Giám sát sự lưu hành của type virus và khảo sát nguy cơ phát sinh dịch cúm gia cầm trên địa bàn huyện quảng trạch và thị xã ba đồn, tỉnh quảng bình

i LỜI CAM ĐOAN Đề tài thực luận văn cơng trình nghiên cứu tơi, nằm trong khuôn khổ đề tài Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Bình năm 2017 - 2018 PGS.TS Nguyễn Xn Hịa, giảng viên Trường Đại học Nơng lâm - Huế làm chủ nhiệm Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, phối hợp với Phân viện Thú y Miền Trung, Sở Khoa học Công nghệ, Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình thực có giúp đỡ đồng nghiệp Các số liệu luận văn chưa công bố cơng trình khoa học cá nhân tổ chức khác ngồi nhóm nghiên cứu Tơi xin cam đoan, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 TÁC GIẢ Lê Hồng Kỳ ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân, xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo sau đại học, Khoa Chăn ni - Thú y, Trường Đại học Nông lâm - Huế tạo điều kiện cho tơi theo học Chương trình đào tạo trình độ Thạc sỹ trường Tập thể Lãnh đạo cán Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình, Phân viện Thú y Miền Trung, Sở Khoa học Cơng nghệ tỉnh Quảng Bình, NCS Phạm Hồng Kỳ thư ký đề tài, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy cô Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông lâm - Huế, đặc biệt thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Xuân Hòa trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Lãnh đạo UBND huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn; tập thể cán Trạm Chăn nuôi Thú y số Anh chị Trưởng ban Thú y huyện Quảng Trạch; Ban quản lý chợ thị xã Ba Đồn cung cấp tài liệu, giúp đở tơi q trình lấy mẫu điều tra tình hình dịch bệnh địa bàn Tơi xin chân thành cám ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp bên cạnh, động viên, giúp đỡ q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Mặc dù thân nổ lực, cố gắng trình thực hiện, nhiên, với kiến thức học thực tế sở hạn chế khơng tránh khỏi tồn tại, thiếu sót Kính mong tiếp tục nhận quan tâm, góp ý từ thầy cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp cho nội dung nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 TÁC GIẢ Lê Hồng Kỳ iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Tác giả: Lê Hồng Kỳ Khóa học: Thú y 22, năm 2016-2018 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Hòa Thời gian thực hiện: Từ tháng 5/2017 đến tháng 02/2018 Để chủ động khống chế dịch bệnh cúm gia cầm có hiệu quả, đồng thời nghiên cứu đặc tính phân tử nguồn gene chủng virus cúm gia cầm, phân lập từ lồi mắc bệnh khác Việt Nam nói chung, tỉnh Quảng Bình nói riêng, tơi tiến hành thực đề tài: “Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn tỉnh Quảng Bình” Đối tượng nghiên cứu bao gồm gà, vịt nuôi số hộ chăn nuôi địa bàn huyện Quảng Trạch chợ buôn bán gia cầm sống chợ Ba Đồn thị xã Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình Trên thực trạng chăn nuôi gia cầm trang trại, hộ chăn nuôi số xã địa bàn huyện Quảng Trạch chợ buôn bán gia cầm sống thị xã Ba Đồn Bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 20 phân tích dịch tễ học, thông qua số chênh (OR) để phân tích yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn Sử dụng phương pháp real time RT-PCR để kiểm tra lưu hành virus cúm gia cầm Sau đó, mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 giải trình gene H5 phương pháp Sanger dideoxy sequencing, thu kết sau: Gia cầm nuôi cho ăn thức ăn tự chế nguy bị dịch cao gấp 17 lần so với hộ chăn nuôi cho ăn thức ăn công nghiệp Những hộ nuôi gia cầm mua giống từ nơi không rõ nguồn gốc nguy bị dịch cao gấp 3,30 lần hộ nuôi gia cầm mua giống rõ nguồn gốc Gia cầm không tiêm vắc xin phịng bệnh cúm có nguy mắc bệnh cúm gia cầm cao gấp lần so với gia cầm tiêm vắc xin phịng bệnh Những hộ ni gia cầm khơng vệ sinh tiêu độc khử trùng có nguy bị dịch gấp 4,50 lần hộ nuôi gia cầm định kỳ vệ sinh tiêu độc khử trùng Những hộ ni gia cầm chung lồi nguy bị dịch gấp 14,94 lần hộ nuôi gia cầm không nuôi chung Những hộ nuôi gia cầm sử dung nước ao hồ, sông nguy bị dịch cúm gia cầm gấp 4,85 lần so với hộ sử dụng nước máy, nước giếng iv Trong 10 tháng thực giám sát đàn vịt huyện Quảng Trạch khơng phát có mẫu dương tính với cúm A Kết giám sát huyết cho thấy có kháng thể đàn gia cầm nuôi trước tiêm phòng Quảng Trạch Giám sát lưu hành virus cúm gia cầm thị xã Ba Đồn, tỷ lệ lưu hành cúm A xuất nhiều vào tháng tháng 8/2017 (tỷ lệ 100%) Các tháng 11/2017 tháng 02/2018 tỷ lệ nhiễm 50% Tỷ lệ lưu hành thấp vào tháng 6, 9, 10, 12/2017 tháng 02/2018 (tỷ lệ 0%) Phát 02 mẫu dương tính với H5N6, khơng có mẫu dương tính với H5N1 H7N9 Chúng tơi thu nhận toàn chuỗi gen H5 chủng A/Dk/Vietnam/ QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) có độ dài 1704 nucleotide đăng ký Ngân hàng gen số: LC376798, việc thực giải trình tự có độ xác cao Bước đầu xác định thành cơng trình tự gence HA (H5) 01 chủng đại diện cho quần thể virus cúm gia cầm type A, subtype H5N6 thị xã Ba Đồn Trình tự chủng A/Dk/Vietnam/ QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) có tỷ lệ tương đồng cao với chủng phân lập từ 2013 đến 2018 Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Nhật Bản từ 98 đến 100% Chủng phân lập thị xã Ba Đồn có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, cho thấy chủng có độc lực cao v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỬ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, ĐỒ THỊ x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm giới 1.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam 1.2.3 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm tỉnh Quảng Bình 1.2.4 Tình hình chăn ni địa bàn huyện Quảng Trạch 11 1.2.5 Tình hình dịch cúm gia cầm huyện Quảng Trạch giai đoạn 2012 – 2017 12 1.3 Đặc điểm virus học bệnh cúm gia cầm 13 1.3.1 Cấu trúc virus cúm gia cầm 13 1.3.2 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 15 1.3.3 Đặc tính kháng nguyên virus 18 1.3.4 Cơ chế xâm nhập, nhân lên gây bệnh virus 21 1.3.5 Độc lực virus 22 vi 1.3.6 Sức đề kháng virus 23 1.3.7 Nuôi cấy lưu giữ virus 23 1.4 Truyền nhiễm học 24 1.4.1 Động vật cảm nhiễm 24 1.4.2 Sự truyền lây bệnh 24 1.4.3 Loài vật mang virus 25 1.4.4 Chất chứa virus 25 1.4.5 Cách sinh bệnh 26 1.4.6 Mùa phát bệnh 26 1.5 Triệu chứng bệnh tích 26 1.5.1 Triệu chứng chung 26 1.5.2 Triệu chứng chủng virus độc lực cao 26 1.5.3 Triệu chứng chủng virus cúm độc lực thấp 27 1.5.4 Bệnh tích 27 1.6 Các phương pháp chẩn đoán 29 1.6.1 Dựa vào dịch tễ học 29 1.6.2 Dựa vào lâm sàng 29 1.6.3 Chẩn đoán huyết 29 1.6.4 Chẩn đoán xét nghiệm 30 1.6.5 Phân lập định danh virus 32 1.7 Các biện pháp phòng bệnh 32 1.7.1 Phòng bệnh vệ sinh 32 1.7.2 Phòng bệnh vắc xin 34 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng, phạm vi nội dung 36 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 36 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu: 36 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 vii 2.2.1 Xác định lưu hành virus phương pháp Realtime RT-PCR 36 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 39 2.2.3 Phương pháp Realtime RT-PCR 40 2.2.4 Phương pháp điều tra dịch tễ học 43 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Phân tích số yếu tố nguy làm phát sinh lây lan bệnh Cúm gia cầm huyện Quảng Trạch 45 3.1.1 Thức ăn 45 3.1.2 Nguồn cung cấp giống 45 3.1.3 Tỷ lệ tiêm phòng 46 3.1.4 Tiêu độc, khử trùng môi trường chăn nuôi 47 3.1.5 Ni chung lồi 48 3.1.6 Nguồn nước 49 3.2 Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn 49 3.2.1 Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm huyện Quảng Trạch 50 3.2.2 Giám sát lưu hành virus cúm gia cầm thị xã Ba Đồn 52 3.3 Kết giải trình tự Gen HA chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113 /2017 (H5N6) phân lập thị xã Ba Đồn 54 3.3.1 Đánh giá kết thực giải trình tự 54 3.3.2 So sánh mức độ tương đồng thành phần nucleotide gen H5 chủng LC376798 với chủng phân lập Việt Nam giới 56 3.3.3 Giám định độc lực đoạn gen H5 giải trình 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 66 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỬ VIẾT TẮT BỘ NN VÀ PTNT Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn CT Chu kì ngưỡng (Cycle of threshold) DNA Axit deoxyribonucleic HA Hemagglutinin Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination - Inhibition) Cúm gia cầm thể độc lực cao HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza) Cúm gia cầm thể độc lực thấp LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) NA Neuraminidase Tổ chức Thú y giới OIE (World Organnisation for Animal Health) RNA Axit ribonucleic RT - PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Tổ chức Lương thựcvà Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) WHO Tổ chức Y tế Thế giới CDC Center for Disease Control ELISA Emzyme Linked Immunosozbent Assay OR Odd ratio UBND Ủy ban nhân dân ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình Cúm gia cầm số nước giới từ năm 2003 đến năm 2005 Bảng 1.2 Tổng hợp tình hình cúm gia cầm xảy nước từ năm 2007- 2017 Bảng 1.3 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm từ năm 2014 - 2017 Bảng 1.4 Diễn biến tổng đàn gia cầm huyện Quảng Trạch giai đoạn 2013-2017 11 Bảng 1.5 Diễn biến dịch cúm gia cầm huyện Quảng Trạch giai đoạn 2012-2017 12 Bảng 2.1 Phân bố số lượng phiếu điều tra 40 Bảng 2.2 Thành phần master mix 41 Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng RT-PCR 42 Bảng 2.4 Bảng tương liên x 43 Bảng 3.1 Kết phân tích nguy thức ăn tự chế 45 Bảng 3.2 Kết phân tích nguy nguồn cung cấp giống 46 Bảng 3.3 Kết phân tích yếu tố nguy khơng tiêm vắc xin phịng bệnh cúm 47 Bảng 3.4 Kết phân tích yếu tố nguy khơng tiêu độc khử trùng môi trường chăn nuôi 48 Bảng 3.5 Kết phân tích yếu tố nguy ni chung lồi 48 Bảng 3.6 Kết phân tích yếu tố nguy nguồn nước 49 Bảng 3.7 Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm huyện Quảng Trạch 50 Bảng 3.8 Kết giám sát trước tiêm phòng đàn gia cầm huyện Quảng Trạch 51 Bảng 3.9: Kết xét nhiệm từ tháng 5/2017 đến tháng 02/2018 52 Bảng 3.10 Danh sách chủng virus cúm tương đồng gen H5 với chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) phân lập thị xã Ba Đồn 57 Bảng 3.11: Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng LC376798 58 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A 14 Hình 1.2 Cấu trúc virus cúm A/H5N1 15 Hình 1.3 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 16 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa đột biến điểm tượng “ kháng nguyên” (antigenic drift) (A) đột biến tái tổ hợp tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) virus cúm A (B) 21 Hình 1.5 Quá trình xâm nhập nhân lên virus tế bào vật chủ 21 Hình 1.6 Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ virus cúm A 24 Hình 1.7 Bệnh tích đại thể gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1 28 Hình 1.8 Cơ chế hoạt động Taqman probe 31 Biểu đồ 3.1 Biến động lưu hành virus lưu hành kháng thể cúm gia cầm đàn giám sát 51 Biểu đồ 3.2 Biến động lưu hành virus CGC chợ Ba Đồn theo thời gian 53 Hình 3.1: Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017 (H5N6) 54 Hình 3.2 Đánh giá điểm sequence nhận biết gen HA chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) Blast 56 57 Qua hình 3.2 nhận thấy điểm sequence chủng phân lập thị xã Ba Đồn có điểm cao (nhận dạng dễ nhất), hiển thị màu đỏ tương ứng mức điểm >200 Chứng tỏ gen H5 chủng LC376798 phân lập từ Ba Đồn giống với nhiều trình tự gen H5 đăng tải Genbank Một số chủng tiêu biểu lựa chọn đánh giá tương đồng bảng dưới: Bảng 3.10 Danh sách chủng virus cúm tương đồng gen H5 với chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) phân lập thị xã Ba Đồn T T Ký hiệu chủng so sánh Năm Số đăng ký Loài Nguồn Subtype phân ngân mắc gốc lập hàng gen Vịt H5N6 Bố Trạch2017 LC376799 Quảng Bình A/Dk/Vietnam/QuangBinh/ BT1113 Tỷ lệ (% tương đồng nucleotide) 100 A/ck/Dongguan/3363/2013 Gà H5N6 2013 Trung Quốc KP286109 99 A/dk/Eastern China/1/2015 Vịt H5N6 2015 Trung Quốc KP732644 99 A/chicken/Vietnam/NCVD15A55/2015 Gà H5N6 2015 Việt Nam KY171708 98 A/chicken/Nha Trang/128/2015 Gà H5N6 2015 Quảng LC279848 Ngãi 98 A/chicken/Laos/LPQ001/2014 Gà H5N6 2014 Nha KM496965 Trang 98 Gà H5N6 2016 Nhật Bản 98 A/chicken/Miyazaki/21/2016 LC276803 Qua bảng 3.10, thấy chủng phân lập gần có tương đồng trình tự gen H5 với chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) cao từ 98-100% Chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113 phân lập Bố Trạch năm 2017 BT1113 liên quan di truyền chặt chẽ với 100% Hai chủng A/ck/Dongguan/ 3363/2013 A/dk/Eastern China/1/2015 phân lập Trung Quốc năm 2013 2015 có tỷ lệ đồng 99% Chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-15A55/2015 trung tâm chẩn đoán trung ương phân lập Việt Nam năm 2015, chủng A/chicken/Nha 58 Trang/128/2015 phân lập Nha Trang năm 2015, chủng A/chicken/Laos/LPQ001/ 2014 phân lập Lào năm 2015, chủng A/chicken/Miyazaki/21/2016 phân lập Nhật Bản năm 2016 có tỷ lệ đồng 98% 3.3.3 Giám định độc lực đoạn gen H5 giải trình Aminoacid chủng LC376798 (A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6)) Từ liệu giải trình gen H5, phân tích trình tự đăng tải Genbank: MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH AQDILEKTHNGRLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERTNPA NDLCYPGNLNDYEELKHLLSRINHFEKTLIIPKSSWPNHETSSGVSAACPYQGVPSFF RNVVWLTKKNDAYPTIKMSYNNTNGEDLLILWGIHHSNNAAEQTNLYKNPTTYVSVGT STLNQRLVPKIATRSQVNGQQGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKG DSTIMKSEMEYGHCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLR NSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADRESTQKAIDG VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENE RTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYS EEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLTLAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRICI" Qua trình tự amino acid ta đánh giá được, ta có bảng đánh giá điểm điểm định độc lực chủng thu thập thị xã Ba Đồn năm 2017 Bảng 3.11: Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng LC376798 Tên virus Connecting peptide A/chicken/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017 RERRRKR/GLF HA (numbering) 110 158 160 224 226 228 318 H N T N Q G T (H5N6) Qua bảng ta thấy trình tự điểm phân cắt chủng phân lập có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, Giống với trình tự điểm phân cắt chủng độc lực cao tổ chức OIE cơng bố năm 2017 Từ kết luận chủng phân lập Ba Đồn có độc lực cao (Motiff cleavage site hpaiv h5 RERRRKR/GLF,OIE, 2017) 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đề tài, đưa số kết luận sau: * Phân tích số yếu tố nguy làm phát sinh lây lan bệnh Cúm gia cầm huyện Quảng Trạch - Gia cầm nuôi cho ăn thức ăn tự chế nguy bị dịch cao gấp 17 lần so với hộ chăn nuôi cho ăn thức ăn cơng nghiệp sai khác có ý nghĩa mặt thống kê với P < 0,05 - Những hộ nuôi gia cầm mua giống từ nơi không rõ nguồn gốc nguy bị dịch cao gấp 3,30 lần hộ nuôi gia cầm mua giống rõ nguồn gốc - Gia cầm không tiêm vắc xin phịng bệnh cúm có nguy mắc bệnh cúm gia cầm cao gấp lần so với gia cầm tiêm vắc xin phịng bệnh - Những hộ ni gia cầm khơng vệ sinh tiêu độc khử trùng có nguy dịch bệnh gấp 4,50 lần hộ nuôi gia cầm định kỳ vệ sinh tiêu độc khử trùng - Những hộ nuôi gia cầm nuôi chung nhiều lồi có nguy bị dịch gấp 14,94 lần hộ nuôi gia cầm không nuôi chung - Những hộ nuôi gia cầm sử dung nước ao hồ, sông nguy bị dịch cúm gia cầm gấp 4,85 lần so với hộ sử dụng nước máy, nước giếng - Trong 10 tháng thực giám sát đàn gia cầm Quảng Trạch khơng phát có mẫu dương tính với cúm A Kết giám sát huyết cho thấy có kháng thể đàn gia cầm ni trước tiêm phịng Quảng Trạch kháng thể chủ động * Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm thị xã Ba Đồn: - Tỷ lệ lưu hành cúm A xuất nhiều vào tháng tháng năm 2017 (tỷ lệ 100%) Các tháng 11/2017 tháng 02/2018 tỷ lệ nhiễm 50% Không phát thấy lưu hành virus cúm vào tháng 6, 9, 10 12 phát 02 mẫu dương tính với H5N6, khơng có mẫu dương tính với H5N1 H7N9 - Kết giải trình tự gen H5 thị xã Ba Đồn: + Việc thực giải trình tự có độ xác cao Bước đầu xác định thành cơng trình tự gence HA (H5) 01 chủng đại diện cho quần thể vi rút cúm gia cầm type A, subtype H5N6 Ba Đồn + Trình tự chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BD1113/2017(H5N6) có tỷ lệ tương đồng cao với chủng phân lập từ 2013 đến 2018 Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Nhật Bản từ 98 đến 100% 60 + Chủng phân lập Ba Đồn có chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF vùng phân cắt phân tử HA, cho thấy chủng có độc lực cao 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục tổ chức lấy mẫu giám sát chủ động, để xác định lưu hành virus cúm gia cầm định type virus để có biện pháp phịng, chống dịch có hiệu - Nghiên cứu hạn chế mặt thời gian kinh phí Hướng nghiên cứu cần tiếp tục giải trình tự NA phân loại subclade, đánh giá tương đồng với trình tự chủng dung để tạo Vắc xin Kết hợp phịng thí nghiệm cấp để thực tiêm truyền đánh giá độc lực tiêu chuẩn thường quy - Từ kết nghiên cứu thấy vai trò việc tổ chức tuyên truyền cho người chăn ni thực đồng biện pháp phịng, chống dịch bệnh, trọng đến cơng tác tiêm phịng vắc xin, công tác giám sát dịch bệnh, phương thức chăn nuôi, tiêu độc khử trùng môi trường, dụng cụ chăn nuôi Tại chợ buôn bán gia cầm sống phải có nguồn gốc rỏ ràng, có kiểm sốt quan thú y quyền địa phương 61 TÀI LIỆU KHAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004),Bệnh Cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán Kiểm soát dịch bệnh, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr.63-69 [2] Ban đạo quốc gia phòng chống Cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết công tác năm (2004 - 2005) phòng chống dịch Cúm gia cầm, Hội nghị tổng kết năm phòng chống dịch cúm gia cầm, ngày 18 tháng năm 2005, Hà Nội [3] Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005), Tiêu chuẩn ngành - Quy trình chẩn đốn bệnh Cúm gia cầm [4] Nguyễn Văn Cảm (2005), Hiệu biện pháp giám sát cúm gia cầm Việt Nam, Khoa học kỹ thuật thú y, tr 18 [5] Nguyễn Văn Cảm, Tống Hữu Tiến, Nguyễn Tùng, Nguyễn Hoàng Đăng (2011), Kết công cường độc gà, vịt sau dùng vắc xin cúm gia cầm tái tổ hợp H5N1 chủng Re-5 Trung Quốc, Khoa học kỹ thuật thú y , 18(3), tr.12-16 [6] Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2007), Bệnh Cúm gia cầm biện pháp phòng chống, NXB Nông Nghiệp Hà Nội [7] Phan Văn Chi, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cường, Lê Trần Bình (2008), Phân tích đặc tính glycosyl hóa gen kháng nguyên H5 chủng virus cúm A/H5N1 vắc xin cường độc gây bệnh Công nghệ sinh học [8] Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình (2014), Điều tra tình hình dịch tễ, phịng chống bệnh Cúm gia cầm năm 2004-2014 [9] Cục Thú y (2014), Báo cáo hội nghị phòng chống Cúm gia cầm 2014 [10] Nguyễn Tiến Dũng cs (2004), Nguồn gốc virus Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003/2004, Khoa học kỹ thuật thú y 11(3), tr 6-14 [11] Trần Xuân Hạnh (2004), Một vài vấn đề phòng chống bệnh Cúm gia cầm vắc xin Khoa học kỹ thuật thú y, 11 tr 77-84 [12] Lê Thanh Hòa (2006) Y-sinh học phân tử , tập 1, 29-48 [13] Phạm Thị Huê, Bùi Ngọc Anh, Phạm Thị Nga, Nguyễn Thanh Hịa, Ngơ Thị Minh Quyền, Cấn Xn Minh, Bùi Nghĩa Vượng (2018), Nghiên cứu đặc tính di truyền miễn dịch virus H5N6 phân lập Việt Nam" Hội nghị khoa họcCông nghệ Thú y năm 2018- Khoa học kỹ thuật thú y, tr 140 [14] Trần Hùng (2014) Khảo sát lưu hành virus cúm A/H5N1 địa bàn tỉnh Hà Tĩnh tháng đầu năm 2014, Luận văn thạc sỹ Khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm - Huế, tr 14 62 [15] Nguyễn Mạnh Kiên (2014), Nghiên cứu biến đổi di truyền gen PB2,PB1 PA polymerase viurs cúm A/H5N1 đương nhiễm Việt Nam, Đại học Y Hà Nội [16] Lê Văn Năm (2004), Kết khảo sát biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh Cúm gia cầm số sở chăn ni tỉnh phía Bắc, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr 86-90, [17] Lê Văn Năm (2004), 100 câu hỏi đáp quan trọng dành cho cán thú y người chăn nuôi gà, NXB Nông Nghiệp Hà Nội [18] Phạm Hồng Sơn (2013),Giáo trình vi sinh vật học thú y, Đại học Nông lâm Huế [19] Nguyễn Tùng, Nguyễn Hồng Đăng, Ngơ Thị Thu Hương, Đỗ Thị Hoa, Kenjiro Inui, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Bá Hiên (2011), Độc lực virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1 nhánh gia cầm”, Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr.510 [20] Trần Quang Vui (2012), Nghiên cứu hệ gen virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi Hậu Giang, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, tr [21] Tô Long Thành (2005),Kinh nghiệm phòng chống Cúm gia cầm sử dụng vắc xin Cúm gia cầm Trung Quố, Khoa học kỹ thuật thú y, 12(3), tr.87-90 [22] Mary J Pantin-Jackwood, Jenny Pfeiffer, Tô Long Thành, Nguyễn Tùng David Suarez (2008), Độc tính virus Cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 Việt Nam gà vịt, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch định sách phịng chống Cúm gia cầm, tr 16 - 18/6/2008, Hà Nội [23] Vũ Thị Mỹ Hạnh, Tô Long Thành cộng (2008), Kiểm nghiệm vacxin Cúm gia cầm H5N1 Trung Quốc sử dụng giai đoạn 2006-2007, Khoa học kỹ thuật Thú y, 15(4) , tr.25 - 32 [24] Cục Thú y (2014), Các văn hướng dẫn sử dụng vắc xin Cúm gia cầm; Báo cáo tình hình dịch Cúm gia cầm Cục Thú y trang web truy cập ngày 28 tháng năm 2014: www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task =view& id=13&Itemid=64 Tài liệu tiếng Anh [25] Muphy B.R and Webter R.G (1996), “Orthomyxoviruses”, Lippincott-Raven Pblishers, Philadenphia, Pa [26] Audray Harris, Farhad Forouhar, Shihong Qiu, Bingdong Sha , Ming Luo (10 October 2001), The Crystal Structure of the Influenza Matrix Protein M1 at Neutral pH: M1–M1 Protein Interfaces Can Rotate in the Oligomeric Structures of M1, 289 (1), pp 33-44 [27] Baigent S.J., McCauley J.W (2001), Glycosylation of haemagglutinin and stalklength of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture Virus Res, 79 (1-2), pp 177-185 63 [28] Bankowski R.A (1981), Introduction and Objectives of the Symposium First International Symposium on Avian Influenza, 47, pp 7-14 [29] Beard C.W, Brugh M, Johnson D.C (1984), Laboratory studies with the Pennsylvania avian influenza viruses (H5N2) Proceedings of the US Animal Health Association, Forth Worth, TX, USA, 88, pp 462-473 [30] Beard C W, Brugh M., Webter R.G (1987), Emegence of amantadine - resistant H5N1 avian influenza virus during a simulate layer flock treatment program Avian dis, 31, pp 533-537 [31] Bosch F.X., Garten W, Klenk H.D., Rott R (1981), Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins: primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of Avian influenza viruses Virology, 113 (2), pp 725-735 [32] Biswas S.K, Nayak D.P (1996), Influenza virus polymerase basic protein interacts with influenza virus polymerase basic protein at multiple sites J.Virol, 70, pp 6716-6722 [33] Collins R A., Ko, L S., Fung K Y., Chan K Y., Xing J., Lau L T.,Yu A C (2003), Rapid and sensitive detection of avian influenza virus subtype H7 using NASBA Biochem Biophys Res Commun 300(2), pp 507-515 [34] Castrucci M.R., Kawaoka Y, (1993), Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus J Virol, pp 759-764 [35] Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P., (2007), A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence PLoS Pathog, (10), pp 1414-1421 [36] Doherty P.C., Turner S.J., Webby R.G., Thomas P.G (2006), Influenza and the challenge for immunology Nature Immunology, (5), pp 449-455 [37] Ellis J S., Zambon M C (2002), Molecular diagnosis of influenza Rev Med Virol 12(6), pp 375-389 [38] Hilleman M.R., (2002), Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control Vắc xin, 20 (25-26), pp 3068-3087 [39] Le Thanh Hoa, Dinh Duy Khang, Phan Văn Chi, Nong Van Hai, Truong Nam Hai, Pham Viet Cuong, Nguyen Thi Bich Nga, Le Tran Binh (2010), The A/H5N1 influenza virus: insights os epidemiology, evolution, gennotype generation and compatibility of antigenicity - immunogenicity - vắc xin Institute of Biotechnology, [40] John W.M.C, Brian W J (1983), Structure and function of the influenza virus genome Division of Virology, Department ofPathology, University of Cambridge, Laboratories Block, Addenbrooke's, Hospital, Hills Road, Cambridge CB2 2QQ, UK., 211, pp 281-294 64 [41] Kawaoka Y., (1991), Difference in receptor specificity among influenza A viruses from different species of animals J Vet Med Sci, 53 (2), pp 357-358 [42] Kawaoka Y, Krauss S, Webster RG (1989), Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics J Virol, 63 (11), pp 4603-4608 [43] Luo G, Palese P (1992), Genetic analysis of influenza virus Curr Opin Genet Dev, (1), pp 77-81 [44] McGeoch D., Fellner P., Newton C., (1976), Influenza virus genome consists of eight distinct RNA species Proc Natl Acad Sci U S A, 73 (9), pp 3045-3049 [45] Rabadan R, Levine AJ, Robins H (2006), Comparison of avian and human influenza A viruses reveals a mutational bias on the viral genomes J Virol, 80 (23), pp 11887-11891 [46] Rafal M Pielak, James J Chou (2011), Influenza M2 proton channels Biochimica et biophysica acta, 1808 (2), pp 522-529 [47] Runstadler J A., Happ G M., Slemons R D., Sheng Z M., Gundlach N., Petrula M., Senne D., Nolting J., Evers D L., Modrell A., Huson H., Hills S., Rothe T., Marr T., Taubenberger J K (2007) Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005 Arch Virol 152(10), pp 1901-1910 [48] Scholtissek C, Stech J, Krauss S, Webster RG (2002), Cooperation between the hemagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses J Virol, 76 (4), pp 1781-1786 [49] Sekellick MJ, Carra SA, Bowman A, Hopkins DA, Marcus PI (2000) "Transient resistance of influenza virus to interferon action attributed to random multiple packaging and activity of NS genes J Interferon Cytokine Res, 20 (11), pp 963970 [50] Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000), Immunology of avian influenza virus: a review Dev Comp Immunol, 24 (2-3), pp 269-283 [51] Swayne D.E, Suarez D.L (2000), Highly pathogenic avian influenza Rev Sci Tech, 19 (2), pp 463-482 [52] Swayne DE, Suarez DL (2000), Highly pathogenic avian influenza 19, pp 463482 [53] Trifonov V, Racaniello V, Rabadan R (2009) The Contribution of the PB1-F2 Protein to the Fitness of Influenza A Viruses and its Recent Evolution in the 2009 Influenza A (H1N1) Pandemic Virus [54] Very M, Orlich M, Adler S, Klenk HD, Rott R, Garten W (1992), Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R Virology, 188 (1), pp 408-413 65 [55] Wagner R, Matrosovich M, Klenk HD (2002), Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Rev Med Virol, 12 (3), pp 159-166 [56] Webster RG (1998), Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis, (3), pp 436-441 [57] Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY, Rayner JM, Smith GJ, Webster RG, Peiris JS, Lin T, Xia N, Guan Y, Chen H (2008), Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007 J Virol., 82 (4), pp 1798-1807 WEB PAGE [58] http://www.fao.org/Avian influenza, http://www.fao.org/avianflu/en/qanda.html, [59] https://www.britannica.com/science/myxovirus (April 03, 2009) Myxovirus, Encyclopædia Britannica, inc, https://www.britannica.com/science/myxovirus, 66 PHỤ LỤC PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN DỊCH CÚM GIA CẦM THÔNG TIN CHUNG SĐT: Họ tên chủ hộ chăn nuôi Huyện Địa Xã Thôn SĐT: Họ tên người điều tra Đơn vị công tác X: Tọa độ GPS Y: Số lượng loại gia cầm có gia đình Số lượng Loại gà Số lượng Loại vịt/ngan Gà Vịt /ngan Gà nuôi thịt Vịt/ngan nuôi thịt Gà sinh sản Vịt/ngan sinh sản Phương thức chăn nuôi Chăn nuôi nhỏ lẻ, thả vườn  Ngan, vịt thả đồng  Chăn nuôi bán công nghiệp  Ngan, vịt nuôi nhốt  Chăn nuôi công nghiệp  Chăn nuôi chung với lợn, chó Có  Khơng  Thức ăn chăn ni Có  Khơng  Thức ăn cơng nghiệp  Thức ăn tự chế  Thức ăn bán công nghiệp  Gia cầm tự kiếm ăn  Bổ sung kháng sinh vào thức ăn, nước uống KOLERIDIN  ENROVE  COLIQUIN  TYLANVET  DOXICIP  AMPICOL  GENTADOX  Nguồn nước uống Nước máy  Nước giếng  Nước ao, hồ Sông suối  Nước mưa  Nguồn giống Tự sản xuất  Mua nơi khác khơng nguồn gốc  Mua nơi khác có nguồn gốc  67 Địa điểm chăn nuôi A Gần khu dân cư B Gần đường quốc lộ C Gần chợ buôn bán gia cầm sống D Gần địa điểm giết mổ E Gần ao, hồ, kênh, mương F Gần trang trại hàng xóm 10m- 50m  10m- 50m  10m- 50m  10m- 50m  10m- 50m  10m- 50m  500m  500m  500m  500m  500m  500m  1km  1km  1km  1km  1km  1km  >1km  >1km  >1km  >1km  >1km  >1km  Vệ sinh chuồng trại Hàng ngày  2-3 lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  Hàng tuần  Hàng tháng  Vệ sinh dụng cụ, máng ăn uống cho gia cầm Hàng ngày  2-3 lần/tuần  10 Khử trùng, tiêu độc lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  Ba 3tháng/lần  Sáu tháng/lần  11 Xử lý chất thải chăn nuôi  Ủ Bio gas Sử dụng chế phẩm SH  Xử lý chất hóa học   Xả thẳng môi trường 12 Gia cầm chăn ni thường xun tiếp xúc với chim trời Có  Khơng  Nói rõ lồi chim trời:…………………… 13 Người, xe cộ vào trang trại có khử trùng khơng? Có  Khơng  14 Ni nhốt chung nhiều lứa tuổi gà chuồng ni Có  Khơng  15 Giết mổ gia cầm khu vực chăn ni Có  Khơng  16 Trước nhập đàn có để trống chuồng ni 14 ngày Có  Khơng  17 Khu vực chứa thức ăn cho gia cầm mối, chuột, bọ dễ dàng xâm nhập Có  Khơng  18 Sử dụng đệm lót ẩm ướt Có  Khơng  19 Các loại vắc xin tiêm Có  Khơng  Tên bệnh Nhược Vơ độc hoạt Tên bệnh Nhược Vô độc hoạt Tên bệnh Cúm gia cầm Tụ huyết trùng Gumboro Newcastle Hội chứng giảm đẻ Đậu gà Marek Phù đầu gà Nhược Vô độc hoạt 68 Thời điểm tiêm phòng Cúm gia cầm Trước có dịch  Trong có dịch  21.Tỷ lệ tiêm phòng Cúm gia cầm A 100%  B 75% C 50%  20 22 Năm có dịch 2011  2012  2010  Sau có dịch  D Không tiêm  2013  2014  2015  23 Tháng có dịch 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24 Thời tiết có dịch Nóng  Lạnh  Ẩm  Nóng ẩm  Mưa  25.Trước có dịch có người lạ vào thăm chuồng trại khơng? Có  Khơng  Khơng biết  26 Xử lý gia cầm có dịch Khai báo với quyền  Bán  Chữa trị  27 Tiêm phịng số gia cầm chưa có triệu chứng? 28 Lấy mẫu giám sát Mổ thịt  Có  Có  Khơ  Vứt bỏ  Chơn, đốt  Không  Không  29 Tổng số gia cầm có dịch Năm Tổng số gia cầm có Tổng số gia cầm ốm, chết Tổng số gia cầm bị tiêu dịch (gà, vịt, ngan, ngỗng) (gà, vịt, ngan, ngỗng) hủy (gà, vịt, ngan, ngỗng) 2013 2014 2015 2016 2017 Hướng chuồng: Đ  N  T  B  ĐN  ĐB  TN  TB  30 Loại chủ đạo khu vực chăn nuôi: (Nêu loại nhiều theo thứ tự giảm dần theo) Cây lấy gỗ Cây ăn Cây lương thực Cây hoa màu Cây thực phẩm Ý kiến khác:……………………………… NGƯỜI PHỎNG VẤN HỘ NÔNG DÂN XÁC NHẬN CỦA ĐỊA PHƯƠNG 69 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN Tách chiết mẫu Máy Realtime PCR smartcycler 70 Thực đọc kết real time RT- PCR máy Mẫu vận chuyển thùng đá Mẫu xét nghiệm 71 Máy Realtime PCR smart cycle Đọc kết HI ... 3.2 Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn 49 3.2.1 Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm huyện Quảng Trạch 50 3.2.2 Giám sát lưu hành virus cúm gia cầm thị xã Ba. .. riêng, tiến hành thực đề tài: ? ?Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn tỉnh Quảng Bình? ?? Đối tượng nghiên cứu bao gồm gà,... type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Quảng Trạch thị xã Ba Đồn tỉnh Quảng Bình? ?? 2 Mục tiêu Phát xâm nhập, lưu hành đặc điểm sinh học phân tử chủng virus cúm