huyết trùng Gumboro Newcastle Hội chứng giảm đẻ Đậu gà Marek Phù đầu gà Nhược độc Vô hoạt 21.Thời điểm tiêm phịng Cúm gia cầm Trước có dịch  Trong có dịch  Sau có dịch  22.Tỷ lệ tiêm phòng Cúm gia cầm A 100%  B 75%  23 Năm có dịch C 50%  2010  2011 2012 2013 2014 24 Tháng có dịch 1 2 34 56 78 910 D Không tiêm  2015 2016 1112 25 Thời tiết có dịch Nóng  Lạnh  Ẩm  Nóng ẩm  Mưa  26 Trước có dịch có người lạ vào thăm chuồng trại khơng? Có  Khơng  Khơng biết  Khô  2017 74 27 Xử lý gia cầm có dịch Khai báo với quyền  Bán  Chữa trị  Mổ thịt  Vứt bỏ  28 Tiêm phịng số gia cầm chưa có triệu chứng? Có  Khơng  29 Lấy mẫu giám sát Có  Khơng  Chơn, đốt  Tổng số gia cầm có dịch Năm Tổng số gia cầm có dịch (gà, vịt, ngan, ngỗng) Hướng chuồng: Đ  N T  Tổng số gia cầm ốm, chết Tổng số gia cầm bị tiêu hủy (gà, vịt, ngan, ngỗng) (gà, vịt, ngan, ngỗng) B ĐN  ĐB  TN  TB  30 Loại chủ đạo khu vực chăn nuôi: (Nêu loại nhiều theo thứ tự giảm dần theo) Cây lấy gỗ Cây ăn Cây lương thực Cây hoa màu Cây thực phẩm Ý kiến khác:……………………………… Người vấn Hộ nông dân Xác nhận địa phương ... phức tạp bệnh cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Ninh, thực đề tài: ? ?Giám sát lưu hành type vi rút khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình? ?? Mục tiêu... đàn gia cầm hộ chăn nuôi địa bàn huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình: + Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm chợ Võ Xá thời gian nghiên cứu + Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm đàn báo địa bàn huyện. .. hình dịch bệnh cúm gia cầm (CGC) huyện Quảng Ninh thông qua phiếu điều tra - Xác định số yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình - Khảo sát lưu hành