Nghiên cứu khả năng tái sinh cây mướp đắng momordica charantia l từ callus bao phấn

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TẠ TRẦN HỒNG THẢO NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) TỪ CALLUS BAO PHẤN Đà Nẵng – Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TẠ TRẦN HỒNG THẢO NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) TỪ CALLUS BAO PHẤN CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN MINH LÝ Đà Nẵng – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Mọi số liệu, hình ảnh, kết hồn tồn lấy từ thí nghiệm sau thực Các tài liệu có tìm sách, báo, tạp chí… nước giới đáng tin cậy xác Tác giả Tạ Trần Hồng Thảo i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn BGH trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, khoa Sinh – Môi trường, thầy cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học truyền dạy cho nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài Khố luận, cũng năm học đại học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Minh Lý người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho suốt q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 15CNSH, 16CNSH hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tất bạn bè ln động viên, khích lệ tơi về vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Ý NGHĨA NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về mướp đắng………………………………………… 1.1 Đặc điểm sinh học .3 1.2 Phân bố điều kiện sinh thái 1.3 Thành phần dinh dưỡng dược liệu .4 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro……………………………… 2.1.Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 2.2.Cơ sở khoa học 2.3.Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro tạo đơn bội 2.4.Tình hình nghiên cứu tạo đơn bội 10 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 17 3.1 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển hạt phấn đến khả phát sinh callus từ bao phấn 17 3.2 Ảnh hưởng môi trường nền đến khả phát sinh callus từ bao phấn 19 3.3 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh callus từ bao phấn 20 3.4 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả phát sinh callus từ bao phấn 21 iii 3.5 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến phát sinh chồi từ callus 23 3.6 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến tái sinh rễ từ callus 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 Kết luận 30 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : dichlorophenoxyacetic acid TDZ : thidiazuron NAA : α-naphthalen acetic acid BAP : - benzyl amino purine IBA : indole - butyric acid Kin : kinetin B5 : Gamborg (1968) MS : Murashige Skoog (1962) cs : cộng g/l : gam/lit v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Kích thước nụ hoa đến phát sinh callus từ bao phấn 19 Bảng Sự ảnh hưởng môi trường nền đến phát sinh callus từ bao phấn 20 Bảng 3 Sự ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến phát sinh callus từ bao phấn 21 Bảng Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát sinh callus 22 Bảng Sự ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến tái sinh chồi từ callus 23 Bảng Sự ảnh hưởng BAP kết hợp TDZ đến phát sinh chồi từ callus 24 Bảng Sự ảnh hưởng TDZ kết hợp 2,4D đến phát sinh chồi từ callus 24 Bảng Sự ảnh hưởng TDZ kết hợp NAA đến phát sinh chồi từ callus 25 Bảng Sự ảnh hưởng KIN đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn 26 Bảng 10 Sự ảnh hưởng TDZ đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn 27 Bảng 11 Sự ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn 27 Bảng 12 Sự ảnh hưởng IBA đến khả phát sinh rễ từ callus bao phấn 28 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Các giai đoạn phát triển tiểu bào tử nụ hoa mướp đắng 17 Hình Tỷ lệ phần trăm tiểu bào tử nụ hoa mướp đắng 17 Hình 3 Callus phát sinh từ hai môi trường nền 20 Hình Callus phát sinh từ bao phấn điều kiện chiếu sáng khác 22 Hình Rễ hình thành mơi trường MS bổ sung 3mg/l IBA 28 vii MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) loại dây leo [20] Mướp đắng có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc trồng rộng rãi vùng nhiệt đới khắp giới Philippin, Malaysia, Australia, nước Châu Phi, Tây Á Mỹ La Tinh [17, 3] Mướp đắng vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu cao Mướp đắng giàu chất sắt, carbonhydrate, protein, vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, carotene [38] Tại Việt Nam, loại trồng phổ biến tỉnh đồng trung du mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân Theo Nguyễn Quốc Hùng cs tổng diện tích trồng mướp đắng nước ta vào năm 2013 27.000 với suất trung bình 16 tấn/ha [11] Hiện nay, nguồn giống sử dụng phổ biến đa số giống địa phương có khả thích nghi tốt người nông dân lưu lại sử dụng cho nhiều mùa nên có tỉ lệ thối hóa cao Ngồi ra, giống lai F1 nhập từ nước ngồi có độ đồng đều cao hơn, giá thành tương đối cao, thường xun bị thối hóa Vì việc tạo giống nước phù hợp với điều kiện sinh thái để mang lại suất cao trở nên cần thiết Trong công tác tạo giống, việc tạo dòng Phương pháp tạo dòng truyền thống thường tốn nhiều thời gian kinh phí, đồng thời kéo dài thời gian cho công tác chọn giống, nhiều trường hợp khơng cho dịng đồng hợp tử Vì vậy, áp dụng kỹ thuật ni cấy in vitro bao phấn khắc phục nhược điểm phương pháp chọn tạo giống truyền thống Cây đơn bội kép tạo từ ni cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly hệ tạo thời gian ngắn, tiết kiệm nhiều kinh phí rút ngắn thời gian cho công tác chọn giống [28] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu, ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo đơn bội in vitro thu số thành công định Tuy nhiên, công tác tập trung chủ yếu số lương thực lúa ngô Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro bao phấn mướp đắng hạn chế, Nguyễn Minh Lý cs (2017) bao phấn mướp đắng ni mơi trường MS có bổ sung 30g/l đường saccharose, 8g/l agar; 2mg/l 2,4D 2mg/l KIN với pH = 5,75 cho tỷ lệ phát sinh giúp kiểm sốt q trình tái sinh callus tạo nguồn callus đạt chất lượng cho thí nghiệm Tiến hành khảo sát môi trường 1,0mg/l 2,4D + 1,5 mg/l BAP bổ sung 30g đường saccharose 8g/l agar, pH 5,7-5,8 nồng độ than hoạt tính 0,1g/l; 0,2g/l; 0,3g/l Bảng 3 Sự ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến phát sinh callus từ bao phấn Nồng độ AC (g/l) Thời gian Tỷ lệ phát sinh callus (%) phát sinh Hình thái callus callus(ngày) Kết khối lớn, chặt cứng, 93,75±2,55a 0,1 71,15±3,68b Nhỏ gọn, chặt cứng, màu vàng nhạt 0,2 68,60±3,69b Nhỏ gọn, chặt cứng, màu vàng nhạt 0,3 65,07±2,13b Nhỏ vừa, chặt cứng, màu vàng nhạt màu xanh vàng Qua bảng 3.3 thấy bổ sung than hoạt tính vào thí nghiệm có khả phát sinh callus nồng độ, nồng độ than 0,1g/l cho phát sinh callus cao với 71,15±3,68%, giảm dần phát sinh callus tăng nồng độ than hoạt tính nồng độ 0,2g/l callus phát sinh với tỷ lệ 68,60±3,69%, 65,07±2,13% phát sinh callus với nồng độ 0,3g/l từ kết cho thấy được, sử dụng than hoạt tính để ni cấy khơng cho phát sinh callus tốt Khơng bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ phát sinh callus cao với 93,75±2,55% cho kích thước callus to Như kết luận, tế bào callus mướp đắng phát sinh từ bao phấn việc sử dụng than hoạt tính khơng có tác dụng tạo nguồn callus chất lượng 3.4 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả phát sinh callus từ bao phấn Trong điều kiện môi trường nuôi cấy khác tỉ lệ phát sinh callus bao phấn khác [39] Đối với phần lớn loại trồng việc nuối cấy điền kiện tối nhiệt độ thời gian khác nhằm kích thích tăng cường phát sinh callus 21 Bảng Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát sinh callus Chất kích thích sinh trưởng Tỷ lệ phát Thời (mg/l) sinh callus gian (%) (ngày) Môi trường BAP 2,4D KIN NAA Hình thái callus Ni điều kiện chiếu sáng 2000lux 16 giờ/ngày M1 1,5 1,0 - - 93,75±2,55a M2 0,5 - 1,0 1,5 82,81±2,99b 10 Màu xanh vàng, kết khối dày Màu xanh vàng, kết khối dày Ni điều kiện tối hồn tồn M1 1,5 1,0 - - 90,23±2,04a 13 M2 0,5 - 1,0 1,5 80,62±2,59b 15 A Màu vàng nhạt, kết khối vừa Màu vàng nhạt, kết khối vừa C B D C Hình Callus phát sinh từ bao phấn điều kiện chiếu sáng khác (A) Callus môi trường M1 nuôi ánh sáng 2000lux; (B) Callus môi trường M2 nuôi ánh sáng 2000lux; (C) Callus mơi trường M1 ni tối hồn tồn; (D) Callus mơi trường M2 ni tối hồn tồn Qua bảng 3.4 cho thấy nuôi cấy bao phấn môi trường MS có 30g/l đường saccharose, 8g/l agar pH 5,7-5,8 bổ sung 1,5mg/l BAP; 1,0mg/l 2,4D điều kiện chiếu sáng 2000lux 16 giờ/ngày cho phát sinh callus 93,75±2,55 kết cao so với kết tốt (80,55%) Tang Y cs nghiên cứu [37] Khi nuôi cấy môi trường mà đặt điều kiện tối hồn tồn tỷ lệ phát sinh callus 90,23±2,04, hình thái callus ni điều kiện sáng tươi xanh mềm callus hình thành điều kiện tối Callus phát sinh ni điều kiện tối 22 hồn tồn có màu ngả vàng cho thấy phát triển chậm có khả nâu hóa sớm (nâu hóa bắt đầu sau tuần ni) Qua cho thấy việc ni cấy bao phấn điều kiện chiếu sáng 2000lux 16 giờ/ngày cho hình thái bao phấn chất lượng ni tối hồn tồn Trên dưa chuột, điều kiện nuôi cấy tối nhiệt độ 25±1℃ 32±1℃ kích thích tăng tỷ lệ phát sinh callus [46] Tuy nhiên thí nghiệm này, ni tối cho phát sinh callus từ bao phấn, chất lượng callus khơng tốt Vì ni cấy bao phấn điều kiện chiếu sáng 2000lux 16 điều kiện nuôi cấy phù hợp 3.5 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến phát sinh chồi từ callus Callus sau tuần nuôi cấy chuyển tiếp qua môi trường chọn lọc để khảo sát phát sinh chồi Tất môi trường sử dụng đều môi trường MS chứa 30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung chất kích thích sinh trưởng khác tùy vào thí nghiệm a Thí nghiệm tổ hợp chất kích thích sinh trưởng đến tái sinh chồi từ callus Bảng Sự ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến tái sinh chồi từ callus Tỷ lệ phát Số Thời gian sinh chồi chồi/bình phát sinh (%) (%) chồi (tuần) 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 0.5 - - - - 10 0.5 - - - - BAP NAA (mg/l) (mg/l) Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi 23 Hình thái chồi Qua kết bảng 4.1 cho thấy việc sử dụng BAP kết hợp với NAA không cho kết tạo chồi từ callus mướp đắng Nghiên cứu Dhar cs (2000), vi nhân giống cấy Pittosporum napaulensis – thuốc quý Himalaya cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo chồi tốt đạt 83,1% môi trường MS bổ sung 5,0µM BAP 0,1µM NAA [53] Năm 2011, Yadav cs vi nhân giống Alibizia lebbeck (L.), chồi phát triển tốt môi trường MS có bổ sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,5mg/l [57] Kết nghiên cứu lại cho thấy khả tạo chồi in vitro mướp đắng khơng có ni cấy mơi trường MS có bổ sung BA NAA Bảng Sự ảnh hưởng BAP kết hợp TDZ đến phát sinh chồi từ callus TDZ BAP (mg/l) (mg/l) Tỷ lệ phát Số sinh chồi chồi/bình (%) (%) Thời gian phát sinh chồi Hình thái chồi (tuần) 0.03 - - - - 0.05 - - - - 0.1 - - - - 0.5 - - - - 1 - - - - Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Qua bảng 3.6 cho thấy nuôi callus trưởng thành môi trường MS bổ sung TDZ kết hợp BAP nồng độ đều không cho kết phát sinh chồi từ callus bao phấn Theo nghiên cứu Saima Malik cộng thực thí nghiệm tái tạo callus từ lá, đoạn thân mầm Các callus tạo thành chuyển qua mơi trường ni cấy có bổ sung BAP/TDZ với nồng độ tương ứng 1,0/0,1 mg/L cho kết tạo chồi tốt 1,25 chồi chiều dài chồi đạt 1,3 cm Nhưng nghiên cứu sử dụng nguồn callus tái sinh từ bao phấn Điều giải thích nghiên cứu Zagorska cs (1998) kết luận kiểu gen có ảnh hưởng đến trình tái sinh từ callus cà chua [58] 24 Bảng Sự ảnh hưởng TDZ kết hợp 2,4D đến phát sinh chồi từ callus Thời gian Tỷ lệ phát Số phát sinh TDZ 2,4D sinh chồi chồi/bình Hình thái chồi chồi (mg/l) (mg/l) (%) (%) (tuần) 1,5 1,5 - - - - 1,5 1,5 - - - - 1,5 1,5 - - - - Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Theo Muthu T cs (2012) nghiên cứu đối tượng mướp đắng nuôi callus môi trường MS vùng với tổ hợp TDZ 2,4D nồng độ 4mg/l TDZ, 1,5mg/l 2,4D cho phát sinh chồi cao 76,5% [31] Qua bảng ra, nồng độ lại không cho tái sinh chồi từ callus, nguyên nhân sai khác kiểu gen giống mướp đắng sử dụng nên không cho kết mong muốn Bảng Sự ảnh hưởng TDZ kết hợp NAA đến phát sinh chồi từ callus TDZ (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số chồi/bình (%) Thời gian phát sinh chồi (tuần) 0,5 - - - - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - - - - Hình thái chồi Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Qua bảng 3.8 cho thấy sử dụng TDZ kết hợp với NAA đều không cho phát sinh chồi Không kết với nghiên cứu Thiruvengadam M cs (2012) nuôi cấy callus mướp đắng ni mơi trường MS bổ sung 25 3,0µM TDZ + 1,0µM NAA lại cho tái sinh chồi cao 70,5% [48] Sự sai khác chủ yếu kiểu gen quan sử dụng ni cấy b Thí nghiệm chất kích thích sinh trưởng đơn lẻ đến tái sinh chồi từ callus Tất môi trường sử dụng đều môi trường MS chứa 30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung chất kích thích sinh trưởng khác tùy vào thí nghiệm KIN có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế già hóa tế bào Các nghiên cứu nhiều loại thực vật khác cho thấy hiệu tích cực phát sinh chồi in vtro Trong nghiên cứu callus in vitro chuyển sang môi trường MS chứa KIN nồng độ 0,52,0mg/l Đánh giá ảnh hưởng Kin đến khả phát sinh chồi in vitro từ callus bao phấn Bảng Sự ảnh hưởng KIN đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn KIN (mg/l) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số chồi/bình (%) Thời gian phát sinh Hình thái chồi chồi (tuần) 0.5 - - - - - - 1.5 - - - - - - - Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Qua bảng 4.3 cho thấy nuôi cấy callus trưởng thành môi trường MS bổ sung 0.5-2mg/l KIN đều không cho thấy phát sinh chồi Thidiazuron (TDZ) chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng mô phân sinh làm hạn chế già hố tế bào Trong ni cấy in vitro bao phấn, TDZ có vai trị đặc biệt quan trọng việc kích thích phát sinh chồi từ nuôi cấy invitro callus Theo nghiên cứu Juhasz cscho thấy tỷ lệ callus tái sinh thành tăng nhanh bổ sung TDZ vào môi trường nuôi cấy [45], nghiên cứu Suprunova 50 Shmykova cũng khẳng định số chất điều tiết sinh trưởng 26 nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) tốt cho sự tái sinh chồi với nồng độ tối ưu mg/l [34] Bảng 10 Sự ảnh hưởng TDZ đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn TDZ (mg/l) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số chồi/bình (%) Thời gian phát sinh Hình thái chồi chồi (tuần) 0.5 - - - - - - - 1.5 - - - - - - - - Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Nghiên cứu Shevade cs (1993) TDZ nóm cytokinin chiếm ưu khích thích quan phát sinh chồi nuôi cấy nụ hoa Rhododendron PJM [50] Theo Perveen cs (2013) vi nhân giống Albizia lebbeck mơi trường MS bổ sung 5,0µM TDZ cho khả tái sinh chồi cao 76% [49] Từ kết nghiên cứu lại cho thấy khả tạo chồi in vitro mướp đắng khơng có ni cấy mơi trường MS có bổ sung TDZ BAP (6 - Benzylaminopurin) chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng mô phân sinh làm hạn chế già hoá tế bào Trong tái sinh từ callus nhân giống in vitro, BAP có vai trị đặc biệt quan trọng việc kích thích hình thành chồi non, định hệ số nhân chất lượng chồi [14] Bảng 11 Sự ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn BAP (mg/l) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số chồi/bình (%) Thời gian phát sinh chồi (tuần) 0.5 - - - - - - 1.5 - - - - - - Hình thái chồi - Chú thích: Dấu “–“: khơng có tượng phát sinh chồi Một số nghiên cứu cho thấy, thử nghiệm nhân chồi in vitro mơi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng khác mơi trường có bổ sung BAP tốt 27 nhất, chẳng hạn, nghiên cứu Raghu cs (2007) cải thiện vi nhân giống thuốc Aegle marmelos L thông qua đường phát sinh protocol, chồi hình thành mạnh môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP đạt 6,2 chồi/mẫu sau 45 ngày nuôi cấy số lượng chồi in vitro cũng tăng nhanh sau lần cấy chuyển đạt 16,3 chồi/mẫu [52]; nghiên cứu Sujana cs (2011) về nuôi cấy in vitro bạc hà từ mô xác định môi trường tốt cho nhân chồi mơi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP [51] Từ kết nghiên cứu lại cho thấy khơng có phát sinh chồi từ callus mướp đắng bổ sung BAP 3.6 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến tái sinh rễ từ callus IBA thuộc nhóm auxin có tác dụng kéo dài tế bào, điều khiển hình thành rễ [7] Vì thí nghiệm sử dụng mơi trường MS có 30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung IBA nồng độ 1-3mg/l Theo dõi qua ba tuần nuôi cấy kiểm tra, số liệu bảng Bảng 12 Sự ảnh hưởng IBA đến khả phát sinh rễ từ callus bao phấn Thời gian phát sinh IBA Tỷ lệ phát (mg/l) sinh rễ (%) 1,5 - - - 2,5 - - 90 10 Rễ bất định, trắng có lơng tơ Hình thái rễ rễ (ngày) A B Hình Rễ hình thành mơi trường MS bổ sung 3mg/l IBA (A) Sau 10 ngày nuôi; (B) Sau 20 ngày ni 28 Kết thí nghiệm cho thấy, nồng độ mg/l IBA từ callus ban đầu tái sinh thành rễ với tỉ lệ 90% Kết phù hợp với nghiên cứu Mala Agarwal cs (2004) khảo sát riêng lẻ nồng độ IAA, IBA, NAA từ 0,5 đến mg/l cho kết tốt cũng nồng độ mg/l IBA [47] 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tỉ lệ phát sinh callus thu nuôi cấy nụ hoa chứa tiểu bào tử giai đoạn đơn nhân sớm đơn nhân môi trường MS có 30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung 1mg/l 2,4D; 1,5mg/l BAP; Bổ sung than hoạt tính ni cấy bao phấn điều kiện tối hạn chế hình thành phát triển callus, đẩy nhanh q trình nâu hóa callus; Chưa quan sát thấy tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng bổ sung chất kích thích sinh trưởng 2,4-D, NAA, TDZ, BAP, KIN vào môi trường nuôi cấy; Bổ sung IBA nồng độ 3,0mg/l vào môi trường MS có 30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 kích thích phát sinh rễ từ callus bao phấn mướp đắng Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng thu Tiếp tục nghiên cứu, xác định hàm lượng chất nội sinh mướp đắng ảnh hưởng tới việc phát sinh chồi từ callus 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Dương Tấn Nhựt, 2011 Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp [2] Đặng Thị Mai (2009), Nghiên cứu kỹ thuật tạo dưa chuột đơn bội từ nuôi cấy in vitro bao phấn, Luận án Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội [3] Đỗ Huy Ích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập (2003), Viện Dược Liệu, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nhà xuất Khoa Học Kĩ Thuật, trang 335 [4] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội [5] Lê Thị Như Nguyệt (2009), Góp phần khảo sát thành phần hóa học trái mướp đắng, Đại học Lạc Hồng [6] Lê Thị Tình (2008), Nghiên cứu đặc tính nơng sinh học số mẫu giống mướp đắng (Momordica charantia L.) điều kiện trồng Gia Lâm-Hà Nội, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội [7] Lê Văn Hồng (2007), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật [8] Nguyễn Bảo Tồn (2005), Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, Đại học Cần Thơ [9] Nguyễn Như Khanh (2002), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội [10] Nguyễn Minh Lý, Võ Châu Tuấn, Nguyễn Thị Như Thảo (2017), Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng in vitro, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, tr 67-72 [11] Nguyễn Quốc Hùng cs (2013), Nghiên cứu đánh giá lựa chọn dòng/giống mướp đắng phù hợp với điều kiện nhiệt đới nhằm cải thiện sản lượng chuỗi giá trị rau vùng Đông Nam Á, Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ 2, 546-551 31 [12] Nguyễn Thanh Hải, Đặng Thị Thanh Tâm (2015), Tạo cải đông dư (brassica juncea) đơn bội in vitro ni cấy bao phấn, Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 5: 739-746 [13] Nguyễn Xuân Trường, Ye-Su Song, Sung-Min Park (2015), Sự tạo vơ tính thơng qua ni cấy bao phấn dâu tây phản ứng trung tính với ánh sáng, Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 2: 279-290 [14] Nguyễn Văn Uyển (1984), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống trồng, NXB TP Hồ Chí Minh, 28 -57 [15] Phạm Thị Hồi (2013), Khảo sát thành phần hóa học cao chloroform mướp đắng Momordica Charantia L., BGD ĐT Trường Đại Học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh khoa Hóa Học [16] Phan Hữu Tơn (2004), Công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp – Hà Nội [17] Tạ Duy Châu (1999), Những phương thuốc hay chữa bệnh hoa, NXB Nghệ An [18] Thi Xuân Mi (2002), Thảo dược chữa bệnh, NXB Thanh Hóa [19] Trần Khắc Thi Phạm Mỹ Linh (2007), Rau an tồn, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội [20] Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học [3] Vũ Văn Chuyên (1971), Thực vật học, tập 2, NXB Y học [21] Vũ Văn Chuyên (1971), Thực vật học, tập 2, NXB Y học [22] Vũ Văn Liết Nguyễn Văn Hoan (2007), Sản xuất giống công nghệ sản xuất hạt giống, Hà Nội [23] Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2006), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục TIẾNG ANH [24] Ashok Kumar H.G., Murthy H.N., Paek K.Y (2003), Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L., Scientia Horticulturae, Volume 98, Issue 3, Pages 213-222 [25] AVRDC (1998), Chinese Bitter Gourd Adaptation Trial, ARC Training report, Xue Dayu, China 32 [26] Blackmore S., Wortley A.H., Skvarla J.J., Rowley J.R (2017), Pollen wall development in flowering plants New Phytol, 174(3): 483-498 [27] Chu Chih-Ching, Wang Ching-Chu, Sun Ching-San, Hsu Chen, Yin KwangChu, Chu Chih-Yin, Bi Feng-Yun (1975), Establishment of an efficiaent medium for anther culture of rice through comparative experiment on the nitrogen sources, Scientia Sinica, Volume 18, Issue 5: 659-668(1975) [28] Chung G.S (1988), Anther culture cell and Tissue Culture in Field Crop Improvement, tr 94-107 [29] Hui Song, Qun-Feng Lou, Xiang-Dong Luo, Joseph N Wolukau, WeiPing Diao, Chun-Tao Qian and Jin-Feng Chen (2007), Regeneration of doubled haploid plants by androgenesis of cucumber (Cucumis sativus L.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 90: p 245-254 [30] Morrison R A D.A Evan (1988), Haploid plants from tissue culture, New plant varieties in shortened time frame, Bio Technology [31] Muthu Thiruvengadam, Nagella Praveen and Ill-Min Chung (2012), In vitro regeneration from internodal explants of bitter melon (Momordica charantia L.) via indirect organogenesis, African Journal of Biotechnology Vol 11(33), pp 8218-8224 [32] Sanda M.Reed, Robert A.Smith, Norbert F.Belzer (2002), Production of haploid tobacco plant using anther culture, The American Biology Teacher: 443-448 [33] Snape, J W (1989), Double haploid breeding, Int Symp Genetic Manipulation in Crops, Mexico and Manila, tr 19-30 [34] Suprunova T., N Shmykova 2008, In vitro induction of haploid plants in unpollinated ovules, anther and microspore culture of Cucumis sativus Pitrat M (ed): Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae, Avignon (France), May 21-24th, 2008, pp 371-374 [35] Tang.K, X.Sun, Y.He Z.Zhang (1998), The effect of abscisic acid on plant regeneration, Plant Cell Rep [36] Tang Y., Li H., Liu J., Liu B., Lio H.P (2009), Callus formation from anther culture in Balsam Pear (Momordica charantia L.) American-Eurasian J Agric & Environ Sci, 6(3): 308-312 33 [37] Tang Y., Liu J., Liu B., Li J., Li X.M., Li H.X (2010), Effect of different treatment on anther callus formation and browning in Balsam pear (Momordica charantia L.) J Agric Sci Technol., 4(6): 53-56 [38] Tusar K., Snigdha Behera, L.K Bharathi (2010), Bitter Gourd: Botany, Horticulture, Breeding, Horticultural Revie [39] Usman M., K Bakhsh, B Fatima, Q Zaman, M H Shah (2015), Exploring embryogenic competence in anthers of bitter gourd (Momordica charantia L.) Cultivar faisalabad long, The Journal of Animal & Plant Sciences [40] Vasil I.K Vasil V (1986), Regeneration in cereal and other grass species, Cell cult Somatic Cell Genet Plant 3, tr 121-150 [41] Ying.C (1983), Anther and pollen culture of rice in China, Cell and tisue culture techniqus for Cereal Crop Improvement, Sicence Prré, Bejjing, China [42] Xue G.R., W.Y Yu K.W Fei (1989), Watermelon plants derived by invitro anther culture Pomplogy Pesearch Institute, Chinese Academy of Agricultura Science, Xing Cheng, Lianong, PRC [43] Wang C.C., Sun S.C.và Z.Chu (1974), On the conditions of rice pollen plantlets and certain factors affecting the frequency of induction, Acta Bot Sin 16, tr 43-53 [44] Zapata.J.F cộng sự., Cell and Tissue Culture Techniques for Cereal Crop Improvement, Science press, Bejing, China [45] Zagorska N.A., Shteera A., Dimitrov B.D., 1998 Induced androgenesis in tomato [46] Moqbeli E cộng 2013, In vitro cucumber haploid line generation in several new cultivars, AsPac J Mol Biol Biotechnol., tr 18-25 [47] Mala Agarwal, Raka Kamal, 2004, In vitro clonal propagation of Momordica charantia L Indian Journal Biotechnology, Vol pp 426-430 [49] Muthu Thiruvengadam, Min Chung Se Chul Chun, 2012, Influence of polyamines on in vitro organogenesis in bitter melon (Momordica charantia L.), Journal of Medicinal Plants Research Vol 6(19), pp 3579-3585 [49] Perveen S., Anis M., Aref M (2013), Resource communication In vitro plant regeneration of Albizia lebbeck (L.) from seed explants, Forest Systems 22(2), 241-248 34 [50] Shevade A., John E.(1993), Preece In vitro shoot and floral organogenesis from stamen explants from a Rhododendron PJM group clone, Scientia Horticulturae, 56 163-170 [51] Sujana P, Naidu CV, 2011, Indirect plant regeneration from leaf explants of Mentha piperita L.-An important multipurpose medicial plant, Journal of Phytology, 3(5) [52] Raghu AV, Geetha SP, Geralt Martin, Balanchandran, Indira, 2007, Animproved micropropagation protocol for Bael – A vulnerable medicinal tree, Reseach Journal off Botany, 2(4), pp 186 [53] Uppeandra Dhar, Jyoti Upreti & Indra D Bhatt, 2000, Micropropagation of Pittosporum napaulensis (DC.) Rehder & Wilson – a rare, endemic Himalayan medicinal tree, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 231–235 [54] Pan M J and Staden V J., 1998 The use of charcoal in in vitro culture: review J Plant Grow Reg., 26: 155-163 [55] Takayama S and Misawa M., 1980 Differentiation in Lilium bulbscales in vitro Effect of activated charcoal, physiological age of bulbs and sucrose concentration on differentiation and scale leaf formation in vitro Physiol Plant, 48: 121-125 [56] Wann S R., Veazey R L and Kaphammer J., 1997 Activated charcoal does not catalyze sucrose hydrolysis in tissue culture media during autoclaving Plant Cell Tiss Org Cult., 50: 221-224 [57] Yadav, Kuldeep, Singh, Narender 2011, Germination and in vitro propagation of Albizia lebbeck (L.) benth, Analele Universitatii din Oradea, Fasscicula Biologie, 18, pp 151-156 [58] Zagorska, N.A., Shtereva, A., Dimitrov, B.D and Kruleva, M.M 1998 Induced andro-genesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) - I Influence of genotype on androgenetic ability Plant Cell Reports 17, 968-973 [59] Ziv M and Gadasi G., 1986 Enhanced embryogenesis and plant regeneration from cucumber (Cucumis sativus L.) callus by activated charcoal in solid/liquid double layer cultures Plant Sci., 47: 115-122 35 ... tài: ? ?Nghiên cứu khả tái sinh mướp đắng (Momordica charantia L. ) từ callus bao phấn? ?? MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nội sinh, ngoại sinh đến khả tái sinh mướp đắng từ callus bao phấn. .. thích phát sinh rễ từ callus bao phấn mướp đắng Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng thu Tiếp tục nghiên cứu, xác định hàm l? ?ợng chất nội sinh mướp đắng ảnh... tái sinh callus 3.3 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh callus từ bao phấn Trong trình tái sinh callus từ bao phấn, hợp chất nội sinh không mong muốn sinh l? ?m ảnh hưởng đến già hóa callus